CHƯƠNG 7 BẢO TỒN NGUỒN GENE IN VITRO BẢO TỒN NGUỒN GENE IN VITRO
8.4. Các phương pháp phân tích acid nucleic
Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) hay còn gọi là phản ứng khuếch đại DNA. Đây là một kỹ thuật in vitro được sử dụng để tạo ra các bản sao từ một trình tự khuôn mẫu DNA ban đầu theo cấp lũy thừa. Kỹ thuật này được phát triển năm 1983 bởi Kary Mullis, một kỹ thuật phố biến và với nhiều ứng dụng khác nhau.
a. Nguyên lý
Sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao, DNA khuôn mẫu được tách thành hai mạch đơn. Tiếp đó, hai đoạn oligonucleotide, gọi là mồi xuôi và mồi ngược, được thiết kế có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA mục tiêu sẽ bám vào các sợi đơn tương ứng. Qua đó, trình tự DNA mới được tổng hợp dưới xúc tác của một DNA polymerase chịu nhiệt (ví dụ: Taq polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một loài vi khuẩn sống ở các suối nước nóng, hay Pfu polymerase từ loài cổ khuẩn Pyrococcus furiosus sống ở môi trường nhiệt độ cao, do đó polymerase của chúng là enzyme chịu nhiệt). Các sự kiện này diễn ra ở điều kiện nhiệt độ thích hợp, tạo thành một chu kì nhiệt. Với sự lặp lại của chu kì nhiệt, số chu kì có thể lên đến 40, các trình tự DNA sẽ được khuếch đại rất nhiều lần (Hình 8.5).
b. Các bước của chu kỳ nhiệt
Mỗi chu kỳ nhiệt của PCR gồm 3 bước sau:
- Biến tính (denaturation) ở nhiệt độ 90 - 95: là giai đoạn tách 2 mạch của phân tử DNA khuôn mẫu thành sợi đơn.
- Gắn primer (annealing) ở nhiệt độ 40 - 65℃: các đoạn mồi gắn vào vị trí có trình tự bổ sung trên DNA khuôn mẫu.
- Kéo dài mạch DNA (extension) ở nhiệt độ 70 - 72℃: khoảng nhiệt độ phù hợp để DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới từ vị trí đoạn mồi, theo chiều 5’→3’.
145
Thời gian ở mỗi bước tuỳ thuộc vào chiều dài, trình tự của đoạn DNA đích và các đoạn mồi thiết kế.
c. Một số lưu ý
Để PCR đạt được kết quả mong muốn, cần lưu ý một số điểm sau:
- DNA khuôn mẫu phải nguyên vẹn và không chứa các thành phần ức chế phản ứng xúc tác của enzyme;
- Trình tự đoạn mồi được thiết kế để khuếch đại đoạn DNA phải đặc hiệu. Cần tránh tạo ra các cấu trúc thứ cấp giữa trình tự mồi xuôi và mồi ngược;
- Nhiệt độ để gắn mồi trong chu trình nhiệt phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của đoạn mồi. Do đó, cần hạn chế sự chênh lệch giữa nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược.
d. Ứng dụng
PCR là kỹ thuật phố biến và không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu y học và sinh học với nhiều ứng dụng khác nhau như:
- Nhân bản ADN để giải trình tự;
- Phát hiện các trình tự mục tiêu cho nhiều mục đích khác nhau từ các đối tượng;
- Phân lập và tái tổ hợp các trình tự DNA quan tâm.
Hình 8.5. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase PCR (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)
DNA đích
146 8.4.1.2. Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược
a. Nguyên lý
Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược (RT - PCR) là kỹ thuật khuếch đại các trình tự DNA từ đoạn mRNA khuôn mẫu với sự tham gia của enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase.
Một phản ứng khuếch đại DNA bằng RT - PCR bao gồm hai giai đoạn:
- Tổng hợp sợi DNA bổ sung (cDNA) từ mRNA khuôn mẫu: Đầu tiên, mạch cDNA thứ nhất được tổng hợp từ mRNA khuôn mẫu bằng enzyme phiên mã ngược. Tiếp theo đó, đoạn mRNA khuôn mẫu được phân huỷ bằng enzyme Rnase H và mạch cDNA thứ hai được tổng hợp bằng mồi xuôi (được thiết kế dựa theo trình tự mRNA đã biết).
- Khuếch đại đoạn cDNA: Các bước khuếch tương tự như PCR.
b. Các kiểu kỹ thuật RT - PCR
Hai giai đoạn của RT - PCR có thể được thực hiện đồng thời trong một phản ứng PCR (còn gọi là kỹ thuật one - step) hoặc trong hai phản ứng riêng biệt (còn gọi là kỹ thuật two - step).
- Kỹ thuật one - step: Các enzyme và thành phần tham gia phản ứng được bổ sung đồng thời khi thiết lập phản ứng. Kỹ thuật này đơn giản, hạn chế sai sót trong quá trình phản ứng và nhiễm mẫu, phù hợp với số lượng mẫu lớn. Tuy nhiên, vì điều kiện phản ứng phải phù hợp cho cả hai giai đoạn tổng hợp và khuếch đại cDNA, kỹ thuật one - step đôi khi có độ nhạy thấp và kém hiệu quả hơn;
- Kỹ thuật two - step: Phản ứng tổng hợp cDNA thực hiện trước, sau đó bổ sung DAN polymerase cho phản ứng khuếch đại DNA. Việc tách rời hai giai đoạn phản ứng giúp tối ưu hóa điều kiện của mỗi giai đoạn, linh hoạt hơn khi lựa chọn, điều chỉnh các thành phần phản ứng phù hợp với mục tiêu của thí nghiệm. Tuy nhiên, so với kỹ thuật one - step thì cần nhiều thời gian và thao tác hơn, do đó tăng nguy cơ nhiễm mẫu và những sai khác trong kết quả.
c. Ứng dụng
147
Sự ra đời của kỹ thuật RT - PCR mang lại nhiều ứng dụng hữu ích trong nghiên cứu. Kỹ thuật này được ứng dụng chủ yếu để tổng hợp cDNA từ đoạn mRNA. Qua đó, phục vụ cho việc tạo dòng các trình tự quan tâm hoặc phân tích biểu hiện gene.
8.4.1.3. Real-time PCR a. Nguyên lý
Khác với kỹ thuật PCR thông thường, sản phẩm DNA khuếch đại được định lượng khi mỗi chu kỳ nhiệt kết thúc. Kỹ thuật real-time PCR định lượng DNA trong sau mỗi chu kỳ khuếch đại bằng cách phân tích tín hiệu huỳnh quan phát ra. Tín hiệu này tỉ lệ thuận với lượng DNA được tạo ra theo hàm mũ, qua đó giúp tính toán được lượng DNA khuôn mẫu ban đầu. Các bước phản ứng của real-time PCR gần như tương tự như PCR, chỉ khác ở thành phần sử dụng để giám sát quá trình phản ứng.
b. Các phương pháp xác định sản phẩm PCR
Có hai phương pháp thường được ứng dụng để thu nhận tín hiệu phản ứng là sử dụng mẫu dò TaqMan (TaqMan probe) và nhuộm màu SYBR Green.
- Mẫu dò TaqMan:
Phương pháp sử dụng mẫu dò TaqMan dựa trên hoạt tính 5’-nuclease của DNA polymerase. Sau khi biến tính để tách hai mạch DNA, ngoài 2 đoạn mồi bám vào khuôn mẫu còn có một đoạn oligonucleotide gọi là mẫu dò TaqMan hay mẫu dò chỉ thị (reporter probe) bổ sung với một phần của đoạn DNA cần khuếch đại. Đoạn oligonucleotide này được được đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang tại đầu 5’ (F-fluorescence) và một tín hiệu hấp thụ huỳnh quang tại đầu 3’ (Q-quencher). Trong quá trình kéo dài mạch DNA, DNA polymerase gặp và bắt đầu phá huỷ đoạn reporter probe (5’-nuclease), dọn đường cho mạch DNA đang được tổng hợp. Khi reporter probe bị phá huỷ, tín hiệu huỳnh quang bị tách rời khỏi tín hiệu hấp thụ và bắt đầu phát quang (Hình 8.6). Toàn bộ phản ứng diễn ra trong một huỳnh quang kế (fluorimeter) để thu nhận lượng tín hiệu phát quang phát ra qua mỗi chu kỳ PCR.
Nếu mẫu dò được thiết kế tốt, phương pháp này cần rất ít điều chỉnh để tối ưu hóa.
Đồng thời, nếu kết hợp với các cặp tín hiệu F/Q đặc hiệu, ta có thể ứng dụng để thực
148
hiện các phản ứng kép (multiplex assay). Tuy nhiên, việc tổng hợp các mẫu dò TaqMan có thể rất tốn kém, khi mỗi một mẫu dò chỉ có thể sử dụng cho một trình tự quan tâm.
Hình 8.6. Cơ chế phản ứng real-time PCR sử dụng phương pháp mẫu dò TaqMan (Weaver, 2021)
- Màu nhuộm SYBR Green:
Màu nhuộm SYBR Green là phương án đơn giản và kinh tế hơn để định lượng DNA thông qua phản ứng PCR. Đây là loại phân tử gắn vào mạch DNA đôi và phát ra tín hiệu ánh sáng dưới kích thích phù hợp. Vì vậy khi lượng sản phẩm PCR tăng lên thì tín hiệu huỳnh quang cũng tăng lên.
Ưu điểm của phương pháp này là giá thành rẻ, dễ sử dụng cùng với độ nhạy cao.
Tuy nhiên, một điểm cần lưu ý là phân tử SYBR Green sẽ bám vào bấy kỳ cấu trúc DNA mạch đôi nào, kể cả các cấu trúc thứ cấp tạo nên từ đoạn mồi hay các sản phẩm không đặc hiệu khác, gây thay đổi kết quả phân tích định lượng DNA. Bên cạnh đó, dù bản thân nguyên liệu màu nhuộm (và các thành phần khác của phản ứng PCR) có giá thành hợp lý, việc phát hiện tín hiệu màu huỳnh quang đòi hỏi nhiều công đoạn tối ưu hóa.
Đồng thời, một số phản ứng khác cũng cần được kết hợp để xác nhận kết quả phân tích do tín hiệu thu được từ màu nhuộm SYBR Green không phân biệt các sản phẩm đặc hiệu hay không đặc hiệu.
149 c. Ứng dụng
Real-time PCR là công cụ hữu ích với nhiều ứng dụng trong nghiên cứu và thực tiễn. Hai trường hợp ứng dụng điển hình:
- Phân tích định lượng trình tự mục tiêu trong các ứng dụng chẩn đoán y học;
- Phân tích mức độ biểu hiện của gene mục tiêu.
8.4.2. Các phương pháp lai phân tử
8.4.2.1. Nguyên lý chung của các phương pháp lai phân tử
Các phương pháp lai phân tử được thiết lập dựa trên sự bắt cặp của hai đoạn DNA/RNA sợi đơn có trình tự bổ sung ở trong điều kiện phản ứng thích hợp. Qua đó phát hiện sự tồn tại của một trong hai phân tử nhờ vào sự hình thành của thể lai. Các phương pháp lai sử dụng một đoạn DNA/RNA sợi đơn gọi là mẫu dò (probe), mẫu dò có trình tự bổ sung với trình tự mục tiêu. Các mẫu dò được đánh dấu bằng tín hiệu phóng xạ hoặc huỳnh quang, qua đó giúp phát hiện sự hình thành thể lai. Các phân tử DNA sợi đôi cần được biến tính để tạo sợi đơn trước khi thực hiện phản ứng lai trên một màng lai thích hợp. Các màng lai thường làm bằng vật liệu nylon hoặc nitrocellulose. Tuỳ thuộc vào tính chất của các phân tử acid nucleic và cách thức thực hiện phản ứng lai, các phương pháp lai khác nhau đã được phát triển cho nhiều ứng dụng thực tiễn.
8.4.2.2. Lai Southern a. Nguyên lý
Lai Southern (Southern hybridization/blotting) là phương pháp được phát triển cho mục đích lai hai đoạn DNA. Trình tự DNA mục tiêu được dò tìm bằng một mẫu dò DNA có trình tự bổ sung.
b. Các bước của phương pháp lai
Giả sử ta có một phân tử DNA rất lớn (có thể là nhiễm sắc thể của loài A), và mục tiêu là xác định vị trí của một gene (đã được tìm thấy trước đó trên loài B) trên phân tử DNA đó. Trước tiên, hệ gene hoặc nhiễm sắc thể của loài A cần được cắt thành các đoạn nhỏ (bằng enzyme cắt giới hạn) sau đó tách ra bằng điện di gel agarose. Để xử lý các phân tử DNA sợi đôi thành sợi đơn, gel được ngâm vào một dung dịch có tính kiềm (ví
150
dụ: NaOH). Tiếp đó, các phân tử DNA sợi đơn trên gel được chuyển qua một màng lai.
Lớp màng này sẽ được nhúng vào dung dịch chứa các mẫu dò DNA (từ đoạn gene tìm được trên loài B) được đánh dấu và cuối cùng mang đi phân tích thông qua xác định các mẫu dò bằng tín hiệu phóng xạ hoặc huỳnh quang (Hình 8.7).
c. Ứng dụng
Một số ứng dụng của lai Southern có thể kể đến: xác định sự có mặt của một trình tự quan tâm, xác định sinh vật biến đổi gene nhờ xác nhận sự có mặt của gene ngoại lai
Hình 8.7. Minh hoạ quy trình lai Southern (Weaver, 2021)
151
trên hệ gene, xây dựng bản đồ enzyme cắt giới hạn, so sánh sự khác nhau giữa các hệ gene.
8.4.2.3. Lai Northern a. Nguyên lý
Khác với lai Southern, lai Northern là phương pháp được thiết lập cho phản ứng lai giữa mẫu dò DNA với trình tự mục tiêu là RNA.
b. Các bước của phương pháp lai
Đầu tiên, RNA tổng số của mẫu được tách chiết đảm bảo độ tinh khiết, nguyên vẹn. Đây là bước quan trọng bởi RNA thường không bền vững, dễ bị phá hủy do enzyme RNase. Tiếp theo, RNA tổng số được phân tách bằng điện di gel biến tính (ví dụ: bằng urea hoặc bằng formaldehyde), sau đó chuyển qua cố định trên màng lai. Bổ sung đoạn mồi để tiến hành phản ứng lai giữa mồi và các RNA được cố định trên màng. Các mồi không liên kết với RNA trên màng lai sẽ được rửa trôi. Sau đó, màng lai được làm khô và sử dụng để xác định sự có mặt của RNA quan tâm.
c. Ứng dụng
Kỹ thuật Northern thường được ứng dụng để xác định sự có mặt của mRNA và mức độ biểu hiện của gene tương ứng. So với RT - PCR, lai Northern có độ nhạy thấp hơn. Do đó đối với trường hợp gene quan tâm có mức biểu hiện thấp hoặc mẫu RNA tổng quá ít, RT - PCR thường được lựa chọn để đánh giá mức độ biểu hiện của gene hơn.
8.4.2.4. Phương pháp lai tại chỗ
Trong các phương pháp lai Southern và Northern, mẫu DNA/RNA được phân lập từ tế bào để thực hiện phản ứng lai. Tuy nhiên, phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) xác định sự có mặt của các trình tự DNA/RNA mục tiêu ngay trong môi trường tế bào. Ví dụ điển hình là phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang (fluorescence in situ hybridization). FISH sử dụng các mẫu dò DNA sẽ được đánh dấu bằng tín hiệu huỳnh quang, do đó kết quả thí nghiệm sẽ được quan sát bằng một kính hiển vi huỳnh quang. Phương pháp này được ứng dụng để xác định vị trí của gene quan tâm trên nhiễm
152
sắc thể, hoặc quan sát mức độ biểu hiện gene thông qua xác nhận sự hiện diện của mRNA tương ứng.
8.4.2.5. Lai khuẩn lạc
Lai khuẩn lạc là kỹ thuật dùng để chọn lọc dòng vi khuẩn mang gene quan tâm bằng cách sử dụng mẫu dò bổ sung với gene đó. Đầu tiên, các khuẩn lạc trên đĩa petri được chuyển sang một màng lai, sau đó xử lý để ly giải các tế bào vi khuẩn và biến tính DNA. Dưới tác dụng của nhiệt hoặc tia UV, các phân tử DNA được cố định trên màng lai bằng các liên kết cộng hóa trị. Tiếp theo, màng lai được ngâm vào dung dịch chứa các mẫu dò đã được đánh dấu để hình thành các phân tử lai với DNA trên màng. Các mẫu dò không bám hoặc bám không hoàn toàn được rửa trôi và màng lai được sử dụng để xác định các khuẩn lạc mang gene quan tâm.
8.4.3. Các phương pháp giải trình tự DNA 8.4.3.1. Phương pháp dideoxy
a. Nguyên lý
Phương pháp dideoxy, hay còn gọi là phương pháp Sanger, là phương pháp xác định trình tự DNA dựa sự kết thúc phản ứng tổng hợp chuỗi của DNA polymerase bởi các phân tử dideoxynucleotide (ddNTP) đã bị mất nhóm hydroxyl ở vị trí đầu 3’ của phân tử đường.
Nhóm 3’- OH cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì thiếu nhóm chức này nên nucleotide tiếp theo không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Ngược lại, phản ứng kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH vẫn tiếp tục nếu các deoxynucleotide (dNTP) được gắn vào. Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau khi phản ứng tổng hợp kết thúc sẽ hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA được hiển thị trên bản gel điện di để xác định trình tự DNA.
153
Hình 8.9. Minh hoạ quá trình đọc trình từ bằng phương pháp Sanger (Weaver, 2021)
Hình 8.8. Các sản phẩm hình thành từ các phản ứng với các loại ddNTP khác nhau bằng phương pháp Sanger (Weaver, 2021)
Chú thích: Đoạn mẫu DNA cần giải trình tự (template)
154 b. Các bước thực hiện
- Bước 1: Sợi DNA mạch đơn cần giải trình tự được trộn với các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR, sau đó chia làm 4 phần. Mỗi phần chứa một loại ddNTP với nồng độ thấp hơn rất nhiều lần so với nồng độ dNTP dùng cho phản ứng PCR. Kết quả của phản ứng PCR sẽ tạo thành các đoạn DNA có kích thước khác nhau một nucleotide tuỳ thuộc vào vị trí gắn vào (ngẫu nhiên) của ddNTP (Hình 8.8).
- Bước 2: Sản phẩm phản ứng được phân tách trên gel điện di polyacrylamide trong thiết bị giải trình tự. Các gel được chế tác dưới dạng các sợi có kích thước nhỏ
- Bước 3: Xác định trình tự đoạn DNA cần phân tích. Căn cứ vào tín hiệu phát ra từ phản ứng, trình tự DNA được phân tích bằng phần mềm để hiển thị kết quả trên máy tính.
8.4.3.2. Phương pháp pyrosequencing a. Nguyên lý
Phương pháp này thuộc nhóm phương pháp giải trình tự hiệu năng cao (high- throughput sequencing) hay giải trình tự thế hệ thứ hai (next generation sequencing, NGS). Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng một loại DNA polymerase (thường là đoạn Klenow của DNA polymerase I) nhân đôi đoạn DNA cần giải trình tự và theo dõi mỗi dNTP được thêm vào (real-time) bằng cách nhận diện phân tử pyrophosphate (PPi) hình thành từ phản ứng. PPi sinh ra tham gia chuỗi phản ứng tiếp theo để tạo ra tín hiệu được máy tính ghi nhận và thể hiện bằng một đỉnh trong biểu đồ gọi là pyrogram (Hình 8.10).
Hình 8.10. Chuỗi phản ứng phát ra tín hiệu ánh sáng trong phương pháp pyrosequencing
Bốn loại dNTPs lần lượt được thêm vào phản ứng kéo dài mạch DNA, loại dNTP trước sẽ được loại bỏ trước khi loại dNTP tiếp theo được thêm vào (phụ thuộc vào hệ