KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP, BẢO QUẢN VÀ HOẠT HÓA TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ
3.2.1. Kết quả chọc hút mô mỡ và phân lập SVF
Bảng 3.11. Kết quả phân lập SVF từ mô mỡ (n = 42)
Chỉ tiêu Khối lƣợng mỡ (gram)
Số lƣợng TB/gram
Tỷ lệ TB sống (%)
Tỷ lệ TB CD90+ (%)
± SD
154,37
± 36,61
1,5 x 106
± 0,5 x 106
98,06
± 0,76
3,9
± 1,27 Nhận xét:
Đã chọc hút mỡ thành công, xử lý và phân lập được SVF, bảo quản và hoạt hóa được TBG mô mỡ của 42/42 (100%) bệnh nhân THK trong nhóm
nghiên cứu. Khối lượng mỡ trung bình hút được là 154,37 ± 36,61 gram. Số lượng SVF là 1,5 ± 0,5 x106 tế bào/gram mỡ. Tỷ lệ tế bào sống ngay sau phân lập là 98,06 ± 0,76 %. Với 06 mẫu được xét nghiệm CD90, quần thể tế bào SVF có chứa 3,9 ± 1,27% các tế bào mang dấu ấn CD90+ của TBG trung mô.
3.2.2. Chất lƣợng tế bào gốc mô mỡ sau phân lập và bảo quản 3.2.2.1. Tỷ lệ tế bào sống
Bảng 3.12. Tỷ lệ tế bào sống của SVF sau phân lập và bảo quản (n = 42) Tỷ lệ tế bào
sống (%)
Sau phân lập cho lần tiêm 1
Sau bảo quản cho lần tiêm 2
Sau bảo quản cho lần tiêm 3
± SD 98,06 ± 0,76 97,53 ± 0,87 97,07 ± 0,67
p > 0,05
Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ tế bào sống của SVF trước và sau khi bảo quản (n = 42) (Tỷ lệ lần 1: tế bào ngay sau khi phân lập; Tỷ lệ lần 2: tế bào sau khi bảo
quản 2 tháng; Tỷ lệ lần 3: bảo quản tế bào sau 4 tháng) Nhận xét:
Tỷ lệ tế bào sống ở các thời điểm: ngay sau khi phân lập (lần tiêm 1), sau bảo quản 2 tháng (lần tiêm 2) và sau bảo quản 4 tháng (lần tiêm 3) lần
lượt là 98,06 ± 0,76%, 97,53 ± 0,87% và 97,07 ± 0,67%. Kết quả sau khi bảo quản đông lạnh ở -196o C tỷ lệ % tế bào sống sau giải đông lạnh thấp hơn so với mẫu sau phân lập dùng tươi không qua bảo quản (lần tiêm 1), tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
3.2.2.2. Nuôi cấy phân lập tế bào gốc trung mô và cấy khuẩn các mẫu tế bào gốc mô mỡ sau phân lập và bảo quản
Ngoài tiêu chuẩn về tỷ lệ tế bào sống, các mẫu tế bào sau khi phân lập, bảo quản được nuôi cấy phân lập TBG trung mô và cấy khuẩn để đánh giá chất lượng tế bào.
Hình 3.1. Các sản phẩm của quá trình phân lập TBG mô mỡ
A: Mô mỡ sau khi rửa và xử lý với enzym; B: Huyền dịch tế bào đơn từ mô mỡ sau khi đã xử lý phá tế bào mỡ và loại mỡ; C: Phân đoạn SVF sau khi ly
tâm rửa; D: TBG mô mỡ sau nuôi cấy phân lập (100X)
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, cả 42/42 (100%) mẫu SVF nuôi cấy đều thu được TBG trung mô. Sản phẩn sau nuôi cấy phân lập được cấy chuyển nuôi cấy tăng sinh và bảo quản để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Mỗi mẫu SVF được chia làm 3 phần để sử dụng cho 3 lần tiêm khớp. Sản phẩm của mỗi lần tiêm đều được cấy khuẩn kiểm tra, kết quả 126/126 (100%) mẫu cấy khuẩn sau phân lập và bảo quản đều cho kết quả âm tính.
3.2.2.3. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mô mỡ
Hình 3.2. Nuôi cấy tăng sinh TBG từ mô mỡ
A: 0 giờ; B: sau 24 giờ; C: sau 6 ngày; D: sau 8 ngày (200X)
Hình 3.3. Hình ảnh TBG mô mỡ nhuộm Giemsa
A: sau 24 giờ (200X); B: sau 8 ngày (100X); C: sau 8 ngày (400X) Nhận xét:
Các TBG từ mô mỡ sau nuôi cấy trong môi trường phân lập chọn lọc, các TBG trung mô thu được là các tế bào có khả năng bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy, có dạng hình thoi giống nguyên bào sợi, có xu hướng mọc thành từng đám sau đó tạo lớp tế bào đơn trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Khi nhuộm bắt mầu thuốc nhuộm rõ với hình ảnh là tế bào đơn nhân, bào tương trải rộng dạng hình thoi.
3.2.2.4. Phân tích dấu ấn bề mặt tế bào
Trong nghiên cứu này đã thực hiện phân tích 06 mẫu tế bào thu được sau phân lập bằng kỹ thuật flowcytometry phân tích sự biểu hiện một số protein bề mặt của TBG trung mô.
Bảng 3.13. Mức độ biểu hiện dấu ấn bề mặt CD90, CD105, CD13, CD34, CD45, HLA-DR trên tế bào nuôi cấy sau cấy chuyển lần 3 (P3) (n=06) C
Dấu ấn bề mặt CD90 CD105 CD13 CD34 CD45 HLA-DR
Tỷ lệ dương tính (%) ( ± SD)
97,20
± 1,74
94,00
± 3,48
89,85
± 6,39
0,45
± 0,36
0,77
± 0,63
0,43
± 0,11
Hình 3.4. Kết quả phân tích biểu hiện một số dấu ấn bề mặt của TBG mô mỡ sau khi cấy chuyển lần 3 (P3)
Nhận xét: Kết quả phân tích biểu hiện dấu ấn bề mặt trên 06 mẫu tế bào nuôi ở thế hệ thứ 3 (lần cấy chuyển thứ 3). Với một panel các dấu ấn dương tính và âm tính được phân tích, kết quả cho thấy các mẫu tế bào đều âm tính với các dấu ấn CD34, CD45 và HLA-DR và dương tính với các dấu ấn CD90, CD105 và CD13 (mức độ dương tính cao trên 90%), là kiểu biểu hiện các dấu ấn đặc trưng của TBG trung mô.
3.2.2.5. Khả năng tạo CFU-F trên in vitro của tế bào gốc mô mỡ
Để xác định tế bào phân lập được có phải là TBG hay không, bên cạnh các đánh giá về đặc điểm bám dính, hình thái tế bào, dấu ấn bề mặt; chúng tôi
đánh giá hoạt động chức năng tạo tạo CFU-F khi nuôi cấy in vitro. Giếng nuôi cấy tế bào sau phân lập được nhuộm Giemsa sau đó quan sát bằng mắt thường cho thấy có các đám tế bào nằm tập trung thành từng đám tạo thành hình ảnh các cụm tế bào (colony) (hình 3.5A) là các đám tế bào có nguồn gốc từ một tế bào ban đầu phát triển thành các tế bào thế hệ con cháu nằm tập trung trong cùng một vị trí (hình 3.5B).
Hình 3.5. Khả năng tạo CFU-F của TBG mô mỡ
Nhận xét: Kết quả thu được từ đánh giá khả năng tạo CFU-F cho thấy các tế bào thu nhận từ mô mỡ không chỉ có đặc điểm hình thái, dấu ấn bề mặt đặc trưng của TBG trung mô, các tế bào này còn thể hiện chức năng của TBG qua khả năng tăng sinh tạo cụm tế bào.