CHƯƠNG 6 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO TRONG CHỌN TẠO GIỐNG THỰC VẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO TRONG CHỌN TẠO GIỐNG THỰC VẬT
6.2. Chọn tạo dòng biến dị giao tử
114 6.2.1. Cơ sở khoa học của biến dị giao tử
Vật liệu di truyền trong các tế bào và mô được phân bố một cách bình thường như nhau thông qua quá trình nguyên phân. Ngược lại ở các giao tử, chúng là sản phẩm của quá trình giảm phân, nhận một nữa vật liệu di truyền theo các quy luật phân ly độc lập.
Do đó, các tế bào đơn bội được hình thành từ giảm phân là nguồn nguyên liệu chính để chọn tạo các biến dị giao tử. Để phân biệt các dòng soma có nguồn gốc soma và các dòng giao tử có nguồn gốc giao tử, người ta dùng 3 thông số khác nhau.
- Thứ nhất, cả hai loại gene đột biến lặn và trội cảm ứng bởi biến dị dòng giao tử sẽ biểu hiện trực tiếp ở các cây đơn bội tái sinh từ tiểu bào tử của các bao phấn vì chúng sẽ có chỉ một bản sao của mỗi gene. Điều này cho phép phân tích trực tiếp các dòng giao tử (R0) để xác định các thể biến dị mới.
- Thứ hai, các thể tái tổ hợp phát triển trong các dòng giao tử sẽ là kết quả của tổ hợp chéo giảm phân.
- Thứ ba, dòng giao tử có thể được dùng chỉ sau khi có được sự ổn định nhờ gấp đôi số lượng nhiễm sắc thể của nó.
Hầu hết các loài cây trồng đều có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến là nhị bội (2n) và tứ bội (4n). Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều bị hai hay nhiều allen của một gene chi phối. Nếu đó là những cá thể dị hợp tử, tức là các gene trong mỗi hệ gene nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính trạng của gene đó hoàn toàn tùy thuộc vào tính trạng lặn hay trội của chúng quyết định. Vì vậy, mức bội thể lý tưởng để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng phải là mức đơn bội (1n) hoặc các mức đa bội khác nhưng chúng phải đồng nhất tuyệt đối.
Giá trị của cây đơn bội trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống đã được phát hiện từ lâu. Kể từ khi Blakeslee (1921) mô tả cây đơn bội xuất hiện trong tự nhiên đầu tiên ở Datura stramonium, nhiều cây đơn bội đã được tìm thấy ở rất nhiều loài khác nhau. Tuy vậy, các thể đơn bội tự nhiên xuất hiện một cách ngẫu nhiên với tần suất rất thấp không thể đáp ứng yêu cầu của nghiên cứu và chọn giống. Năm 1964, lần đầu tiên trên thế giới, hai nhà khoa học ấn Độ Guha và Maheshwari thành công trong việc tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn in vitro cây cà rốt Datura innoxia. Ngay sau đó, cây đơn bội đã được tạo ra bằng nuôi cấy bao phấn ở hàng loạt cây trồng khác nhau. Các
115
nhà khoa học đã tìm ra những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thành công của quá trình nuôi cấy như ảnh hưởng của kiểu gene, giai đoạn phát triển của hạt phấn và các điều kiện môi trường nuôi cấy. Ngoài nuôi cấy bao phấn, các nhà khoa học còn có những thành công rất lớn trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh, nuôi cấy hạt phấn tách rời.
Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào tử hoặc đại bào tử trong nuôi cấy hạt phấn và noãn cho phép tạo ra nhanh chóng hàng loạt cây đơn bội, phục vụ đắc lực cho mục đích nghiên cứu di truyền và tạo giống cây trồng. Hai phương pháp nuôi cấy tạo cây đơn bội hiện nay là:
- Nuôi cấy tiểu bào tử tách rời hay còn gọi là trinh sinh đực trong ống nghiệm;
- Nuôi cấy tế bào trứng chưa thụ tinh hay còn gọi là phương pháp trinh sinh cái trong ống nghiệm.
Vật liệu ban đầu cho quá trình nuôi cấy in vitro tạo cây đơn bội thường là:
- Bao phấn, hạt phấn tách rời, cụm hoa
Cụm hoa hay được áp dụng cho những loài có hoa nhỏ - Phôi sau lai xa:
Khi lai xa giữa hai loài lúa mạch Hordeum vulgare và H. bulbosum, quá trình thụ phấn phôi đơn bội xảy ra, nhưng nội nhũ của phôi đơn bội lại không phát triển. Sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi đã cứu được những phôi này và tạo ra hàng loạt cây đơn bội (Jensen, 1977);
- Noãn thụ tinh giả:
Đây là quá trình thụ phấn nhưng không xảy ra sự thụ tinh. Mặc dù vậy, tế bào trứng vẫn được kích thích phát triển thành cây đơn bội.
- Noãn chưa thụ tinh:
Trong số các vật liệu trên, bao phấn, hạt phấn tách rời và noãn chưa thụ tinh là những nguồn nguyên liệu quan trọng, được sử dụng phổ biến hơn để tạo cây đơn bội.
116 6.2.2. Các kiểu hình thành cây đơn bội in vitro
Nuôi cấy tạo cây đơn bội là cần thiết để thu được các dòng biến dị giao tử. Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của thực vật được gọi là sinh sản đơn tính đực. Người ta phân biệt 3 phương thức sinh sản đơn tính đực:
- Sinh sản đơn tính trực tiếp từ tiểu bào tử:
Tiểu bào tử trong bao phấn → Phôi → Cây đơn bội (n = 1). Cấu trúc dạng phôi phát triển trực tiếp từ hạt phấn. Quá trình này thường xảy ra trong bao phấn, ví dụ điển hình là ở cây thuốc lá, cà rốt.
- Sinh sản vô tính qua callus:
Tiểu bào tử trong bao phấn → Callus → Chồi → Cây đơn bội (n = 1). Cây hoàn chỉnh phát triển từ khối callus, khối mô này thường phát triển ra ngoài bao phấn, ví dụ điển hình ở một số cây như lúa, cải, đại mạch.
- Sinh sản đơn tính hỗn hợp:
Giai đoạn phát triển callus xảy ra rất ngắn và khó nhận biết, ví dụ ở cây cà rốt và cà chua.
6.2.3. Các bước phát triển phôi của hạt phấn
Bình thường sau khi được giải phóng từ tứ tử hạt phấn chứa một nhân, giai đoạn này được gọi là giai đoạn hạt phấn đơn nhân. Sau đó nhân chia đôi tạo thành một nhân dinh dưỡng và một nhân sinh sản. Nhân sinh sản lại chia đôi tạo thành hai tinh tử (giai đoạn nảy mầm tạo thành ống phấn) làm nhiệm vụ thụ tinh kép cho noãn và nội nhũ của túi phôi. Sunderland (1970) cho rằng trong nuôi cấy in vitro, bước phát triển đầu tiên của hạt phấn vẫn xảy ra như bình thường cho tới giai đoạn hai nhân. Quá trình tạo phôi thường bắt đầu từ nhân sinh sản, nhân sinh dưỡng hay cả hai nhân, song chủ yếu là nhân sinh dưỡng, trong khi nhân sinh sản chỉ phân chia một vài lần rồi ngừng hẳn. Có trường hợp ngoại lệ cây đơn bội phát triển từ nhân sinh sản nhưng thường rất yếu. Cũng có ý quan sát cho rằng phần lớn phôi Hyoscyanus niger thu được bằng nuôi cấy bao phấn có nguồn gốc nhân sinh sản. Về nguyên tắc, thì kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho phép tạo được đơn bội bằng nhiều phương thức khác nhau, nhưng phương thức bắt đầu từ tiểu bào tử vẫn là tiện lợi nhất.
117
6.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn 6.2.4.1. Kiểu gene của cây cho bao phấn
Kiểu gene của cây mẹ có vai trò rất quan trọng trong việc xác định tần số sản xuất cây hạt phấn. Ở lúa mì, tần số cảm ứng của callus hạt phấn và sự tạo thành cây xanh tiếp sau đó được điều khiển bởi nhiều gene. Mỗi kiểu gene khác nhau tương ứng với phản ứng sinh sản đơn tính khác nhau trong nuôi cấy bao phấn. Vì thế, đây là vấn đề cần lưu ý để chọn lọc chỉ các kiểu gene có phản ứng cao, còn hơn là tập trung chú ý đến việc cải thiện các điều kiện cho hệ thống nuôi cấy trong nuôi cấy bao phấn.
6.2.4.2. Thành bao phấn
Hạt phấn của một giống thuốc lá sẽ phát triển thành phôi ngay cả khi chuyển vào bao phấn của một giống khác. Chính kết quả này đã đưa ra khái niệm “nhân tố thành”
và nó giúp đỡ cho nhiều nhà nghiên cứu sử dụng “hiệu ứng bảo mẫu” của bao phấn hoàn chỉnh để phát triển sinh sản đơn tính ở các hạt phấn phân lập của nhiều loài.
Dịch chiết của bao phấn cũng có tác dụng kích thích sản xuất phôi hạt phấn. Các nghiên cứu về mô học đã xác định vai trò của nhân tố thành bao phấn trong việc phát triển phôi hạt phấn. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy glutamine riêng rẽ hoặc phối hợp với serine và myo-inositol có thể thay thế nhân tố thành bao phấn trong các thí nghiệm nuôi cấy hạt phấn phân lập.
6.2.4.3. Môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gene và tuổi của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng. Sinh sản đơn tính tiểu bào tử ở Nicotiana tabacum và Datura innoxia có thể được cảm ứng trên môi trường agar đơn giản chỉ chứa sucrose. Hạt phấn tiếp tục phát triển trên môi trường như thế cho đến giai đoạn hình cầu. Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môi trường. Tuy nhiên, hầu hết các loài thuộc họ Solanaceae chỉ phát triển sinh sản đơn tính trên môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh bao gồm các loại muối khoỏng, vitamin và sucrose của Nitsch hoặc MS. Muối Fe (40 àM Fe-EDTA hoặc Fe- EDDHA) dường như quyết định chủ yếu cho sự phát triển phôi của hạt phấn 3 hoặc 4 tuần tuổi trong quá trình nuôi cấy.
118
Ở các loài không thuộc họ Solanaceae, thành phần môi trường bao gồm: các chất điều khiển sinh trưởng và các hỗn hợp dinh dưỡng phức tạp (như dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nuớc dừa). Môi trường N6 sau đó cũng được sử dụng cho nuôi cấy bao phấn của các loại ngũ cốc khác như lúa, lúa mạch đen. Trong khi nhiều loài cần có auxin và/hoặc cytokinin để cảm ứng sinh sản đơn tính thì đa số các loài thuộc họ Solanaceae chỉ cần môi trường cơ bản. Sucrose là một thành phần không thể thay thế của môi trường, thông thường người ta sử dụng ở nồng độ 2 - 4% nhưng các loài như Brassica cần nồng độ khoảng 10%. Thay thế sucrose bằng cách bổ sung glutathione, ascorbic acid và glucose cũng có tác dụng tương tự, kích thích sinh sản đơn tính ở lúa mạch đen. Bổ sung than hoạt tính hoặc 2-chloroethyl-phosphate vào môi trường nuôi cấy cũng có tác dụng kích thích sinh sản đơn tính ở một số hệ thống nuôi cấy.
6.2.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng
Gây shock nhiệt sẽ tăng tần số sinh sản đơn tính tiểu bào tử. Xử lý lạnh ở 3oC hoặc 5oC/72 giờ kích thích hạt phấn phát triển thành phôi (xấp xỉ 58%) ở một số loài thuộc họ Solanaceae (Datura, Nicotiana). Ngược lại, bao phấn được duy trì ở 22oC trong cùng thời gian chỉ cho khả năng phát triển phôi khoảng 21%. Nói chung, gây shock nhiệt từ 2 - 5oC/72 giờ có tác dụng kích thích sự phát triển không bình thường của giao tử đực và tích lũy hạt phấn đơn nhân (ức chế sự phát triển tiếp ở các giai đoạn sau). Cụm hoa hình chùy được tách rời của lúa khi xử lý ở 13oC/10 - 14 ngày cho tần số hạt phấn tạo callus cao nhất. Cảm ứng sinh sản đơn tính sẽ có hiệu quả cao nếu bao phấn của các loại ngũ cốc khác (lúa, ngô, pennisetum) được bảo quản ở nhiệt độ thấp trước khi nuôi cấy.
Một số kết quả nghiên cứu cho thấy tiền xử lý bao phấn ở nhiệt độ 35oC đã kích thích sinh sản đơn tính ở một số loài Brassica và Capsicum. Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng, mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối. Tuy nhiên, các hạt phấn phân lập dường như mẫn cảm với ánh sáng hơn so với bao phấn. Ánh sáng trắng cưòng độ thấp hoặc ánh sáng huỳnh quang đỏ kích thích phát triển nhanh hơn của phôi trong nuôi cấy hạt phấn thuốc lá phân lập so với với ánh sáng trắng cường độ cao.
119 6.2.4.5. Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn
Bao phấn tách từ cây sinh trưởng trong điều kiện ngày ngắn (8 giờ/ngày) và ở vùng có cường độ ánh sáng cao cho phản ứng tương đối tốt hơn so với cây dài ngày (16 giờ/ngày) có cùng cường độ chiếu sáng. Sự phát sinh phôi hạt phấn có thể được cải thiện nhiều hơn nếu nhiệt độ dưới điều kiện ngày ngắn duy trì ở 18oC. Sự thay đổi mùa vụ thích hợp và tuổi cây cho bao phấn ảnh hưởng lớn đến phản ứng của các hạt phấn. Xử lý cây bằng cách bơm thuốc trừ sâu hoặc các chất độc khác cần phải được tránh. Cây thiếu nitrogen có thể ảnh hưởng xấu đến bao phấn hơn so với cây được cung cấp đủ nitrogen. Vì thế, có thể khuyến cáo rằng chỉ có những nguyên liệu sinh trưởng ở các điều kiện môi trường được điều chỉnh tốt chẳng hạn như nhà kính mới có thể dùng cho việc sinh sản đơn tính tiểu bào tử.