2.1.1. Bệnh than thể da
- Mụn n−ớc: sử dụng tăm bông vô trùng lấy dịch từ trong những mụn n−ớc ch−a vỡ. Lưu ý: trực khuẩn than lấy từ loại bệnh phẩm này có thể quan sát được sau khi nhuém Gram.
- Mụn vảy: khẽ nâng vảy lên và cho tăm bông vô trùng quay 2-3 vòng chậm mà không làm bong vảy.
2.1.2. Bệnh than thể dạ dày - ruột:
- Cấy máu: Lấy máu đúng số l−ợng và số lần theo quy trình cấy máu. Trong giai
đoạn muộn của bệnh (2-8 ngày sau khi bắt đầu phát bệnh), cấy máu có thể mọc vi khuẩn đặc biệt là trước khi bệnh nhân được dùng kháng sinh.
- Phân: lấy > 5g phân cho vào vật đựng vô trùng, khô, rộng.
- Tăm bông ngoáy hậu môn: trong tr−ờng hợp bệnh nhân không thể đi ngoài đ−ợc, sử dụng một tăm bông vô trùng đ−a sâu vào hậu môn khoảng 2,5cm.
2.1.3. Bệnh than thể phổi
- Cấy máu: lấy máu đúng theo quy trình cấy máu.
- Đờm: lấy ít nhất 1ml dịch từ đường hô hấp dưới cho vào vật đựng vô trùng. Bệnh than thể phổi thường ít khi có đờm.
2.2. Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm
2.2.1. Tăm bông: chuyển ngay tới phòng thí nghiệm ở nhiệt độ thường, nếu thời gian vận chuyển > 1 giờ phải bảo quản ở nhiệt độ từ 2-80C.
162
2.2.2. Phân: chuyển bệnh phẩm không đ−ợc bảo quản tới ngay phòng thí nghiệm, nếu thời gian vận chuyển > 1 giờ phải bảo quản ở nhiệt độ từ 2-80C hoặc môi trường Cary-Blair hoặc môi tr−ờng bảo quản thích hợp.
2.2.3. Đờm: để bệnh phẩm trong vật đựng vô trùng và có nắp đậy, chuyển tới phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ, nếu sau 1 giờ phải bảo quản ở nhiệt độ từ 2-80C.
2.2.4. Máu: phải chuyển ngay tới phòng thí nghiệm để ở nhiệt độ phòng.
3. chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 3.1. Hoá chất và thiết bị phòng thí nghiệm
3.1.1. Hoá chất:
Bộ thuốc nhuộm Gram; Thử phản ứng catalase (3%H2O2); Môi tr−ờng di
động (hoặc slide, lamen, saline...); Saline vô trùng 3.1.2. Môi tr−ờng:
1. Thạch máu cừu 5% (SBA); Thạch sôcôla (CA); Thạch MacConkey (MAC); Thạch phenyl ethyl alcohol (PEA)
2. Chai cấy máu; Môi trường di động đóng tube; Môi trường dinh dưỡng TSB (tryptic soy broth); Dung dịch thioglycolate
3.1.3. Dụng cụ và thíêt bị thí nghiệm
1. Máy cấy máu (không bắt buộc); Kính hiển vi quang học với vật kính 10, 40, 100 và thị kính 10; Tủ ấm 35-37oC, nếu có tủ ấm CO2 là tốt nhất.
2. Lam kính và lamen để soi kính hiển vi; Que cấy dùng một lần 3.2. Quy tr×nh ph©n lËp vi khuÈn
3.2.1. Làm tiêu bản, nhuộm Gram
- Các b−ớc thực hiện: dựa trên quy trình sẵn có.
- Đặc điểm:
(1) B. anthracis là trực khuẩn Gram (+) (1-1,5 x 3-5 àm)
(2) Hình ảnh từ máu và tiêu bản: vi khuẩn th−ờng tập trung thành chuỗi ngắn 2- 4 tế bào, có lớp vỏ là một lớp sáng bao quanh vi khuẩn. Hình ảnh bào tử thường không thấy trong các mẫu bệnh phẩm trừ khi nồng độ CO2 quá thấp, giống nh− tìm thấy trong không khí; với nồng độ CO2 cao hơn không có sự ức chế sinh bào tử. Sự có mặt của trực khuẩn Gram (+) có vỏ, kích th−ớc lớn trong mắu là bằng chứng cho việc phân lập B.anthracis.
(3) Mọc trên thạch máu cừu 5% hoặc thạch khác t−ơng đ−ơng: khuẩn lạc hình
ôvan, kích th−ớc khoảng 1 x 1,5àm th−ờng do trực khuẩn than phát triển thành chuỗi dài. Tuy nhiên hình thái vi khuẩn mọc trên thạch máu th−ờng
163
không bị ảnh hưởng bởi điều kiện trong tủ ấm (nồng độ CO2) và thường không có vỏ.
3.2.2. Nhuộm mực India (không bắt buộc)
- Mục đích: sử dụng phương pháp này để có thể quan sát vỏ B.anthracis từ các bệnh phẩm nh− máu, chai cấy máu đã nuôi cấy, dịch não tuỷ.
3.2.2.1.Kiểm soát chất l−ợng:
(1) Chủng chứng d−ơng: Klebsiella pneumoniae (hoặc chủng khác thay thế của phòng thí nghiệm) cho thấy vòng tan máu hoàn toàn trên môi tr−ờng thạch máu cừu.
(2) Chủng chứng âm: E. coli ATCC 25922 (hoặc chủng khác thay thế của phòng thí nghiệm) sẽ không có vòng tan máu nào trên thạch máu cừu
(3) Ph−ơng pháp: Tiến hành kiểm tra với các chủng chứng mới mọc (chủng t−ơi). Chủng chứng sẽ đ−ợc phân tích từng ngày.
(4) Xem xét kết quả kiểm tra: kiểm tra môi tr−ờng, hoá chất, dụng cụ...
thay thế hoặc sửa chữa nếu ch−a hợp lý. Sau đó thực hiện kiểm tra lại.
3.2.2.2. Ph−ơng pháp:
(1) Đối với những chủng chứng, chuyển mỗi đĩa thạch máu 1 ăng khuẩn lạc (đ−ờng kính 1mm) (chứng d−ơng Klebsiella pneumoniae, chứng âm E. coli ATCC 25922) vào 0,5 ml saline và trộn đều.
(2) Đối với những chủng ch−a biết, lấy 100 àl mẫu (máu, dịch não tuỷ).
Chuyển 5-10 àl mẫu hoặc chứng lên một lam kính, đặt lamen lên trên, sau đó nhỏ 5-10 àl mực India vào cạnh của lamen. Sau khi mực khuếch tán vào phía trong lamen, soi kính hiển vi quang học sử dụng vật kính dầu 100x với giọt dầu nhỏ phía trên lamen.
3.2.2.3. Đọc kết quả:
(1) D−ơng tính: Sự xuất hiện của lớp vỏ chính là vòng sáng rộng xung quanh tế bào vi khuẩn.
(2) Âm tính: không có vòng sáng xung quanh vi khuẩn.
3.2.2.4. Báo cáo/hành động:
(1) Nếu từ mẫu bệnh phẩm thấy hình ảnh trực khuẩn Gram d−ơng, có vỏ qua nhuộm India thì đây là bằng chứng thuyết phục về sự có mặt B.anthracis.
(2) Việc phải làm tiếp theo là tiếp tục phân lập vi khuẩn và gửi tới phòng thí nghiệm cấp cao hơn.
164 3.2.2.5. Hạn chế:
(1) Công việc nhận định kết quả đòi hỏi nhân viên phòng thí nghiệm có kinh nghiệm và đ−ợc đào tạo.
(2) Kết quả âm tính không đ−ợc căn cứ để loại trừ B.anthracis.
3.2.3. Nuôi cấy 3.2.3.1. Quy tr×nh:
phân lập vi khuẩn, lựa chọn môi trường nuôi cấy theo kiểu thể bệnh như đã
h−ớng dẫn phần trên. Chú ý: các môi tr−ờng chuẩn sử dụng theo th−ờng quy phòng thí nghiệm.
a. Cấy máu: theo th−ờng quy phòng thí nghiệm
b. Mẫu bệnh phẩm thể da: cấy trực tiếp vào những môi tr−ờng th−ờng dùng cho phân lập vi khuẩn từ các vết th−ơng bề mặt nh− thạch máu cừu, MAC và canh thang tăng sinh và phết lam kính để nhuộm. Chú ý: B.anthracis không mọc trên MAC.
c. Phân: cấy trực tiếp lên các môi tr−ờng thích hợp nh− PEA, thạch máu cừu, MAC. Chú ý: B.anthracis không mọc trên PEA.
d. Đờm: cấy trực tiếp lên các môi tr−ờng vẫn sử dụng nh− thạch máu cừu, MAC, CA và phết lam kính chuẩn bị nhuộm.
3.2.3.2. Thời gian ủ:
Nhiệt độ: 35-37oC; Không khí: bình thường; Thời gian: Giữ đĩa đầu tiên trong ít nhất 3 ngày, xem kết quả hàng ngày. Đĩa nuôi cấy để trong khoảng 18-24 giờ. Có thể nhìn thấy khuẩn lạc B.anthracis sau 8 giờ nuôi cấy.
3.2.3.3. Đặc điểm khuẩn lạc B.anthracis
a. Sau khi nuôi cấy trên thạch máu trong vòng 18-24 giờ ở 35-37oC, khuẩn lạc riêng rẽ của B.anthracis có đ−ờng kính khoảng 2-5mm. Khuẩn lạc phẳng hoặc hơi lồi, trong với mép không tròn đều mà uốn l−ợn nh− hình sóng. Có thể nhìn thấy các vật thể giống hình dấu phẩy bắt đầu từ đ−ờng viền xung quanh khuẩn lạc nên gọi là khuẩn lạc "hình đầu sứa".
b. Khuẩn lạc B.anthracis trên thạch máu thường có hình thể ổn định và bám chắc. Khi chọc que cấy vào khuẩn lạc, trông giống nh− lòng trắng quả trứng vỡ . Khác với khuẩn lạc của B. cereus và B. thuringiensis, khuẩn lạc B.anthracis không tan máu β. Tuy nhiên có thể nhìn thấy tan máu yếu ở những vùng tập trung nhiều khuẩn lạc già và không nên nhầm lẫn đấy là tan máu β.
165
c. Khi xem xét kết quả đĩa thạch đầu tiên cần so sánh kết quả giữa thạch máu cừu và thạch MAC. B.anthracis mọc tốt trên thạch máu nh−ng không mọc trên thạch MAC và PEA.
d. B. anthracis mọc rất nhanh, những vùng dày khuẩn lạc có thể quan sát thấy sau 6-8 giờ, các khuẩn lạc riêng rẽ có thể thấy sau 12-15 giờ. Chính đặc điểm này giúp phân biệt đ−ợc trực khuẩn than khi nuôi cấy cùng với những vi khuẩn khác mọc chậm hơn.
3.2.3.4. Nhận biết rộng hơn:
Với mức độ A ở phòng thí nghiệm, mức độ định danh vi khuẩn chỉ dừng lại ở mức "nghi ngờ" (xem phần VII dưới đây để biết những đặc trưng của vi khuẩn than.
3.2.4. Test di động: môi trường lỏng hoặc môi trường đặc 3.2.4.1. Mục đích:
Sử dụng để nhận biết liệu vi khuẩn đang phân lập có khả năng di động không. B. anthracis không di động. Có hai phương pháp được sử dụng: môi trường lỏng hoặc môi trường đặc.
Bảng 1. Phương pháp xác định khả năng di động của vi khuẩn
Môi trường lỏng Môi trường đặc
Cho 2 giọt (xấp xỉ 0,1 ml) TSB hoặc môi tr−ờng t−ơng tự vào 1 tube thuỷ tinh. Sử dụng que cấy lấy một phần khuẩn lạc nghi ngờ sau nuôi cấy 12-20 giờ và hoà vào TSB.
Sử dụng một que cấy nhọn lấy một phần khuẩn lạc nghi ngờ mọc trên thạch máu sau 18-24 giờ nuôi cấy.
Cách khác có thể lấy 1 ăng vi khuẩn nuôi cấy trong môi tr−ờng lỏng.
Chọc thẳng que cấy vào môi tr−ờng thử nghiệm khoảng 3-4 cm sau đó rút thẳng que cấy ra, nh− vậy ta tạo
đ−ợc một đ−ờng thẳng trong thạch.
Chuyển 10 àl hỗn dịch nêu trên cho lên một lam kính, sau đó đậy lại bằng lamen.
Để tủ ấm ở 35-37oC trong vòng 18- 24 giê.
Soi bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 40x hoặc vật kính dầu 100x.
Sau khi sử dụng phải để lam kính đúng nơi quy định phòng thí nghiệm, thường ngâm trong dung dịch HCl 0,5%.
166 3.2.4.2. Đọc kết quả test di động:
Nếu thấy vi khuẩn không di động thì nghĩ nhiều đến B. anthracis.
Bảng 2: Kết quả test di động
Môi trường lỏng Môi trường đặc
D−ơng tính: những chủng d−ơng tính sẽ thấy chúng di động trong hỗn dịch quan sát bằng kính hiển vi, tuy nhiên tốc độ di chuyển có thể chậm hơn so với chủng chứng d−ơng.
Dương tính: vi khuẩn di động, sẽ quan sát thấy vi khuẩn mọc làm mờ vùng xung quanh đ−ờng cấy thẳng.
Âm tính: những chủng âm tính sẽ không di động hoặc di động theo kiểu Brown.
Âm tính: vi khuẩn không di động, ví dụ nh− B. anthracis thì chỉ quan sát thấy vi khuẩn mọc trên đ−ờng cấy ban đầu.
3.2.4.3. Quản lý chất l−ợng:
a. Chủng chứng d−ơng: Pseudomonas aeruginosa ATCC 35032 hoặc chúng khác t−ơng tự cũng có tính chất di dộng
b. Chủng chứng âm: Acinetobacter spp. ATCC 49139 hoặc chủng khác tương tự cũng không di động
c. Ph−ơng pháp: thực hiện kiểm tra với các chủng vi khuẩn chứng mới nuôi cấy theo ph−ơng pháp giống nh− với các chủng thử nghiệm. Các chủng vi khuẩn chứng nên đ−ợc kiểm tra mỗi ngày.
3.2.4.4. Kết quả sai lệch:
a. Kiểm tra lại môi tr−ờng nuôi cấy, hoá chất, chủng chứng, dụng cụ;
thay đổi hoặc sửa chữa nếu có thể. Sắp xếp lại và thực hiện lại kiểm tra.
b. Kiểm tra lại tính thuần chủng các chủng chứng và thực hiện lại kiểm tra.