CHƯƠNG 4 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO Ở THỰC VẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO Ở THỰC VẬT
4.5. Sản xuất cây giống in vitro thực vật trong hệ thống phản ứng
Trước đây, các nồi phản ứng sinh học hay còn gọi là nồi lên men (bioreactor) chủ yếu được dùng cho công nghệ vi sinh. Hệ lên men cũng đã được phát triển để nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật và sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp, sau đó đã được sửa đổi và cải tiến cho quá trình nuôi cấy tạo phôi soma và nuôi cấy rễ tơ ở nhiều loài thực vật…
Trên cơ sở các thiết bị đó, với một số cải tiến, nhiều tác giả đã nhân giống thành công nhiều loại phôi vô tính và các thể chồi, cụm chồi hoặc củ nhỏ. Ứng dụng của hệ lên men để nhân giống cây trồng lần đầu tiên được báo cáo bởi Takay-ama và Misawa vào năm 1981 trong trường hợp của cây thu hải đường. Kể từ đó, công nghệ này đã được áp dụng để nhân giống quy mô lớn ở cây hoa loa kèn, dâu tây, khoai tây, cỏ ngọt…
Sự phát sinh phôi soma trong nuôi cấy lắc lỏng hoặc trong hệ lên men cũng đã được báo cáo ở cỏ linh lăng, thối xe, cà phê, cần tây, cây trạng nguyên, cao su và khoai lang. Hiệu quả của việc nhân giống bằng hệ lên men khá cao so với nuôi cấy rắn hoặc lỏng lắc, giúp tiết kiệm thiết bị, dung cụ nuôi cấy và chi phí lao động. Do mẫn cảm với lực trượt của thực vật, đặc biệt là nuôi cấy chồi, hệ lên men có cánh khuấy không phù hợp cho việc nhân giống thực vật ở quy mô lớn. Do đó, hầu hết các hệ lên men được sử dụng thường xuyên cho mục đích này là các hệ lên men bong bóng dạng cột và thông khí.
80
Môi trường có độ ẩm cao và khí bên trong hệ lên men, bao gồm chủ yếu là nitrogen (78%), oxygen (21%) và CO2 (0,036%) và một lượng nhỏ ethylene, ethanol, acetaldehyde…. gây ra tình trạng ngậm nước của chồi. Cách được áp dụng để giải quyết vấn đề này là thêm vào các chất ức chế tổng hợp gibberellin để chỉ cho phép lá kéo dài một cách hạn chế, dẫn đến sự nhân lên của các chồi dưới dạng các cụm mô phân sinh hoặc chồi (khối lượng chồi giảm đi rất nhiều). Hệ thống này đã được sử dụng cho chuối, dương xỉ, hoa lay ơn và khoai tây. Vào năm 1994 Akita và cộng sự đã phát triển lò hệ lên men loại cánh quạt thể tích 500 L được lắp một đĩa xốp ở đáy và lưới hình trụ ở giữa để nhân giống cỏ ngọt để tổng hợp stevioside và rebaudioside-A (ngọt hơn 300 - 400 lần so với sucrose). Trong hệ lên men được trang bị bốn đèn huỳnh quang này, tốc độ nhân lên 140 lần trong một tháng đã đạt được. Cụm chồi từ môi trường lắc trên môi trường MS cải tiến được bổ sung với 0,1 mg/L NAA và BAP và sucrose 3%. Hệ lên men chứa 300 L môi trường MS với 1% sucrose được cấy 460 mg mầm chồi và sục khí 15 L/phút, ở 25oC, chiếu sáng 16 h. Sau 3 tuần nuôi cấy, 20 L môi trường được rút ra và 50 L môi trường mới chứa 6.300 g sucrose được bổ sung. Trong vòng một tháng, các chồi nhân lên đầy bình nuôi cấy và tạo ra sinh khối đạt 64,6 kg. Các chồi không có rễ và có thể dễ dàng chuyển ra đất với tỷ lệ sóng sót đến 90%.
Chồi in vitro ngâm chìm trong môi trường lỏng thường có hại cho sự phát triển và sức sống của chồi. Do đó, các loại thiết lên men ngập chìm tạm thời, dòng chảy lên xuống, hệ thống bình đôi, phun sương dinh dưỡng, bằng túi nhựa, và hệ thống Rocker đã được thử nghiệm để sản xuất củ khoai tây siêu nhỏ.
Phôi vô tính cà phê được sản xuất thành công ở Brasil trên các nồi phản ứng sinh học dung tích từ 2 - 4 L. Nồi vận hành theo các nguyên tắc của một nồi lên men (có thể không dùng cánh khuấy mà chỉ dùng bọt khí để thực hiện việc truyền khí và truyền nhiệt). Mỗi mẻ có thể thu được 4 - 5 triệu phôi vô tính cà phê. Ở Indonesia, cụm chồi dứa được đưa vào sản xuất thành công với nồi lên men 10 lít. Điểm đáng chú ý trong công nghệ này là thay vì bơm khí vào nồi phản ứng, dịch lỏng nuôi cấy (môi trường mới) được bơm vào nồi và hút ra (môi trường cũ) theo chu kỳ ngắn, nhờ vậy mô và tế bào thực vật có đủ oxy và chất dinh dưỡng để phát triển mạnh. Phương thức nuôi cấy này được gọi là nuôi cấy thể ổn định hóa tính.
81
Hình 4.12. Nhân giống lan Phalaenopsis từ protocorm bằng hệ thống bioreactor (Paek và cộng sự, 2005)
Chú thích: a, nhân protocorm trong bioreactor; b, tái sinh chồi từ protocorm; c, huấn luyện cây con
Củ siêu bi (microtuber) được thị trường quốc tế công nhận là dạng khoai tây giống của thế kỷ 21. Củ khoai tây siêu bi có kích thước bằng hoặc nhỏ hơn hạt ngô, hoàn toàn sạch bệnh virus được công ty Microtuber Inc. (Mỹ) sản xuất trong các nồi phản ứng là các đoạn thân khoai tây nhân giống bằng cấy mô theo phương pháp cổ điển. Trong nồi phản ứng, các đoạn thân được kích thích ra rễ và tạo củ nhỏ. Hiện nay, Microtuber Inc.
có thị trường ở Bắc Mỹ và Hà Lan. Nồi phản ứng ở hãng Microtuber Inc. là các ống nhựa kín chịu nhiệt, đường kính 15 cm, dài 50 cm, quá trình tạo củ hoàn toàn không cần chiếu sáng.
Một vấn đề lớn gặp phải khi nuôi cấy lỏng quy mô lớn trong hệ lên men là sự nhiễm bẩn bởi các vi sinh vật được đưa vào cùng nguyên liệu thực vật và trong quá trình vận hành, có thể gây ra một số tổn thất trong nuôi cấy.
82 CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1: Trình bày mục đích của nhân giống vô tính in vitro ở thực vật ? Cho các ví dụ minh họa.
Câu 2: Phân tích các ưu điểm và hạn chế của công nghệ nhân giống vô tính in vitro ở thực vật ?
Câu 3: Trình bày con đường nhân giống vô tính in vitro thực vật thông qua nuôi cấy tạo phôi soma và công nghệ hạt nhân tạo ? Cho các ví dụ minh họa.
Câu 4: Trình bày con đường nhân giống vô tính in vitro thực vật thông qua nuôi cấy tái sinh các cấu trúc sinh dưỡng? Cho các ví dụ minh họa.
Câu 5: Trình bày con đường nhân giống in vitro thực vật thông qua nuôi cấy callus ? Câu 6: Trình bày các giai đoạn chính trong quy trình nhân giống vô tính in vitro ở thực
vật ?
Câu 7: Trình bày vai trò và ưu điểm của sản xuất cây giống thực vật thông qua nuôi cấy trong hệ phản ứng (bioreactor) ?
83 CHƯƠNG 5
NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP
TÓM TẮT CHƯƠNG
Nuôi cấy tế bào thực vật là công nghệ nuôi cấy các tế bào riêng lẻ hay cụm tế bào ở điều kiện in vitro. Công nghệ nuôi cấy có nhiều ứng dụng thực tiễn hiện này là nuôi cấy huyền phù tế bào. Nuôi cấy huyền phù tế bào cung cấp một hệ thống duy nhất cho những nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp ở thực vật. Nội dung chương này đề cập đến các phương thức, môi trường, hệ thống, điều kiện nuôi cấy, cũng như ứng dụng của công nghệ nuôi cấy tế bào huyền phù trong việc sản xuất các hợp chất này để sử dụng trong các lĩnh vưc như y dược, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm.