CHƯƠNG 7 BẢO TỒN NGUỒN GENE IN VITRO BẢO TỒN NGUỒN GENE IN VITRO
7.3. Phương pháp bảo quản đông lạnh
Phương pháp bảo quản đông lạnh (hay còn gọi là bảo quản dài hạn) được thực hiện bằng cách cấp đông mô, tế bào bằng nitrogen lỏng (-196℃) và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ lạnh sâu. Ở nhiệt độ cực thấp này, mọi hoạt động trao đổi chất của tế bào bị ức chế. Do đó, về lý thuyết, các mẫu đông lạnh có thể được lưu trữ trong khoảng thời gian
127
không giới hạn mà không cần cấy chuyển. Tuy nhiên, để đạt được mục đích này thì cần đảm bảo tránh các tổn thương do quá trình cấp đông, bảo quản và tái nuôi cấy mẫu.
Trong hơn ba thập kỷ qua, có nhiều nghiên cứu nỗ lực để thiết lập các quy trình bảo quản đông lạnh các tế bào, mô và cơ quan thực vật khác nhau. Hàng trăm loài thực vật được bảo tồn thành công bằng phương pháp bảo quản này. Bảo tồn in vitro các nguồn gene bằng phương pháp đông lạnh ngày càng được sử dụng rộng rãi. Ví dụ, các chồi in vitro của cây bạch dương bạc có thể được bảo quản đông lạnh trong 5 năm vẫn cho thấy khả năng duy trì sự sống như các chồi không đông lạnh.
7.3.2. Các phương pháp bảo quản đông lạnh
Vấn đề chính trong bảo quản đông lạnh là bảo vệ các tế bào bằng cách ngăn chặn hoặc giảm thiểu sự hình thành tinh thể băng trong quá trình cấp đông. Có hai cách tiếp cận để cấp đông hiệu quả trước khi bảo quản:
- Phương pháp cấp đông chậm: hay còn gọi là phương pháp truyền thống. Phương pháp này làm đông mẫu theo quy trình giảm dần nhiệt độ từng mức cho đến nhiệt độ cuối (Hình 7.1);
- Phương pháp đông nhanh: Mẫu mô, tế bào nuôi cấy được cấp đông ngay lập tức bằng nitrogen lỏng, qua đó dừng ngay mọi hoạt động của mô tế bào. Phương pháp này ngày càng được áp dụng phổ biến vì khả năng duy trì chất lượng của mẫu.
Cả hai phương pháp đều nhằm vào mục đích loại bỏ lượng nước nội bào thích hợp trước hoặc trong khi cấp đông. Do đó nguyên sinh chất trở nên cô đặc và ngăn chặn sự hình thành tinh thể băng. Để đạt được mục đích này, bước tiền nuôi cấy có ý nghĩa rất lớn trong việc tăng cường khả năng chịu mất nước của tế bào. Việc lựa chọn mô cũng góp phần vào sự thành công của phương pháp bảo quản.
7.3.3. Các bước của quy trình bảo quản đông lạnh 7.3.3.1. Chuẩn bị nguyên liệu thực vật
Nguyên liệu được bảo quản có thể là các khối callus, chồi đỉnh, phôi,… có kích thước nhỏ. Mẫu thực vật với các tế bào nhỏ và tế bào chất đậm đặc, đặc biệt là các tế bào ngay sau khi nguyên phân ở trong pha tăng trưởng của nuôi cấy huyền phù, thường thích hợp cho mục đích bảo quản vì chúng có khả năng chống chịu đông lạnh tốt. Ngược
128
lại, các tế bào có không bào lớn thì rất nhạy cảm và sẽ khó sống sót khi rã đông. Các chồi đỉnh nhỏ hơn 1 mm rất dễ bị thủy tinh hóa khi cấp đông, dẫn đến tỷ lệ sống kém sau bảo quản. Kích thước hợp lý của mẫu chồi được bảo quản thành công là 1 - 1,5 mm.
Bản chất của mô cũng có thể ảnh hưởng đến sự sống sót sau khi bảo quản. Ví dụ, phôi cây ôliu bảo quản đông lạnh cho thấy tỷ lệ sống sót cao hơn (38%) so với chồi ngọn (15%).
Hình 7.1. Các bước trong phương pháp bảo quản đông chậm (Bhojwani và Dantu, 2013).
Chú thích: Mô được cắt bỏ và xử lý bằng chất bảo vệ đông trong điều kiện vô trùng (a) và chuyển sang vial đông lạnh (b). Các vial được hàn kín bằng ngọn lửa (c) được đặt vào các hộp bảo quản (d), và sau đó được cấp
đông trong tủ đông nitrogen lỏng với chương trình cấp đông được lập trình (e). Mẫu đông lạnh được rã đông nhanh chóng bằng cách nhúng các vial vào bể nước ở 37- 40oC (f).
129 7.3.3.2. Tiền nuôi cấy
Mấu chốt để bảo quản đông lạnh thành công là tạo ra các tế bào có khả năng chống lại sự mất nước hoặc chống chịu lạnh khi cấp đông. Các tế bào ở trạng thái như vậy có thể thu được sau 2 - 4 ngày nuôi cấy ở môi trường có bổ sung các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu ví dụ như: sucrose, sorbitol, mannitol, proline. Sự thích nghi của các tế bào với stress thẩm thấu cũng đạt được khi xử lí nhiệt độ thấp, do sự tích luỹ của protein điều hòa nhiệt và các phân tử dehydrin. Các protein được cảm ứng còn giúp bảo vệ các enzyme không bền nhiệt.
7.3.3.3. Cấp đông
Cấp đông là bước quan trọng nhất trong phương pháp bảo quản đông lạnh. Ở cả hai phương pháp cấp đông chậm và cấp đông nhanh, các tế bào cần được loại nước trước khi bảo quản trong nitrogen lỏng để giảm thiểu tổn thương do hình thành tinh thể băng.
- Phương pháp cấp đông chậm (Hình 7.2):
Trong phương pháp này, đầu tiên mẫu thực vật được cấp đông với tốc độ nhiệt từ 0,5 - 2℃/phút để giảm nhiệt độ xuống - 30 đến - 40 ℃, và sau đó được giữ ở nhiệt độ này trong khoảng 30 phút trước khi chuyển sang nitrogen lỏng. Quá trình giảm nhiệt độ có thể kiểm soát bằng cách sử dụng hệ thống làm mát được lập trình, ví dụ: hệ thống làm đông được sản xuất bởi Planner Products (Anh) và Cryomed (Mỹ).
Trong quá trình cấp đông chậm, chất lỏng ngoại bào (chất lỏng gian bào và hỗn hợp đông) đông trước. Dịch ngoại bào đông sẽ tạo ra sự mất cân bằng nước giữa bên trong và bên ngoài tế bào. Kết quả là nước từ bên trong tế bào di chuyển ra ngoài gây mất nước cho tế bào, và dẫn đến giảm điểm đóng băng của tế bào chất do độ nhớt của nó tăng lên. Làm mất nước tế bào trong giai đoạn cấp đông đầu tiên làm giảm hiệu quả sự hình thành tinh thể băng khi chuyển mẫu sang nitrogen lỏng. Phương pháp cấp động chậm áp dụng thành công cho nhiều dạng mô, tế bào không biệt hoá. Tuy nhiên, khi áp dụng để bảo quản chồi đỉnh, đặc biệt các cây nhiệt đới, thì gây ảnh hưởng rất lớn đến sức sống và kiểu tái sinh của mẫu. Quá trình cấp đông cần có thiết bị điều khiển nhiệt, do đó chi phí sẽ tăng lên.
130
Hình 7.2. Các bước của phương pháp bảo quản đông chậm tế bào nuôi cấy huyền phù (Bhojwani và Dantu, 2013).
Tuy nhiên, quá trình loại bỏ nước nội bào có thể gây ra sự tổn thương do thay đổi thể tích và nồng độ các chất nội bào. Để ngăn chặn ảnh hưởng này, một số tác nhân bảo vệ, chẳng hạn như DMSO và glycerol có thể được sử dụng, chúng có thể bổ sung vào hỗn hợp dưới dạng riêng lẻ hoặc kết hợp. Đối với các tế bào nuôi cấy huyền phù, hỗn hợp 0,5% DMSO, 0,5% glycerol và 1 M sucrose được áp dụng rộng rãi. Trong một số trường hợp sucrose được sử dụng ở nồng độ 0,3 M ở trong môi trường nuôi cấy với tác dụng chống mất nước, sau đó nâng lên nồng độ 1 M trong hỗn hợp đông với vai trò chất bảo vệ đông. Mẫu thường được ủ trong dung dịch chất chống đông trên đá lạnh khoảng 1 h trước khi cấp đông. Chất chống đông đặc biệt quan trọng đối với các tế bào có không bào lớn. Ngoài ra, chúng cũng hoạt động như chất chống oxy hóa và chất ổn định màng tế bào.
- Phương pháp cấp đông nhanh:
Đầu tiên, mẫu được loại nước và sau đó ngâm trực tiếp vào nitrogen lỏng. Trong quá trình loại nước, nồng độ chất tan nội bào tăng, độ nhớt tăng. Khi tiếp xúc với nitrogen lỏng, phần nước còn lại của tế bào nhanh chóng chuyển pha, từ pha lỏng qua pha rắn (dạng thuỷ tinh). Quá trình chuyển pha này ngăn chặn các tổn thương đối với tế bào. Ngoài việc hạn chế tổn thương, ưu điểm của phương pháp cấp đông nhanh là đơn giản, áp dụng có hiệu quả đối với nhiều dạng mô khác nhau, và không đòi hỏi thiết bị lập trình chế độ cấp đông. Khi một quy trình cấp đông được thực hiện đúng cách thì các mô, đặc biệt là mô đỉnh sinh trưởng, được bảo vệ hoàn toàn. Các mô đỉnh sinh trưởng có thể tái sinh trực tiếp mà không cảm ứng qua trạng thái callus. Do đó, hạn chế sự biến dị di truyền.
Quá trình làm khô tế bào trước khi cấp đông được thực hiện bằng cách cho tế bào tiếp xúc với không khí vô trùng trong tủ vô trùng, dòng khí nén hoặc hoặc làm khô trên silica gel. Tuy nhiên, điều này chỉ áp dụng cho các mẫu vật không nhạy cảm với việc
Xử lí chất chống đông:
1 M DMSO + 1 M sucrose + 0,5 M glycerol (trên đá lạnh)
Chuyển mẫu đến các vial và cấp đông đến - 35℃
với tốc độ 1℃/ phút
Ngâm trong nitrogen lỏng và
bảo quản
Ủ, 1 giờ Ủ, 3 giờ
131
mất nước. Một cách khác được ứng dụng rộng rãi hơn là loại nước bằng các chất thẩm thấu trước khi làm mất nước tế bào bằng các phương pháp ở trên. Một dung dịch thủy tinh hóa thực vật (PVS2), bao gồm các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu độ cao (0,4 M sucrose, 30% glycerol, 15% ethylene glycol và 15% DMSO trong môi trường nuôi cấy) đã được sử dụng rộng rãi để loại nước và tăng hiệu quả hình thành thuỷ tinh thể. Thời gian và nhiệt độ xử lý bằng PVS2 là những yếu tố quan trọng. Khi rã đông và nuôi cấy tái sinh PVS2 được loại bỏ bằng cách rửa 2 lần trong môi trường có chứa 1,2 M sucrose.
Quy trình chung để cấp đông bao gồm các bước (Hình 7.3):
- (1) Cho tế bào thích nghi với môi trường chứa chất thẩm thấu từ 2 - 4 ngày ở 4℃;
- (2) Ủ tế bào trong dung dịch PVS2 trong 30 - 90 phút trên đá;
- (3) Chuyển mẫu sang ống vial có chứa hỗn hợp chống đông (khoảng 0,75 ml trong lọ 2 ml) và đậy kín;
- (4) Xử lí trong nitrogen lỏng để cấp đông và bảo quản.
Hình 7.3. Phương pháp cấp đông nhanh (trong PVS2) sử dụng để bảo quản chồi đỉnh cây Trifolium repens (Bhojwani và Dantu, 2013).
7.3.3.4. Bảo quản
Mẫu thực vật sau khi cấp đông được bảo quản trong một thiết bị có chứa nitrogen lỏng, nitrogen phủ đầy trong không gian chứa mẫu. Khi lưu trữ một số lượng lớn mẫu, cần phải tuân theo một hệ thống kí hiệu và quản lí. Điều này sẽ không chỉ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thao tác, mà còn hạn chế sự tiếp xúc với môi trường nhiệt độ phòng trong thời gian dài.
7.3.3.5. Rã đông
Rã đông nhanh thường có hiệu quả. Vials chứa mẫu bảo quản đông được ngâm trong nước ở 37 - 40oC. Sau 30 - 90 phút, chuyển sang bể nước đá hoặc môi trường nuôi cấy. Việc thực hiện một bước loại bỏ chất chống đông khỏi mẫu vật bảo quản là không
Nuôi cấy mẫu trong môi trường B5 có 1,2
M sorbitol ở 4℃
Chuyển mẫu sang vial và bổ sung PVS2 từ từ
trong 20 - 30 phút
Ngâm vial trong nitrogen lỏng và
bảo quản
Ủ, 2 - 4 ngày Ủ, 15 phút
132
cần thiết vì sẽ ảnh hưởng đến mẫu. Thay vào đó, mẫu đã rã đông có thể được đặt trên môi trường nuôi cấy, từ đó chất chống đông được pha loãng dần dần. Bên cạnh đó, mẫu bị thủy tinh hóa hoặc mất nhiều nước cần nuôi cấy ở các môi trường có thẩm thấu giảm dần trong khi tái nuôi cấy.
7.3.3.6. Tái nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy được sử dụng tương tự như đối với mẫu vật không được bảo quản đông. Tuy nhiên, một số trường hợp, thành phần môi trường và cách thức nuôi cấy có thể thay đổi. Ví dụ, chồi từ cây giống cà chua bảo quản đông phát triển trực tiếp thành cây con chỉ khi gibberellin được bổ sung vào môi trường. Khi không có gibberellin, quá trình tái sinh diễn ra gián tiếp thông qua callus.
7.3.3.7. Đánh giá tính ổn định của mẫu sau bảo quản
Kiểm tra khả năng sống và tính ổn định di truyền của mẫu sau bảo quản đông là cần thiết. Thử nghiệm tốt nhất về khả năng tồn tại là sự tái phát triển của mô, tế bào.
Tuy nhiên, một số xét nghiệm mô học vẫn có thể được sử dụng để kiểm tra khả năng sống của tế bào một cách nhanh chóng. Tính ổn định di truyền của vật liệu có thể được kiểm tra bằng các chỉ thị phân tử.
133 CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1: Bảo tồn nguồn gene in vitro là gì? Tại sao nói nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ hữu ích trong bảo tồn ?
Câu 2: Sự khác nhau giữa bảo tồn nguồn gene in vitro với các giải pháp bảo tồn chuyển vị và nguyên vị ?
Câu 3: Tại sao nói bảo tồn in vitro là giải pháp có tính an toàn và hiệu quả ?
Câu 4: Nguyên lý của phương pháp bảo quản ngắn hạn là gì? Làm cách nào để làm hạn chế sự sinh trưởng của mẫu nuôi cấy ?
Câu 5: Giải thích bản chất của phương pháp bảo quản đông lạnh ? Vấn đề mấu chốt đảm bảo quá trình bảo quản đông lạnh thành công là gì?
Câu 6: Trình bày các bước của quy trình bảo quản đông ? Sự khác nhau cơ bản giữa phương pháp cấp đông nhanh và cấp đông chậm ?
Câu 7: Làm sao để đánh giá tính ổn định di truyền của mẫu sau bảo quản đông lạnh ?
134 CHƯƠNG 8
VẬT CHẤT DI TRUYỀN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID NUCLEIC THỰC VẬT
TÓM TẮT CHƯƠNG
Hệ gene của tế bào là vật liệu của các kỹ thuật di truyền và phân tích acid nucleic.
Hệ gene ở thực vật bao gồm hệ gene nhân, lục lạp và ty thể với các đặc điểm khác nhau về thành phần, cấu trúc và chức năng. Gene là đơn vị di truyền cơ sở của tế bào, mã hoá cho một sản phẩm RNA. Cấu trúc của một gene gồm hai vùng trình tự có chức năng khác nhau: vùng điều hòa và vùng mã hoá chứa các đoạn exon và intron. Hoạt động biểu hiện của gene diễn ra qua nhiều bước với sự tham gia của các yếu tố điều hoà quá trình này. Các công nghệ làm thay đổi vật liệu di truyền của tế bào luôn cần sự hỗ trợ của các phương pháp tổng hợp và dò tìm sự có mặt các phân tử acid nucleic. Nội dung chương này đề cập đến các khái niệm, đặc điểm cơ bản của vật chất di truyền ở thực vật, cũng như các phương pháp phân tích acid nucleic gồm: phản ứng chuỗi trùng hợp, lai và giải trình tự DNA.