CHƯƠNG 2 GIỚI THIỆU VỀ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT GIỚI THIỆU VỀ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
3.2. Các điều kiện nuôi cấy
3.2.1. Điều kiện phòng thí nghiệm và các thiết bị nuôi cấy
Việc xây dựng một phòng thí nghiệm từ đầu là một công việc tốn kém với thiết kế từ giai đoạn lên ý tưởng và việc lựa chọn vật liệu xây dựng. Để bắt đầu, một phòng thí nghiệm thương mại tốt nhất nên được đặt nó trong một tòa nhà sẵn có với những điều chỉnh phù hợp. Sau khi xem xét cẩn thận tính khả thi về kinh tế, một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô độc lập có thể được xây dựng. Một cơ sở nghiên cứu nên có ít nhất 4 phòng gồm: Phòng rửa, sấy, cất nước; phòng chuẩn bị, hấp môi trường; phòng cấy vô trùng;
phòng nuôi mẫu và 1 nhà lưới hoặc nhà kính.
3.2.1.1. Phòng rửa, sấy và cất nước
Tùy vào không gian và khả năng tài chính, điện tích phòng rửa và khử trùng có thể được thiết kế riêng biệt hoặc chung với nhau. Trong cả hai trường hợp, diện tích phòng rửa nên được cung cấp đủ nguồn nước nóng, lạnh chất lượng tốt và các loại bồn rửa chống chịu với các acid và bazơ. Các xô và bồn làm bằng thép hoặc nhựa, cần thiết để ngâm chai lọ nuôi cấy và các dụng cụ khác dùng trong chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
Các chổi rửa với các kích cỡ và hình dạng khác nhau để làm sạch các dụng cụ thủy tinh, trong khi đó cần thiết phải có máy rửa chắn thể tích lớn thì thuận tiện nhất.
Phòng để dụng cụ nên có tủ khí làm nóng làm khô dụng cụ, tủ sấy để sấy (60 - 300oC) khô các dụng cụ nuôi cấy và các khay chống bụi để bảo quản dụng cụ bằng nhựa và thủy tinh. Nên có một vách ngăn giữa hai khu vực chứa dụng cụ và rửa để ngăn dung dịch rửa bắn lên các dụng cụ đã rửa sạch. Nước có thể được tinh chế thông qua máy cất nước (1 lần hoặc 2 lần), khử ion và thẩm thấu ngược. Đôi lúc cần có sự kết hợp của hai hoặc nhiều hơn các phương pháp tinh chế nước. Độ tinh khiết của nước được đo bằng điện trở suất, độ dẫn điện.
3.2.1.2. Phòng chuẩn bị và hấp môi trường
Phòng chuẩn bị môi trường như một nhà bếp của cơ sở nuôi cấy mô và tế bào.
Phòng môi trường được trang bị một bàn ở trung tâm, mặt trên của chúng nên được ốp
49
bằng đá granit, gạch men để dễ dàng vệ sinh, với chiều cao phù hợp để làm việc trong khi đứng, không gian bên dưới của chúng có thể được trang bị ngăn kéo và tủ cho mục đích lưu trữ. Cần có bàn để đặt cân, máy đo pH, máy khuấy từ…. Các thiết bị cần có trong phòng chuẩn bị môi trường bao gồm: máy đo pH (xác định pH môi trường), máy khuấy từ (khuấy trộn dung dịch), cân phân tích 10-4g (cân lượng hóa chất nhỏ), cân kỹ thuật 10-2g (cân lượng hóa chất lớn), bếp điện, lò vi sóng (tan agar trong môi trường), tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu (-20 đến -80oC) (bảo quản, lưu trữ hóa chất và mẫu vật). Nồi hấp khử trùng môi trường tự động (autoclave) loại nhỏ (25 L) hoặc loại lớn (50-100 L) tùy theo nhu cầu được đặt trong phòng chuẩn bị môi trường, khu vực có cung cấp thông gió qua ống xả nên được lựa chọn.
3.2.1.3. Phòng cấy vô trùng
Không có yêu cầu đặc biệt nào đối với phòng cấy vô trùng ngoại trừ mức độ sạch sẽ cao và môi trường làm việc phù hợp. Thông thường các chai lọ môi trường nuôi cấy cũng được cất giữ ở đây; nếu có thể, một phòng cất giữ riêng biệt cũng nên được thiết lập. Để vận chuyển môi trường nuôi cấy vào hoặc chuyển bình nuôi cấy ra khỏi phòng cấy đến phòng nuôi mẫu có thể sử dụng các xe đẩy có một hoặc nhiều giá. Những xe đẩy này cũng có thể đóng vai trò giữ môi trường nuôi cấy bổ sung, giống gốc và/hoặc giống mới nuôi cấy cho đến khi được chuyển đến phòng nuôi mẫu. Phòng này được lặp đặt các tủ cấy vô trùng, quạt thông gió, đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường, thiết bị lọc không khí.
3.2.1.4. Phòng nuôi mẫu
Các bình nuôi mẫu được chuyển sang phòng nuôi mẫu (phòng sinh trưởng) với điều kiện nhiệt độ và ánh sáng được kiểm soát. Điều rất quan trọng là duy trì sự sạch sẽ, loại bỏ bụi bề mặt trong khu vực này. Phòng này nên chỉ có một cửa ra vào và không có các cửa sổ để tránh ánh sáng bên ngoài ảnh hưởng đến chu trình ánh sáng bên trong phòng. Tường và sàn nhà nên ốp bằng các vật liệu có thể dễ dàng lau chùi nhiều lần.
Nhiệt độ phòng được kiểm soát bởi máy điều hòa không khí. Điều hòa không khí dạng tháp rất thích hợp khi lọc không khí được làm mát, là một phương án nên được lựa chọn nhằm ngăn ngừa bụi, bào tử nấm…. tiếp cận khu vực nuôi mẫu. Các phòng thí nghiệm nghiên cứu nói chung, máy điều hòa không khí được sử dụng để làm mát trong mùa hè
50
và máy thổi khí nóng để sưởi ấm trong mùa đông. Máy điều hòa không khí và máy sưởi được nối với bộ điều khiển nhiệt độ để duy trì nhiệt độ ở mức 25 ± 2oC. Đối với các kiểu nuôi cấy có yêu cầu nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn, có thể sử dụng các tủ ấm hoặc buồng sinh trưởng có đèn huỳnh quang tích hợp. Những thiết bị này này có thể được đặt ngay cả bên ngoài phòng nuôi mẫu. Phòng nuôi cấy cũng nên có một máy lắc (loại nằm ngang hoặc loại quay) có thể điều khiển tốc độ, nhiệt độ và ánh sáng để dùng trong nuôi cấy huyền phù tế bào.
Các bình nuôi cấy trong phòng nuôi mẫu được đặt trên các kệ được thiết kế cố định hoặc di động. Các kệ có thể được làm bằng ván ép hoặc thép cứng, thường được thiết kế mở vì tốt hơn cho lưu thông không khí. Mỗi kệ được cung cấp một bộ ống huỳnh quang riêng biệt. Nhìn chung, trên các kệ nuôi mẫu, đèn huỳnh quang trắng mát với chấn lưu điện tử được sử dụng vì chúng phát ra cường độ ánh sáng đồng đều. Các mẫu nuôi cấy thường được duy trì trong ánh sáng khuếch tán có cường độ 3000–5000 lux.
Một tấm lá nhôm hoặc lớp sơn nhôm phủ bên trên các đèn giúp tối đa hóa cường độ ánh sáng bên dưới. Các đèn chiếu sáng được kết nối với bộ hẹn giờ tự động để điều chỉnh thời gian chiếu sáng. Một số thiết kế khác cũng nên được thiết lập để thực hiện việc nuôi cấy mẫu trong điều kiện không có ánh sáng hoặc cường độ ánh sáng cao. Trong trường hợp các mẫu cấy được duy trì trong các chế độ nhiệt độ và thời gian chiếu sáng khác nhau thì nên có nhiều hơn một phòng nuôi mẫu.
Nếu độ ẩm tương đối trong phòng nuôi mẫu cần giữ ở khoảng 50%; nếu giảm xuống dưới 50%, cần sử dụng máy làm ẩm để ngăn môi trường khô nhanh. Máy hút ẩm có thể được sử dụng khi độ ẩm rất cao, đặc biệt là trong mùa mưa, để tránh cho nút chai mẫu (bông hoặc giấy kẽm) bị ẩm hoặc ngưng tụ các giọt nước, có thể làm tăng cơ hội nhiễm khuẩn mẫu nuôi cấy.
3.2.1.5. Nhà màng hoặc nhà kính
Để thích nghi và sản xuất cây con in vitro hoặc phát triển cây mẹ, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật nên có nhà lưới hoặc nhà kính bằng làm thủy tinh, polythene hoặc polycarbonate tùy vào nhu cầu sản xuất và khả năng tài chính. Cơ sở này nên có quạt thông gió để duy trì độ ẩm cao và hệ thống đệm. Nên có một phòng tạo bầu ươm cây đặt liền kề với cơ sở này. Cần phải có một nồi hấp trong khu vực này để khử trùng hỗn
51
hợp cơ chất tạo bầu ươm khi cần thiết. Phòng vệ sinh, văn phòng hành chính và trung tâm tiếp nhận và vận chuyển mẫu cũng nên đuợc bố trí.
3.2.2. Vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật 3.2.2.1. Các nguồn lây nhiễm mẫu vật nuôi cấy
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn, các mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.
Trong quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật có nhiều nguồn nhiễm tạp khác nhau như: Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối;
Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc vi khuẩn;
Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi trường.
Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào thực dài khoảng 1 - 5 tháng, trong khi thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc trong một vài ngày. Nói cách khác, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt, điều kiện này đặc biệt quan trọng khi nuôi cấy các tế bào đơn thực vật trong các nồi phản ứng sinh học, điều kiện vô trùng phải rất cao mới có hy vọng thành công được.
3.2.2.2. Khử trùng dụng cụ, thiết bị nuôi cấy
Phần này đề cập đến các kỹ thuật cơ bản để duy trì sự sạch sẽ và vô trùng trong phòng thí nghiệm và trong các môi trường nuôi cấy.
a. Khử trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy
Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải là loại thủy tinh trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ thủy tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy.
Tất cả đồ thủy tinh, trừ những đồ đã được khử trùng trước, nên được rửa kỹ khi sử dụng lần đầu tiên. Thông thường, dụng cụ được ngâm qua đêm trong chất tẩy tiêu chuẩn và được cọ rửa bằng bàn chải hoặc bằng máy. Sau đó, chúng được rửa sạch dưới vòi
52
nước và tráng lại bằng nước cất. Thạch khô có thể được loại bỏ bằng cách đun nóng.
Các lọ nuôi cấy bằng thủy tinh và nhựa bị nhiễm bẩn phải được hấp khử trùng trước khi mở để rửa hoặc loại bỏ tương ứng, nhằm giảm thiểu sự lây lan của các chất gây ô nhiễm vi khuẩn và nấm trong phòng thí nghiệm. Các dụng cụ thủy tinh đã rửa sạch được đặt trong giỏ hoặc khay để ráo nước và sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 60-70oC/2 giờ và bảo quản trong tủ chống bụi.
Các lọ nuôi cấy là nguồn gây ô nhiễm chính, nếu chúng đã được sử dụng lâu dài.
Các lọ nuôi cấy có thể được khử trùng khô trước khi đổ môi trường để tiêu diệt vi khuẩn đó, những vi khuẩn này có thể chịu được hấp khử trùng. Các lọ nuôi cấy thường được khử trùng cùng với môi trường nuôi cấy. Đối với môi trường đã được khử trùng trước, các lọ nuôi cấy có nắp đậy thích hợp có thể được khử trùng bằng cách hấp hoặc làm nóng khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 160 - 180oC trong 3 giờ. Dụng cụ thủy tinh nên để nguội trước khi lấy ra khỏi tủ sấy.
Các nút đậy chai nuôi cấy thường làm bằng bông không thấm nước. Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất, nhưng có các nhược điểm sau:
- Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ bị nhiễm nấm, nhất là ở các thí nghiệm nuôi cấy trong thời gian dài;
- Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên quy mô lớn;
- Chỉ dùng được một vài lần, sau phải bỏ.
Hiện nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy. Hiên nay, sử dụng giấy nhôm làm nút đậy các chai lo nuôi cấy cũng được sử dụng vì tính tiện dụng của nó.
b. Khử trùng các thiết bị nuôi cấy
53
Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thủy tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này.
Tủ cấy có buồng cấy với diện tích hẹp, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào (Hình 3.1). Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24 giờ. Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 90%.
Các dụng cụ cấy như kẹp, dao mổ, kim và thìa nên khử trùng trước khi sử dụng bằng cách bọc trong giấy nhôm và hấp khử trùng. Một lần nữa, trong quá trình thao tác vô trùng, các dụng cụ được khử trùng nhiều lần bằng cách nhúng vào cồn 95% và hơ lửa đèn cồn (hoặc đèn gas) và sử dụng sau khi làm mát. Một số phòng thí nghiệm sử dụng máy khử trùng bằng hạt thủy tinh (steripot), trong đó nhiệt độ tăng lên 2500C trong vòng 5–20 phút. Nhúng dụng cụ vào các hạt được làm nóng trong 5–7 phút là đủ để khử trùng chúng. Bộ khử trùng hồng ngoại cũng được dùng để khử trùng các dụng cụ trong buồng cấy.
Hình 3.1. Tủ cấy vô trùng Air clean dùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật (https://www.aircleansystems.com/)
54
Trước khi cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy cần có một đèn tử ngoại 40W treo trên trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi không có người trong phòng cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy hạn chế đi lại, ra vào buồng cấy nhiều lần.
3.2.2.3. Khử trùng môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy mô không chỉ là nguồn gây ô nhiễm mà còn hỗ trợ sự phát triển của các vi sinh vật lây nhiễm. Do đó, nó phải được khử trùng đúng cách. Hầu hết, môi trường nuôi cấy được khử trùng bằng nồi hấp. Trong một số trường hợp, môi trương nuôi cấy được khử trùng bằng màng lọc.
a. Khử trùng bằng nồi hấp
Các môi trường nuôi cấy được pha chế và dự trữ trong điều kiện không vô trùng và đem hấp vô trùng khi đã phân phối vào các dụng cụ thủy tinh đã đậy nút hoặc nắp trong các nồi hấp vô trùng (Hình 3.2). Thời gian hấp từ 15 - 20 phút ở áp suất khoảng 1 atm, 121oC. Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút bông.
Các dung dịch mẹ dùng để pha chế môi trường cần được bảo quản trong tủ lạnh trong khoảng thời gian nhất định. Dung dịch mẹ của hỗn hợp vitamin nên chia thành nhiều lọ nhỏ và bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên pha một lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất điều hòa sinh trưởng.
Hình 3.2. Các dạng nồi hấp vô trùng, dạng nằm đứng và nằm ngang, dùng trong nuôi cấy mô và tế bào ( http://www.sturdy.com.tw/)
55
Ở áp suất khoảng 1 atm hầu hết các vi sinh vật có trong môi trường đều bị diệt, kể cả các vi sinh vật ở dạng bào tử. Thời gian hấp vô trùng trong nồi hấp thường từ 15 đến 20 phút.
Nồi hấp tiệt trùng có một số nhược điểm như thay đổi độ pH của môi trường và phân hủy một số thành phần môi trường. Các thành phần sau đây sẽ bị phân hủy một phần bằng nồi hấp:
- Sucrose phân hủy thành glucose, fructose. Môi trường hấp tiệt trùng với sucrose sẽ chứa một số loại đường.
- Acid gibberellic mất 90% hoạt tính của nó.
- Vitamin B1 bị phân hủy thành pyrimidine và thiazol.
- Zeatin, urê, vitamin C, colchicine và thuốc kháng sinh đều không bền với nhiệt.
- Chất chiết xuất từ thực vật mất đi một số hoạt tính của chúng.
Đôi khi ta cần cho vào môi trường nuôi cấy các chế phẩm mẫn cảm với nhiệt, có thể bị phân hủy khi ta hấp ở 121oC. Trường hợp này cần tiến hành lọc vô trùng riêng các chế phẩm đó và sau đó đưa vào môi trường đã được khử trùng.
Bảng 3.6. Thời gian khử trùng tối thiểu bằng nồi hấp vô trùng Thể tích
môi trường (mL)
Thời gian khử trùng tối thiểu ở 121oC
20 - 50 15
75 20
250 - 500 25
1000 30
1500 35
2000 40
b. Khử trùng bằng màng lọc