4.2. HIỆU QUẢ CỦA CÁC QUY TRÌNH PHÂN LẬP, BẢO QUẢN VÀ HOẠT HÓA TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ
4.2.2. Chất lƣợng tế bào gốc mô mỡ sau phân lập và bảo quản
Các TBG mô mỡ phân lập được dưới dạng SVF được hoạt hóa và sử dụng ngay để điều trị hoặc được bảo quản đông lạnh rồi lấy ra điều trị sau.
Trước khi tiêm cho bệnh nhân, khối tế bào SVF được lấy mẫu để tiến hành các xét nghiệm kiểm tra vi khuẩn học và tỷ lệ tế bào còn sống. Kết quả 100%
các mẫu TBG được cấy khuẩn đều âm tính, chứng tỏ các qui trình chọc hút mỡ, quy trình phân lập TBG được đảm bảo vô khuẩn tuyệt đối, khối tế bào SVF tiêm vào khớp gối đảm bảo an toàn về mặt vi khuẩn học. Tuy nhiên
trong thực tế điều trị, chúng tôi vẫn dùng kháng sinh dự phòng như các trường hợp phẫu thuật khác và kết quả là không gặp trường hợp nào bị nhiễm khuẩn tại các vị trí hút mỡ và vị trí tiêm TBG.
Chất lượng của tế bào sau phân lập, hoạt hóa và sau bảo quản là yếu tố quan trọng quyết định kết quả điều trị. Thông qua phân tích hình thái tế bào, các dấu ấn bề mặt để xác định các loại tế bào có trong chế phẩm tế bào phân lập từ mô mỡ, khả năng tăng sinh tạo CFU-F và biệt hóa in vitro thành tế bào giống tế bào sụn là các chỉ số quan trọng góp phần giải thích các cơ chế tác dụng của việc sử dụng TBG mô mỡ hoạt hóa bằng HTGTC tự thân và ánh sáng đơn sắc trong điều trị bệnh THK gối.
4.2.2.1. Tỷ lệ tế bào sống sau phân lập và sau bảo quản
Tỷ lệ tế bào còn sống trong khối tế bào SVF được tiêm cho bệnh nhân là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng của khối tế bào SVF. Quá trình hút mỡ, phân lập tế bào ngoài cơ thể để tách chiết các TBG có thể gây hư hại và làm chết một số tế bào. Do đó chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ tế bào còn sống trong khối tế bào SVF trước khi tiêm cho bệnh nhân bằng phương pháp loại trừ thuốc nhuộm Trypan Blue, dựa trên nguyên lý các tế bào sống có màng còn nguyên vẹn nên không ngấm thuốc nhuộm Trypan Blue và sáng màu khi soi tươi trên kính hiển vi quang học, trong khi các tế bào chết bị ngấm Trypan Blue nên bắt màu xanh. Đây là một kỹ thuật đơn giản, có thể tiến hành trong thời gian 10-20 phút. Theo kết quả ở bảng 3.12, tỷ lệ tế bào sống trong khối tế bào SVF là 98,06 ± 0,76%, cho thấy quá trình hút mỡ và phân lập tế bào của chúng tôi đảm bảo được sự toàn vẹn và sống sót của tế bào trong khối tế bào SVF. Kết quả này tương tự như nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thanh Bình (2011) khi tách chiết thành phần tế bào đơn nhân từ dịch hút tủy xương, nghiên cứu của Mai Trọng Khoa (2014) phân tách TBG từ mô mỡ trong điều trị THK, tỷ lệ tế bào sống sau xử lý đều trên 95% [2], [10]. Một kỹ thuật xác định tỷ lệ tế bào sống phức tạp hơn là sử dụng máy tự động theo
nguyên lý tế bào dòng chảy dựa vào đặc điểm tán xạ ánh sáng và khả năng hấp thu propidium iodide của tế bào. Tuy kỹ thuật này khách quan hơn nhưng khá phức tạp, đòi hỏi trang thiết bị cũng như hóa chất đắt tiền nên chúng tôi chưa áp dụng được.
Để đảm bảo tốt cho các lần điều trị cũng như các nghiên cứu khác, chúng tôi tiến hành bảo quản tế bào trong môi trường bổ sung 10% DMSO để ở -1960C. Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản 2 tháng (lần tiêm 2) và sau bảo quản 4 tháng (lần tiêm 3) lần lượt là 97,53 ± 0,87% và 97,07 ± 0,67% (biểu đồ 3.2).
Kết quả sau khi bảo quản đông lạnh ở -196oC, tỷ lệ tế bào sống sau giải đông lạnh thấp hơn so với mẫu sau phân lập dùng tươi không qua bảo quản (lần tiêm 1), tuy nhiên kết quả này cũng khá tốt đủ điều kiện để sử dụng trong điều trị THK và các nghiên cứu tiếp theo.
4.2.2.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc mô mỡ
Nuôi cấy phân lập chọn lọc và tăng sinh các TBG là bước khởi đầu của công nghệ TBG. Các kết quả bước đầu mà đề tài đem lại có ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong việc tạo nguồn TBG là nguyên liệu để cung cấp cho những nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo. Ngoài ra còn đánh giá cho việc tế bào sau khi phân lập còn sống và còn khả năng nuôi cấy được hay không. Các tế bào được nuôi cấy thời gian từ 2 đến 3 ngày thì thay môi trường và kiểm tra tình trạng phát triển của các tế bào. Hình 3.1 đến 3.3 cho thấy, các tế bào thu nhận được nuôi cấy sau khoảng 6-8 ngày là tế bào đã trải rộng, có dạng hình thoi đặc trưng và tiếp tục tăng sinh, hợp dòng và trải đều trên bề mặt đĩa nuôi cấy.
4.2.2.3. Phân tích dấu ấn bề mặt tế bào
Từ sự đa dạng về biểu hiện dấu ấn bề mặt cũng như TBG trung mô có thể phân lập được từ nhiều mô khác nhau của cơ thể trưởng thành, để thống nhất kết quả nghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, Hội liệu pháp tế bào quốc tế (ISCT) đã quy định những tiêu chuẩn tối thiểu nhằm xác định TBG trung mô [41]. Căn cứ vào tiêu chuẩn nhận biết này, đề tài tiến
hành các tiêu chí đánh giá tế bào một cách đa dạng để trả lời câu hỏi: liệu tập hợp tế bào thu được sau các quy trình phân lập và nuôi cấy có phải là tập hợp TBG trung mô như mong muốn hay không? Các tiêu chuẩn nhận biết TBG trung mô của ISCT được cụ thể hóa, phù hợp với khả năng thực hiện trong khuôn khổ của đề tài. Theo quy định này, các TBG trung mô biểu hiện các dấu ấn bề mặt CD90, CD73, CD105 và âm tính với các dấu ấn CD14, CD34, CD45 và HLA-DR [41]. Một dấu ấn được cho là âm tính khi được đánh giá bằng kĩ thuật flow cytometry phải có tỉ lệ phần trăm dương tính nhỏ hơn 2%
trong tổng số tế bào dương tính. Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy, tế bào từ mô mỡ đều âm tính với các dấu ấn theo tiêu chuẩn là CD34, CD45 và HLA-DR. Theo quy định, một dấu ấn được cho là dương tính khi phân tích bằng kĩ thuật flow cytometry cho tỉ lệ dương tính từ 95% trở lên. Trong 3 dấu ấn cần yêu cầu dương tính, nghiên cứu này đã phân tích dấu ấn CD90, CD105 và cho thấy tỉ lệ dương tính cao hơn 95%.
Các dấu ấn CD14, CD45 và HLA-DR biểu hiện dương tính trên các tế bào dòng máu. CD14 là kháng nguyên bề mặt ở các tế bào momocyt/đại thực bào có trọng lượng phân tử 53-55 kDa. CD45 là một glycoprotein xuyên màng được mã hóa bởi các gen nằm trên nhiễm sắc thể số 1, có trọng lượng 180-220 kDa, nó là marker bề mặt của hầu hết các tế bào bạch cầu, trong đó chủ yếu là bạch cầu hạt và bạch cầu lympho. CD34 là một glucoprotein xuyên màng trọng lượng khoảng 110 kDa có chức năng kết dính tế bào, xuất hiện trên TBG định hướng tạo máu. Một số nghiên cứu cho rằng TBG trung mô nguyên thủy cũng biểu hiện mức độ thấp đối với CD34, nhưng kháng nguyên này mất dần trong quá trình nuôi cấy ngoài cơ thể. HLA-DR là kháng nguyên bạch cầu người lớp II có bản chất là glycoprotein biểu hiện trên các tế bào trình diện kháng nguyên như: tế bào mono/đại thực bào, lympho B, biểu mô tuyến ức và tế bào đuôi gai. Quần thể TBG trung mô thường được phân lập từ các mô, vì vậy việc chúng lẫn với các tế bào máu rất dễ xảy ra. Việc đưa ra
yêu cầu những tế bào thu nhận là TBG trung mô khi không phải là tế bào thuộc dòng máu là hoàn toàn hợp lý.
Cùng với các bằng chứng về sự biểu hiện các marker bề mặt âm tính, việc xác định biểu hiện các marker bề mặt dương tính của TBG trung mô phải được tiến hành. Không có marker dương tính nào cho đến nay được xác định là đặc hiệu cho TBG trung mô bởi các marker này có thể biểu hiện trên nhiều loại tế bào khác nhau. Các marker bề mặt dương tính của TBG trung mô được chúng tôi lựa chọn bao gồm: CD13, CD90, CD105 và được phân tích trên máy đếm tế bào dòng chảy FC-500 (Beckman Coulter – Mỹ).
CD90 là một protein có kích thước 25-37 kDa có trên bề mặt tế bào tương tự với một vùng (domain) của immunoglobulin. Protein này được phát hiện đầu tiên ở tế bào tuyến ức. Hiện nay, protein này được sử dụng như là marker của nhiều loại TBG khác nhau. Từ trước đến nay, CD90 được xem như là một dấu ấn protein quan trọng để nhận diện TBG trung mô.
CD105 là một glycoprotein týp 1 nằm trên bề mặt tế bào có trọng lượng phân tử 170-180 kDa và là thành phần của phức hợp receptor TGF beta.
Protein này hiện diện trong quần thể nhỏ tế bào trong mô máu mà được gọi là tế bào trung mô. Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng protein này để nhận diện TBG trung mô, tuy nhiên cũng còn gặp nhiều khó khăn vì nó biểu hiện trên nhiều dòng tế bào khác, kể cả nguyên bào sợi.
Các dấu ấn CD13, CD44 và CD166 tuy không được cho là tiêu chuẩn khẳng định TBG trung mô nhưng gần đây chúng được sử dụng nhiều trong định danh TBG trung mô từ máu dây rốn, Wharton’s jelly, tủy xương. CD13 (Amino peptidase N - APN) là một protease xuyên màng, có biểu hiện ở các TBG và một số giai đoạn trong quá trình biệt hóa tế bào đơn nhân, bạch cầu hạt, được coi là marker của quá trình biệt hóa bạch cầu. Tương tự, CD44 và CD166 là hai protein bám dính trên bề mặt tế bào, biểu hiện mạnh trong các dòng tế bào biểu mô (CD44) hay nguyên bào sợi (CD166) giúp tế bào bám
dính vào chất nền. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dòng TBG trung mô thu được có dương tính với CD13 nhưng dương tính tương đối yếu.
Từ kết quả nghiên cứu panel cả dấu ấn âm tính và dương tính cho thấy hỗn hợp tế bào SVF tách chiết từ mô mỡ có chứa quần thể các TBG trung mô (bảng 3.13, hình 3.4).
4.2.2.4. Khả năng tạo CFU-F trên in vitro của tế bào gốc mô mỡ
Tính gốc của TBG được đánh giá bằng các thử nghiệm in vitro và in vivo, trong đó các thử nghiệm tạo CFU trên in vitro và biệt hóa in vitro thường được tiến hành do tính thuận tiện và khả thi của kỹ thuật nhất là với các TBG của người không cho phép đánh dấu tế bào rồi cấy ghép vào người để khảo sát in vivo. Mặt khác, bản chất của nghiên cứu này là nghiên cứu ứng dụng, trong đó các thử nghiệm đánh giá tính gốc được xem như các thử nghiệm kiểm tra chất lượng của tế bào hơn là chứng minh lại về mặt học thuật các tế bào thu được trong phân đoạn SVF có chứa TBG và các TBG có trong SVF là TBG trung mô.
Thử nghiệm nuôi cấy CFU-F của TBG trung mô từ tủy xương cũng đã được tác giả Nguyễn Thanh Bình và CS (2011) thực hiện [2]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi nuôi cấy khối tế bào SVF cả hoạt hóa và không hoạt hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc đều xuất hiện các CFU-F (hình 3.5 và 3.6) là minh chứng cho thấy các TBG trong sản phẩm được tiêm vào ổ khớp gối của bệnh nhân còn khả năng tăng sinh tạo thành các thế hệ tế bào con cháu. Khả năng tăng sinh mạnh của TBG tạo cụm tế bào trên in vitro cho phép kỳ vọng về khả năng tăng sinh của các TBG sau khi tiêm vào ổ khớp có thể tăng sinh để vừa tăng cường số lượng tế bào non, vừa phát huy tác dụng lâu dài trong quá trình điều trị.