PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. Phương phỏp nghiờn cứu bệnh ủạo ụn tại tỉnh Bắc Ninh năm 2012-2013
3.5.1. Phương phỏp ủiều tra bệnh ủạo ụn tại tỉnh Bắc Ninh năm 2012-2013
- Lấy số liệu thống kê từ Chi cục Bảo vệ thực vật Bắc Ninh.
- Phỏng vấn cỏn bộ lónh ủạo và cỏn bộ kỹ thuật của Chi cục Bảo vệ thực vật Bắc Ninh, cỏc trạm Bảo vệ thực vật ủể lấy thụng tin và số liệu.
3.5.1.2. ðiều tra tỡnh hỡnh bệnh ủạo ụn tại tỉnh Bắc Ninh trong vụ xuõn năm 2012
- Ruộng ủiều tra: Trờn mỗi giống, mỗi ủợt gieo cấy khỏc nhau, mỗi chõn ủất khỏc nhau, cỏnh ủồng khỏc nhau lấy 3 ruộng ủại diện.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng ủiều tra theo phương phỏp 10 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, khúm ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2m.
- Chỉ tiờu ủiều tra: ðiều tra số lỏ, bụng bị bệnh và phõn cấp lỏ, bụng bị bệnh ủể tớnh tỷ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%).
- Thời gian ủiều tra: Giai ủoạn lỳa ủẻ nhỏnh, ủứng cỏi, làm ủũng, trỗ, chín sáp.
3.5.1.3.ðiều tra diễn biến bệnh ủạo ụn tại tỉnh Bắc Ninh trong vụ xuõn năm 2012 - Ruộng ủiều tra: chọn ruộng ủại diện và ủiển hỡnh cho từng loại ủiều tra.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng ủiều tra theo phương phỏp 10 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, khúm ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất là 2m.
- Chỉ tiờu ủiều tra: ðiều tra số lỏ, bụng bị bệnh và phõn cấp lỏ, bụng bị bệnh ủể tớnh tỷ lệ (%) và chỉ số bệnh (%).
- Thời gian ủiều tra: 7 ngày ủiều tra một lần.
3.5.1.4 ðiều tra ảnh hưởng của thời vụ ủến phỏt triển của bệnh ủạo ụn tại tỉnh Bắc Ninh trong vụ xuân năm 2012
- Ruộng ủiều tra: Trờn mỗi giống, mỗi ủợt gieo cấy khỏc nhau, mỗi loại chõn ủất khỏc nhau, cỏnh ủồng khỏc nhau: lấy 3 ruộng ủại diện.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng ủiều tra theo 10 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, mỗi khúm 1 dảnh cõy ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2 một.
- Chỉ tiờu ủiều tra: ðiều tra số lỏ, bụng bị bệnh và phõn cấp lỏ, bụng bị bệnh ủể tớnh chỉ số bệnh %, tỷ lệ bệnh %.
- Thời gian ủiều tra: Giai ủoạn lỳa ủẻ nhỏnh, bắt ủầu làm ủũng, ủũng non, ủũng già và trỗ.
3.5.1.5. ðiều tra ảnh hưởng của mật ủộ ủến phỏt triển của bệnh ủạo ụn tại tỉnh Bắc Ninh trong vụ xuân năm 2012
Ruộng ủiều tra: Trờn mỗi giống, mỗi ủợt gieo cấy khỏc nhau, mỗi loại chõn ủất khỏc nhau, cỏnh ủồng khỏc nhau: lấy 3 ruộng ủại diện.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng ủiều tra theo 10 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, mỗi khúm 1 dảnh cõy ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2 một.
- Chỉ tiờu ủiều tra: ðiều tra số lỏ, bụng bị bệnh và phõn cấp lỏ, bụng bị bệnh ủể tớnh chỉ số bệnh %, tỷ lệ bệnh %.
3.5.1.6. ðiều tra ảnh hưởng của mức bún ủạm ủến phỏt triển của bệnh ủạo ụn tại tỉnh Bắc Ninh trong vụ xuân năm 2012
Ruộng ủiều tra: Trờn mỗi giống, mỗi ủợt gieo cấy khỏc nhau, mỗi loại chõn ủất khỏc nhau, cỏnh ủồng khỏc nhau: lấy 3 ruộng ủại diện.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng ủiều tra theo 10 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, mỗi khúm 1 dảnh cõy ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2 một.
- Chỉ tiờu ủiều tra: ðiều tra số lỏ, bụng bị bệnh và phõn cấp lỏ, bụng bị bệnh ủể tớnh chỉ số bệnh %, tỷ lệ bệnh %.
3.5.2. Phương phỏp thu thập mẫu lỳa bị bệnh ủạo ụn vụ xuõn năm 2012 tại tỉnh Bắc Ninh và phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav. từ các mẫu thu thập ủược
3.5.3.1. Phương phỏp thu thập mẫu bệnh ủạo ụn vụ xuõn năm 2012 tại tỉnh Bắc Ninh
Căn cứ vào diện tớch lỳa, mức ủộ phổ biến của bệnh ủạo ụn trong vụ xuõn 2012 trờn ủồng ruộng, chỳng tụi cựng với lónh ủạo và cỏn bộ kỹ thuật của Chi cục Bảo vệ thực vật Bắc Ninh tiến hành lấy mẫu lỳa bị bệnh ủều trong tỉnh.
Cõy lỳa bị bệnh ủược nhổ cả cõy (gồm thõn, rễ, lỏ), gúi cỏch ly, ủưa về cấy tại nhà lưới của khoa Nông học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðối với cây lỳa bị bệnh ủạo ụn cổ bụng, cắt lấy bụng lỳa bị bệnh sao cho vết bệnh ở giữa ủoạn mẫu ủược cắt, sau ủú cũng ủược gúi cỏch ly ủem về phũng thớ nghiệm.
Mẫu thu ủược phải cú cỏc thụng tin: số thứ tự, tờn giống, tờn thụn xó huyện, tên tỉnh nơi thu thập mẫu.
Thời gian thu thập mẫu từ thỏng 3 ủến thỏng 5 năm 2012 trong ủú thu thập mẫu lỳa bị ủạo ụn lỏ chủ yếu vào cuối thỏng 3 – ủầu thỏng 4, thu thập mẫu lỳa bị ủạo ụn cổ bụng vào cuối thỏng 4 – ủầu thỏng 5
3.5.3.2. Phương phỏp phõn lập nấm theo phương phỏp ủơn bào tử.
Thu mẫu bệnh: Nhổ cả khúm lỳa bị bệnh, ủem về trồng trong chậu riờng từng giống, ủể trong nhà lưới rõm, mỏt, dựng nhón bằng giấy ghi tờn giống lỳa, ngày lấy mẫu, ủịa ủiểm lấy mẫu buộc vào từng khúm lỳa.
Phân lập nấm Pyricularia oryzae.
Lấy lá lúa tươi có vết bệnh, rửa sạch dưới vòi nước, cho 1ml nước sạch vào ống nghiệm, cắm lỏ lỳa vào trong ống nghiệm ủể 15 – 20 giờ bào tử sẽ ủược hỡnh thành trờn bề mặt vết bệnh, lấy lỏ lỳa này ra khỏi ống nghiệm.
Lấy ủĩa WA (Water agar) cầm ỳp mặt thạch, gấp ủoạn lỏ hoặc cổ bụng có vết bệnh theo hình tam giác, dùng panh cặp và dính nhẹ vết bệnh vào bề mặt thạch ủể bào tử dớnh vào mặt ủĩa WA, dựng bỳt dạ khoanh khu vực ủặt vết bệnh ủể khi ủưa lờn kớnh hiểm vi dễ quan sỏt bào tử. Dựng panh lấy một ít bông thấp nước, nhúng vào cồn 96% rồi khử trùng kim thủy tinh, ô kính hiểm vi.
ðưa ủĩa WA cú bào tử lờn kớnh hiểm vi quan sỏt và nhẹ nhàng lấy bào tử vào ủầu kim thủy tinh (ủiều chỉnh kớnh và kim thủy tinh sao cho mỗi lần khờu lấy chớnh xỏc một bào tử cấy). Vặn cho vật kớnh lờn cao, ủưa ủĩa WA và cho ủĩa PSA vào theo chiều ỳp mặt thạch xuống phớa dưới, dựng bỳt dạ khoanh trũn 4 khoanh ở 4 gúc của ủĩa, rồi từ từ thả bào tử từ ủầu kim thủy tinh vào nơi cú ủỏnh dấu khoanh trũn trờn ủĩa PSA. Mỗi khoanh trũn một bào tử (mỗi ủĩa PSA thả 4 bào tử)
ðưa ủĩa cú nấm vào buồng cấy vụ trựng, Dựng que cấy cắt một miếng WA ủó cú một bào tử dớnh ở ủú, cấy vào mụi trường PSA trong ống nghiệm, ủể ở nhiệt ủộ 260C- 280C cho nấm phỏt triển. ðõy là nguồn nấm Pyricularia oryzae thuần dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.3.3. Phương phỏp xỏc ủịnh chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav.
Chuẩn bị cõy lỳa: Ngõm hạt lỳa 36 giờ sau ủú ủ cho hạt giống nẩy mầm, ủem gieo vào cỏc khay nhụm cú bựn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống 1 hàng, mỗi hàng 10 hạt. Sau ủú chăm súc cho cõy phỏt triển bỡnh thường. Sau khi gieo khoảng 20-22 ngày (lỳc ủú lỳa cú 3-4 lỏ) thỡ phun dung dịch bào tử ủể lõy bệnh
Chuẩn bị nguồn bào tử ủể lõy bệnh: Nguồn nấm ủược lõy từ ống PSA nghiờng cấy vào ủĩa mụi trường cỏm agar mỗi mẫu phõn lập cấy 2 ủĩa, mỗi ủĩa cấy 3 ủiểm, sau ủú ủặt ủĩa ủó cấy vào tủ ủịnh ụn 260C - 280C trong 2 tuần.
Trong thời gian ủú sợi nấm sẽ mọc kớn mụi trường. Lấy ủĩa mụi trường ra khỏi tủ, dựng bỡnh tia phun nước cất khụng ion vào và dựng chổi lụng quột ủi quột lại nhiều lần trờn mặt ủĩa, dựng bỡnh tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho khô hết nước quét khô mặt thạch (Mỗi mẫu phân lập rửa bằng một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sôi).
Cỏc ủĩa nấm trong tủ 12 giờ sỏng ủến 12 giờ tối sau 3 ngày ủể bào tử hỡnh thành. Dựng nước cất vụ trựng Tween 20 với nồng ủộ 1/10000 ủể rửa và lọc bào tử (20ml nước cất ủể rửa bào tử cho 1 ủĩa Petri). Lấy một giọt dung dịch bào tử ở dung dịch ủó rửa nhỏ lờn lam và ủặt lờn soi dưới kớnh hiển vi. ðếm số bào tử trờn quang trường 10X, ủếm 3 quang trường. ðiều chỉnh dung dịch bào tử ủể sao cho cú khoảng 30-50 bào tử trờn quang trường tương ủương với 105 bào tử/ml. (ủếm bào tử của 5 quang trường 10X).
* Lây nhiễm:
Sử dụng bỡnh phun cầm tay loại cú thể tớch 0.5l ủể phun dung dịch bào tử lờn cỏc khay lỳa. Phun ướt ủều khắp cỏc lỏ lỳa rồi ủặt cỏc khay lỳa ủó ủược lây nhiễm vào trong tủ lây nhiễm. Phun mù giữ ẩm liên tục trong vòng 20h (ẩm ủộ >90%), sau ủú ủem lỳa ủó lõy nhiễm ra khỏi nhà lưới ủặt dưới ỏnh sỏng tỏn xạ ủồng thời tưới nước ủầy ủủ cho lỳa ủể lỳa vẫn tiếp tục phỏt triển.
* đánh giá:
Sau khi lõy bệnh ủược 7 ngày kiểm tra mức ủộ bệnh của từng cõy lỳa, lỏ lỳa. Thang ủiểm ủỏnh giỏ theo Kato (1993).
Mức kháng:
Cấp 0: Không có vết bệnh – kháng cao (HR).
Cấp 1: Vết bệnh là một chấm nhỏ bằng ủầu kim – khỏng (R).
Cấp 2: Vết bệnh to hơn, màu nõu nhạt ủến nõu tối – khỏng (R).
Mức nhiễm:
Cấp 3: Vết bệnh to hơn và có màu sám ở giữa – nhiễm (S).
Cấp 4: Vết bệnh ủặc trưng hỡnh thoi – nhiễm nặng (HS).
Cấp 0,1,2: Kháng bệnh. Cấp 3,4: Nhiễm bệnh.
đánh giá phản ứng kháng bệnh ựạo ôn của 12 giống lúa chỉ thị của Nhật Bản với các mẫu phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav. bằng phương pháp lõy bệnh nhõn tạo. Mỗi giống lỳa này ủều cú gen khỏng bệnh ủạo ụn khỏc nhau ủó ủược xỏc ủịnh và ủược mó húa bằng cỏc chỉ số.
Từ kết quả phản ứng của 12 giống lúa với phân lập nấm Pyricularia oryzae Cav. (isolate): Dựa trên mã số của các giống và phản ứng kháng, nhiễm bệnh của chỳng ủể xỏc ủịnh cỏc chủng sinh lý (race) nấm Pyricularia oryzae Cav. bằng cách cộng tất cả các mã số của các giống lúa có phản ứng nhiễm bệnh (vết bệnh cấp 3,4) lại với nhau theo thứ tự hàng thập phân, hàng ủơn vị, hàng chục và hàng trăm.