CHƯƠNG 6 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO TRONG CHỌN TẠO GIỐNG THỰC VẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO TRONG CHỌN TẠO GIỐNG THỰC VẬT
6.1. Chọn tạo dòng biến dị soma
Kỹ thuật chọn tạo dòng tế bào đã ra đời rất sớm trong các nghiên cứu liên quan vi sinh vật. Nhưng ở thực vật bậc cao, kỹ thuật này mới được ứng dụng cách đây khoảng hơn hai thập kỉ. Người ta có thể tiến hành xử lý và chọn lọc các dòng tế bào thực vật từ 3 dạng nguyên liệu chính là callus, tế bào đơn và tế bào trần.
Mục đích chọn tạo dòng biến dị soma gồm:
- Chọn dòng tế bào chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường (chịu nóng, lạnh, phèn, mặn, khô hạn...);
- Chọn dòng tế bào kháng các độc tố do nấm bệnh tiết ra, các loại kháng sinh;
- Chọn dòng tế bào sản xuất dư thừa các loại sản phẩm;
110
- Chọn các đặc điểm chỉ thị để nghiên cứu di truyền.
Hiện tượng biến dị di truyền thường xuất hiện tự nhiên ở các tế bào không phân hóa, các tế bào đơn, thậm chí các mô nuôi cấy in vitro. Nguyên nhân của biến dị chủ yếu là do những thay đổi về số lượng và cấu trúc của nhiễm sắc thể. Tính không đồng nhất của tế bào trong nuôi cấy tăng lên do các nhân tố sau:
- Nhiễm sắc thể ở trạng thái khảm hoặc có rối loạn di truyền ở các tế bào mẫu cấy ban đầu;
- Các tính trạng mới không theo quy luật do các điều kiện nuôi cấy gây ra.
Trong nuôi cấy mô, các kiểu thay đổi như thế thường bị loại bỏ khi mục đích chính là tăng các quá trình nuôi cấy ổn định di truyền. Những nghiên cứu gần đây cho thấy các mô và tế bào nuôi cấy thường trải qua những thay đổi di truyền như: đa bội (polyploidy), lệch bội (aneuploidy), đứt gãy nhiễm sắc thể (chromosomal breakage), khuyết đoạn (deletion), chuyển đoạn (translocation), khuếch đại gen (gene amplification), và đột biến (mutation). Những thay đổi này biểu hiện ở mức độ sinh hóa hoặc phân tử. Như vậy, nuôi cấy mô và tế bào thực vật có khả năng tạo biến dị di truyền tương đối nhanh và không cần phải ứng dụng các kỹ thuật phức tạp khác. Biến dị di truyền trong nuôi cấy mô có thể biểu hiện ở sự thay đổi tính trạng của các cây tái sinh.
Tính trạng thay đổi này có thể truyền sang thế hệ sau bằng phương thức nhân giống hữu tính hoặc dinh dưỡng.
6.1.2. Cơ sở khoa học của biến dị soma
Các biến dị xuất hiện như là kết quả của những thay đổi tinh vi do các đột biến gene ở hệ gene nhân xuất hiện trong nuôi cấy. Các đột biến lặn không phát hiện được trong những tái sinh in vitro từ các tế bào hoặc mô bất kỳ, nhưng biểu hiện ở thế hệ tiếp theo khi tự thụ phấn. Thế hệ F1 phân ly tính trạng quan tâm theo quy luật Mendel với tỷ lệ 3:1. Biến dị dòng soma của các đột biến lặn đơn gene cũng đã được tìm thấy ở nhiều cây trồng như ngô, lúa và lúa mì.
Những thay đổi trong hệ gene của tế bào chất cũng được quan sát ở các dòng soma. Ở cây ngô có hai tính trạng thuộc tế bào chất: (1) mẫn cảm với độc tố chiết từ Drechslera maydis nòi T, một tác nhân gây bệnh rụi lá, và (2) tế bào chất bất dục đực Texas (cms-T). Cả hai tính trạng này được mã hoá bởi các gene thuộc hệ gene ty thể.
111
Một hướng khác của đột biến đơn gene trong biến dị dòng soma liên quan đến nhân tố gọi là gen nhảy. Năm 1982, Chourey và Kemble đã phát hiện sự biến dị như là kết quả của sự xen đoạn của các DNA giống plasmid trong hệ gen ty thể của nuôi cấy tế bào ngô. Những thay đổi cảm ứng bằng gene nhảy được nghiên cứu chi tiết hơn ở các dòng thuốc lá, alfalfa và lúa mì.
Biến dị dòng soma xuất hiện cũng có thể do những thay đổi phân tử gây ra do hiện tượng trao đổi chéo nguyên phân ở các cây tái sinh. Hiện tượng này bao gồm hai trường hợp biến dị đối xứng và bất đối xứng. Những thay đổi nhỏ trong cấu trúc của các nhiễm sắc thể có thể dẫn đến những thay đổi về sự biểu hiện và chuyển giao di truyền của các gene đặc trưng, như: khuyết đoạn và nhân đoạn của một bản sao (hoặc nhiều bản sao) của một gene, hoặc sự biến đổi gen trong các quá trình sửa chữa. Sự tái tổ hợp về sau, hoặc đứt gãy nhiễm sắc thể ở vùng ưu tiên hoặc các “điểm nóng” di truyền của các nhiễm sắc thể dẫn đến thay đổi kiểu hình.
Các nghiên cứu gần đây cũng đã chứng minh rằng sự xuất hiện của những thay đổi trong DNA cơ quan tử thông qua hồ sơ protein và isoenzyme liên quan với sự xuất hiện của biến dị dòng soma ở một số loài thực vật như: lúa mì, lúa, khoai tây, ngô, lúa mạch và lanh.
6.1.3. Các yêu tố ảnh hưởng đến biến dị soma 6.1.3.1. Kiểu gene và mẫu vật
Kiểu gene ảnh hưởng lên tần số tái sinh cây và tần số biến dị soma. Ví dụ, một nghiên cứu khả năng tái sinh ở các thể đa bội của 18 thứ khác nhau của hai giống lúa cho thấy chỉ tái sinh được nhiều dạng bội thể khác nhau ở thứ indica mà không tái sinh được ở thứ japonica.
Mẫu vật được sử dụng từ nhiều nguồn mô khác nhau như: lá, rễ, lóng, bầu quả và hoa tự. Nguồn mẫu vật được xem là rất quan trọng trong việc xuất hiện biến dị soma.
Nghiên cứu ở cây phong lữ (geranium) cho thấy các biến dị soma có thể thu được từ cành giâm cuống lá hoặc rễ in vivo, nhưng không thể từ cành giâm của thân. Cây dứa (Ananas cosmosus) phát triển từ callus của hom giâm, chồi đỉnh và chồi nách cho thấy chỉ có sự biến đổi ở đặc điểm của gai (spine), trong khi các cây phát triển từ callus của quả tụ cho thấy có sự biến dị ở màu lá, gai, lớp sáp và tán lá. Một quan sát khác cho thấy
112
có sự thay đổi hình thái ở 12,3% cây khoai tây tái sinh từ mảnh lá, ngược lại có tới 50,3% các cây biến dị có nguồn gốc từ callus của cuống bông và cuống lá. Các tác nhân chọn lọc khác nhau được sử dụng dựa vào các nguồn mẫu vật khác nhau trong nuôi cấy, tạo ra một dãy biến dị soma giữa các cây tái sinh.
6.1.3.2. Chất điều hòa sinh trưởng
Nồng độ cao của các chất điều khiển sinh trưởng ảnh hưởng đến sự thay đổi của kiểu nhân trong các tế bào nuôi cấy. 2,4-D cảm ứng biến dị nhiễm sắc thể ở các cây tái sinh trong nuôi cấy mô của lúa mạch và khoai tây khi hiện diện ở nồng độ cao trong môi trường. Tương tự, các dòng biến dị soma của các loài Nicotiana thu được từ mẫu lá trên môi trường có cung cấp BAP từ 5 - 10 mM. Các chất điều hoà sinh trưởng rất cần thiết cho cảm ứng phát sinh cơ quan và phân hóa chồi. Tuy nhiên, nồng độ cao của các chất này không cho phép tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy mô, và tỷ lệ chất điều hoà sinh trưởng trong môi trường cần được điều chỉnh cẩn thận trong các hệ thống nuôi cấy nhân giống in vitro để tạo ra các dòng biến dị soma.
6.1.4. Các phương pháp chọn tạo dòng biến dị soma 6.1.4.1. Phương pháp chọn trực tiếp
Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biệt về hình thái có thể chọn được dòng tế bào từ quần thể tế bào. Một số dòng có khả năng kháng kháng sinh, kháng các chất đồng đẳng của amino acid hoặc chống chịu muối cũng có thể chọn trực tiếp từ quần thể tế bào. Hệ thống tế bào hay được sử dụng là các tế bào dịch huyền phù hoặc callus.
Điều kiện chọn lọc ở đây là các độc tố với nồng độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào. Những tế bào có khả năng phân chia trong môi trường chứa độc tố với nồng độ tăng dần từ lần cấy chuyển này đến lần cấy chuyển khác được sàng lọc dần (chọn bậc thang). Bên cạnh đó, có thể đưa cả quần thể tế bào vào điều kiện môi trường ức chế sinh trưởng hoàn toàn để chọn ra những tế bào sống sót; tuy nhiên ngưỡng tối đa của mức độ hoặc nồng độ tác nhân chọn lọc cần phải được thăm dò trước nếu không có thể ức chế sự phát triển của các tế bào đột biến trong quần thể tế bào nuôi cấy.
Thông thường, người ta trộn tế bào vào môi trường thạch chứa độc tố và chọn những tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo, hoặc cũng có thể cấy trực tiếp lên môi
113
trường chọn lọc chứa độc tố. Dòng chống chịu thường xuất hiện từ một phần của khối tế bào nuôi cấy.
6.1.4.2. Phương pháp chọn tạo gián tiếp
Trong trường hợp này đặc điểm của dòng được chọn là kết quả biểu hiện khuyết của tế bào. Ví dụ điển hình là chọn dòng thiếu enzyme nitrate reductase (NR). Trên môi trường chứa ClO những tế bào có NR sử dụng -3 ClO như -3 NO và khử thành -3 ClO-2,
-
ClO2 có tác dụng như một độc tố cho nên chỉ có những tế bào không có NR mới sống sót trên môi trường chọn lọc.
6.1.4.3. Phương pháp chọn tổng thể
Các tế bào soma dị dưỡng thường được chọn bằng phương thức xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến, ví dụ đột biến lặn chịu được S-2-aminoethyl cysteine xuất hiện sau khi xử lý đột biến phôi nuôi cấy.
Các dạng biến đổi chọn được trong nuôi cấy in vitro thường xuất hiện với tần số 10-5 - 10-8 khi không xử lý đột biến. Nếu xử lý sẽ tăng được tần số đó lên 10 lần.
Các tác nhân gây đột biến thường được sử dụng là:
- Ethylmethane sulphonate (EMS);
- N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine (MNNG);
- N-ethyl-nitrosourea (ENU);
- Tia X hoặc tia UV.
Chưa có số liệu cụ thể về nồng độ, phổ và tần số đối với từng loại tác nhân bởi vì độ lớn của khối tế bào được xử lý, mật độ tế bào nuôi cấy trên đĩa petri và số nhiễm sắc thể cũng như kiểu nhân của tế bào bị xử lý. Sử dụng protoplast có thể là cách tiếp cận tốt nhất để giải quyết vấn đề này.