Kết quả xác định kháng thể kháng đặc hiệu M.tuberculosis đ−ợc phân tích thông qua giá trị mật độ quang học (OD) trung bình của hai giếng đối với một mẫu, so sánh với giá trị ng−ỡng (đ−ợc tính bằng giá trị OD trung bình của quần thể người khoẻ mạnh cộng với tích 2 lần giá trị độ lệch chuẩn). Giá trị ngưỡng của từng bộ sinh phẩm và của từng cộng đồng khác nhau sẽ khác nhau phụ thuộc vào kết quả
đánh giá trên huyết thanh người khoẻ mạnh của cộng đồng nghiên cứu.
Kết quả phản ứng d−ơng tính sẽ là các giá trị bằng hoặc lớn hơn giá trị ng−ỡng;
Kết quả phản ứng âm tính sẽ là giá trị nhỏ hơn giá trị ng−ỡng
Chú ý: Giá trị OD của hai giếng trên cùng một mẫu lệch nhau gấp đôi thì cần xét nghiệm lại mẫu đó.
Câu hỏi l−ợng giá
1. Trình bày tính chất gây bệnh của vi khuẩn lao?
2. Trình bày phương pháp nhuộm soi trực khuẩn lao và các kỹ thuật xác định kháng nguyên của vi khuẩn lao?
140
xét nghiệm chẩn đoán Xoắn khuẩn Leptospira (Treponema pallidum)
Mục tiêu học tập: sau khi học xong bài này, học viên có khả năng:
1. Hiểu đ−ợc cơ chế gây bệnh và tính chất dịch tễ học của xoắn khuẩn leptospira.
2. Nắm đ−ợc quy trình chẩn đoán phòng thí nghiệm đối với Leptospira và chọn lựa kỹ thuật chẩn đoán thích hợp.
1. đại cương
1.1. Hình thể và tính chất bắt màu
Leptospira là xoắn khuẩn mảnh dài, các vòng xoắn sát nhau, có khả năng di
động, kích thước 0,25 x 6-25àm, bắt mầu sáng trên kính hiển vi nền đen.
Soi ở kính hiển vi điện tử leptospira đ−ợc cấu tạo bởi nguyên sinh chất hình trụ có sợi dây trục quấn quanh. Nguyên sinh chất và dây trục đ−ợc bao ngoài bởi một màng rất mỏng, không có vi mao, không có lông, không có màng di động.
1.2. Tính kháng nguyên và tính chất nuôi cấy
Xoắn khuẩn leptospira có chung kháng nguyên thân (lypopolysaccarit), nh−ng các týp leptospira khác nhau bởi kháng nguyên bề mặt (tính chất gây ng−ng kết). Các kháng nguyên sống hoặc đ−ợc xử lý bằng formalin đều gây ng−ng kết với kháng thể kháng leptospira đặc hiệu. Độc tố leptospira bao gồm: hemolysin và lipase.
Leptospira là vi khuẩn −a khí, phát triển tốt trên môi tr−ờng nhân tạo bao gồm 10% huyết thanh thỏ t−ơi hoặc 1% huyết thanh albumine bò-Tween 20 [môi tr−ờng Ellinghasue-McCullough-Jonson-Harris (EMJH)].
Ngoài ra chúng có thể phát triển ở môi tr−ờng giàu chất dinh d−ỡng gồm các vitamin (B2, B12), các chuỗi acid béo và muối ammonium. Chúng sản sinh ra cả catalase và oxidase. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn: 280C-300C, pH: 6,8 - 7,2 thời gian nuôi cấy: 4 tuần hoặc lâu hơn. thông th−ờng 6 - 14 ngày.
1.3. Cơ chế gây bệnh
Tác động của yếu tố gây bệnh (xoắn khuẩn leptospira), và đáp ứng miễn dịch của vật chủ với sự nhiễm trùng đã biểu hiện các mức độ lâm sàng khác nhau (nhẹ đến nặng).
Cơ chế gây độc của vi khuẩn là di động và khả năng v−ợt qua màng nhầy gây tổn thương ở phổi, gan, thận, mắt và não. Hơn nữa, sự liên quan giữa khả năng di động của xoắn khuẩn và tính chất sinh học của protein 12 mathyl-accepting giúp cho sự xâm nhập và bám dính tại tế bào mô của vật chủ. Yếu tố động lực của chủng leptospira là khả năng
141
sản sinh haemoglobin, sphingomyelinase, phospholipase gây phân huỷ máu và làm gia tăng quá trình tổn th−ơng tế bào.
Các tr−ờng hợp nhiễm trùng cấp tính tổn th−ơng gan, thận có sự liên quan giữa số l−ợng xoắn khuẩn xâm nhập và yếu tố độc tế bào sinh ra trong biểu mô.
Trái ng−ợc lại, tr−ờng hợp bị bệnh gây tổn th−ơng xuất huyết tại phổi có số l−ợng xoắn khuẩn tại biểu mô, máu ít hơn và thường do cơ chế gián tiếp qua sự đáp ứng miễn dịch của vật chủ với sự nhiễm trùng.
1.4. Dịch tễ học
Tỷ lệ người nhiễm bệnh ở vùng nhiệt đới cao hơn vùng khí hậu ôn đới. Sự lây truyền của bệnh tương đương ở cả nước đã và đang phát triển. Bệnh gặp chủ yếu ở đối t−ợng có nghề nghiệp liên quan với các yếu tố nguy cơ lây nhiễm nh− nông dân, công nhân, thợ mỏ, ng−ời làm việc trong lò mổ, bác sỹ thú y Tại Mỹ, tỷ lệ này là 100-200 ca mắc bệnh trong một năm, trong đó hầu hết xảy ra tại Hawai. Tương tự, tại Mexico tỷ lệ mắc bệnh từ 0.7/100.000 dân (1999) đến 0.9/100.000 dân (2000). Từ năm 1982-2001, các nghiên cứu tại California cho thấy hầu hết các trường hợp nhiễm bệnh đều xảy ra ở đối tượng nam giới (77%) với lứa tuổi từ 20-40 và 70% nguy cơ nhiễm bệnh là từ nguồn n−ớc.
Châu á được coi là vùng lưu hành của bệnh do leptospira, và nhiễm trùng ở người đã được thông báo rộng khắp trong khu vực. 70% của các týp huyết thanh thuộc nhóm gây bệnh chủ yếu đã đ−ợc tìm thấy ở Châu á. Tại Thái Lan, số ca mắc bệnh ngày càng tăng từ 272 ca với tỷ lệ mắc bệnh 0.3/100.000 dân (năm 1995) đến 14.286 ca với tỷ lệ mắc bệnh 23.2/100.000 dân (năm 2000). Isarael đã công bố tỷ lệ mắc bệnh trong thập niên 60 là 3.6/100.000 dân.
Việt nam, tỉ lệ huyết thanh lưu hành leptospira tại vùng Mekong là 18,8% và 78,6% tại Thanh Hoá
1.5. Ph−ơng thức lây truyền
Leptospira có thể sinh sản ngoài cơ thể vật chủ, nh−ng chỉ sống đ−ợc ở n−ớc với pH từ 7,0 – 8,6 trong vòng 1 tuần lễ. Trong đất ẩm −ớt nó có thể tồn tại ít nhất 14 ngày tuy nhiên cũng phụ thuộc vào pH, độ ẩm, và ánh sáng. Vi khuẩn không tồn tại được trong nước tiểu có độ acid cao, nhưng nếu nước tiểu được pha loãng (rơi vào nước/đất ẩm) thì vi khuẩn sống lâu hơn và khả năng gây bệnh lớn.
Nguy cơ nhiễm bệnh gián tiếp xảy ra khi tiếp xúc với nguồn nước hoặc đất
đã bị nhiễm bẩn. Nguy cơ trực tiếp thường xảy ra ở các bác sĩ thú y, công nhân trong lò mổ, và các đối t−ợng tiếp xúc với gia súc trang trại, động vật hoang dại.
142
Leptospira có thể xâm nhập qua vùng da bị tổn th−ơng, màng nhày (bao gồm hệ thống hô hấp) và màng kết (mắt) hoặc lây theo đ−ờng tiêu hoá.
2. lấy mẫu và bệnh phẩm xét nghiệm 2.1. Bệnh phẩm và cách xử lý bệnh phẩm
• Máu: Tuỳ theo kỹ thuật xét nghiệm
- Cấy máu: lấy máu tĩnh mạch 1-2ml trong thời kỳ bệnh nhân đang sốt Nếu máu không cấy ngay thì pha vào máu dung dịch (dd) chống đông.
9,45 phÇn dd Na2HPO4 1,228% trong n−íc cÊt 0,55 phÇn dd KH2PO4 0,9078% trong n−íc cÊt Hoà thêm vào dd trên 1,4% sodium oxalate
Cứ 10ml máu cho 1 ml chất chống đông
- Làm kỹ thuật huyết thanh học: lấy 1- 2ml máu tĩnh mạch (thời kỳ bệnh nhân
đang sốt), để đông chắt huyết thanh. Cất ở -200C cho đến khi phân tích
• Dịch não tủy: 5 ml ống vô trùng
• N−ớc tiểu: lấy 5 ml vào ống vô trùng
- Nước tiểu để cấy nếu toan quá thì cho bệnh nhân uống tối hôm trước và sáng sớm hôm sau mỗi lần 1 thìa cà phê sodium bicarbonat.
- Đối với súc vật ăn thịt (chó...) thì ngày hôm trước cho ăn chế độ rau để nước tiểu hơi kiềm hay trung tính.
• Phủ tạng của súc vật (gan, thận)
- Khử trùng mặt tế bào bằng cách để vào đó chuôi dao mổ nóng, sau đó dùng pipét Pasteur (vô trùng) đâm xuyên hút những mảnh nhỏ cấy vào môi tr−ờng.
- Cất những mảnh nhỏ phủ tạng lấy vô trùng cấy vào tế bào.