PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
III. Phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp ứng dụng công nghệ sinh học của Hà Lan trong nghiên cứu các phương pháp nhân giống Lilium bằng in vitro và in vivo (bằng vảy, hạt)
3.4.1. Phương pháp nhân giống Lilium bằng in vitro
* Hoa lily
- Đối tượng: giống hoa lily Manissa
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng nuôi cấy mô Viện Nghiên cứu Rau quả
- Phương pháp nghiên cứu: các thí nghiệm sử dụng môi trường MS cơ bản, có bổ sung sucrose, pH = 5,8. Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần.
- Các thí nghiệm nghiên cứu:
* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của H2O2 nồng độ 30% trong các khoảng thời gian khác nhau đến mẫu vảy củ hoa lily đưa vào nuôi cấy
+ Vật liệu thí nghiệm: Là vảy củ của giống Manissa đã được chọn và làm sạch sơ bộ. Sau khi khử trùng được cấy trên các công thức môi trường MS (mỗi công thức 9 đĩa petri, cấy 5 vảy/đĩa). Gồm 6 công thức thí nghiệm với thời gian khử trùng khác nhau.
+ CT1: Khử trùng bằng H2O2 30% trong thời gian 10 phút
+ CT2: Khử trùng bằng H2O2 30% trong thời gian 10 phút lần 1 và 5 phút lần 2 + CT3: Khử trùng bằng H2O2 30% trong thời gian 15 phút
+ CT4: Khử trùng bằng H2O2 30% trong thời gian 15 phút lần 1 và 5 phút lần 2 + CT5: Khử trùng bằng H2O2 30% trong thời gian 20 phút
+ CT6: Khử trùng bằng H2O2 30% trong thời gian 20 phút lần 1 và 5 phút lần 2
* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của (IAA, IBA, αNAA) đến sự phát sinh củ nhỏ từ vảy củ hoa lily
+ Vật liệu thí nghiệm: Là vảy củ sạch thu được từ thí nghiệm khử trùng. Thí nghiệm được bố trí trên 6 công thức, lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 đĩa pestri, cấy 10 mẫu/đĩa.
+ CT1: MS + 30g/l sacarose + 0,5 mg/l IAA + CT2: MS + 30g/l sacarose + 0,5 mg/l IBA + CT3: MS + 30g/l sacarose + 0,5 mg/l αNAA + CT4: MS + 30g/l sacarose + 1,0 mg/l IAA + CT5: MS + 30g/l sacarose + 1,0 mg/l IBA + CT6: MS + 30g/l sacarose + 1,0 mg/l αNAA
* Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và nồng độ của (αNAA, IAA, IBA) đến khả năng tạo củ in vitro từ vảy củ hoa lily
+ Vật liệu thí nghiệm: Là vảy củ sạch thu được từ thí nghiệm khử trùng. Thí nghiệm được bố trí trên 9 công thức, lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 đĩa pestri, cấy 10 mẫu/đĩa.
+ CT1: MS + 60g/l sacarose + 0,5 mg/l IAA + CT2: MS + 60g/l sacarose + 0,5 mg/l IBA + CT3: MS + 60g/l sacarose + 0,5 mg/l αNAA + CT4: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/l IAA + CT5: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/l IBA + CT6: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/l αNAA + CT7: MS + 120g/l sacarose + 0,5 mg/l IAA + CT8: MS + 120g/l sacarose + 0,5 mg/l IBA + CT9: MS + 120g/l sacarose + 0,5 mg/l αNAA
* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp cytokinin + auxin đến khả năng tạo củ từ củ hoa lily in vitro
+ Vật liệu thí nghiệm: củ in vitro thu được từ 2 thí nghiệm trên sẽ được sử dụng để bố trí thí nghiệm nhân nhanh củ in vitro. Thí nghiệm được bố trí trên 9 công thức, lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình tam giác 250 ml, cấy 5 củ/bình.
+ CT1: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/lαNAA + 0,1 mg/l BAP + CT2: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/lαNAA + 0,2 mg/l BAP
+ CT3: MS + 90g /l sacarose + 0,5 mg/lαNAA + 0,3 mg/l BAP + CT4: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/lαNAA + 0,4 mg/l BAP + CT5: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/lαNAA + 0,5 mg/l BAP + CT6: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/lαNAA + 0,6 mg/l BAP + CT7: MS + 90g/l sacarose + 0,5mg/lαNAA + 0,7 mg/l BAP + CT8: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/lαNAA + 0,8 mg/l BAP + CT9: MS + 90g/l sacarose + 0,5 mg/lαNAA + 0,9 mg/l BAP
* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu nuôi cấy đến khả năng tạo củ từ vảy củ hoa lily in vitro
+ Vật liệu thí nghiệm: Số củ in vitro thu được từ 2 thí nghiệm trên sẽ được sử dụng để bố trí thí nghiệm nhân nhanh củ in vitro. Thí nghiệm được bố trí trên 5 công thức, lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình tam giác 250 ml, cấy 5 củ/bình.
+ CT1: Nuôi trên môi trường đặc
+ CT2: Nuôi trên môi trường đặc - lỏng + CT3: Nuôi trên môi trường bán lỏng + CT4: Nuôi trên nôi trường lỏng tĩnh + CT5: Nuôi trên môi trường lỏng lắc
* Thí ngiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và điều kiện chiếu sáng 16h sáng/ngày và điều kiện tối hoàn toàn đến khả năng phát triển củ lily in vitro
+ Vật liệu thí nghiệm: củ in vitro thu được từ 2 thí nghiệm trên sẽ được sử dụng để bố trí thí nghiệm nuôi lớn củ in vitro. Thí nghiệm được bố trí trên 5 công thức, lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình tam giác 250 ml, cấy 5 củ/bình. Thí ngiệm dược bố trí trong điều kiện chiếu sáng 16giờ sáng/8 giờ tối và điều kiện tối hoàn toàn.
+ CT1: MS + 30g/l sacarose + CT2: MS + 60g/l sacarose + CT3: MS + 90g/l sacarose + CT4: MS + 120g/l sacarose + CT5: MS + 150g/l sacarose
* Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng bật chồi và sinh trưởng phát triển của củ lily in vitro ở giai đoạn vườn ươm
+ Vật liệu thí nghiệm: củ in vitro sau khi được nuôi lớn đạt khối lượng > 1 gam thì được ra ngôi trên khay ươm. Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 khay.
+ CT1: Trấu hun + đất phù sa + CT2: Xơ dừa + Trấu hun + CT3: Xơ dừa nghiền nhỏ + CT4: Đất phù sa
+ CT5: Xơ dừa + đất phù sa
* Hoa loa kèn
- Đối tượng: giống hoa loa kèn Bright Tower
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng nuôi cấy mô Viện Nghiên cứu Rau quả - Các thí nghiệm nghiên cứu:
* Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro từ vảy củ
+ Vật liệu: vảy củ giống hoa loa kèn Bright Tower sau khi khử trùng được cắt thành các mẩu nhỏ kích thước khoảng 1cm x1cm và cấy trên nền môi trường MS + 30g/l Sacarose + 6 g/l Agar có bổ sung BAP với các nồng độ tương ứng là 5 công thức thí nghiệm, các công thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 đĩa pestri, cấy 5 mẫu/đĩa :
+ CT1: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 1mg/l BAP + CT2: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 1,5mg/l BAP + CT3: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 2,0mg/l BAP + CT4: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 2,5mg/l BAP + CT5: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 3,0mg/l BAP
* Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IAA đến khả năng tái sinh chồi in vitro từ vảy củ
+ Vật liệu: vảy củ giống hoa loa kèn Bright Tower sau khi khử trùng được cắt thành các mẩu nhỏ kích thước khoảng 1cm x1cm và cấy trên nền môi trường MS + 30g/l Sacarose + 6 g/l Agar có bổ sung BAP và IAA với các nồng độ tương ứng là 5 công thức thí nghiệm, các công thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 đĩa pestri, cấy 5 mẫu/đĩa :
+ CT1: MS + 30g/l Sacarose + 6 g/l Agar + 1,0mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA + CT2: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 1,5mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA + CT3: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 2,0mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA + CT4: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 2,5mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA + CT5: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 3,0mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA
* Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và αNAA đến khả năng tái sinh chồi in vitro từ vảy củ
+ Vật liệu: vảy củ giống hoa loa kèn Bright Tower sau khi khử trùng được cắt thành các mẩu nhỏ kích thước khoảng 1cm x1cm và cấy trên nền môi trường MS + 30g/l Sacarose + 6 g/l Agar có bổ sung BAP và αNAA với các nồng độ tương ứng là 5 công thức thí nghiệm, các công thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 đĩa pestri, cấy 5 mẫu/đĩa :
+ CT1: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 1,0mg/l BAP + 0,2 mg/l αNAA + CT2: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 1,5mg/l BAP + 0,2 mg/l αNAA + CT3: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 2,0mg/l BAP + 0,2 mg/l αNAA + CT4: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 2,5mg/l BAP + 0,2 mg/l αNAA + CT5: MS + 30g/l sacarose + 6 g/l Agar + 3,0mg/l BAP + 0,2 mg/l αNAA
* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và điều kiện chiếu sáng đến khả năng tạo củ từ chồi in vitro
+ Vật liệu: Chồi in vitro thu được từ các thí nghiệm trên được đưa bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng đường và điều kiện chiếu sáng, thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 bình tam giác 250ml, cấy 5 chồi/bình. Gồm 4 công thức thí nghiệm:
+ CT1: MS + 30g/l sacarose + CT2: MS + 60g/l sacarose + CT3: MS + 90g/l sacarose + CT4: MS + 120g/l sacarose
Thí nghiệm dược bố trí trong điều kiện 16h sáng/8h tối và tối hoàn toàn
* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo củ từ chồi in vitro
+ Vật liệu: Chồi in vitro thu được và xác định được công thức có hàm lượng đường tối ưu từ các thí nghiệm trên để bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của auxin. Thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 bình tam giác 250ml, cấy 5 chồi/bình.
Gồm 5 công thức thí nghiệm:
+ CT1: MS + sacarose
+ CT2: MS + sacarose + 1,0 mg/l IAA + CT3: MS + sacarose + 1,0 mg/l IBA + CT4: MS + sacarose + 1,0 mg/l αNAA + CT5: MS + sacarose + 1,0 mg/l 2,4D
* Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng bật chồi và sinh trưởng phát triển của củ loa kèn in vitro ở giai đoạn ươm
+ Vật liệu thí nghiệm: Củ loa kèn in vitro sau khi đạt khối lượng > 1 gam thì được ra ngôi trên khay ươm với các loại giá thể khác nhau trộn theo tỷ lệ (1:1) và (1:1:1). Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 khay.
+ CT1: Trấu hun + đất phù sa + CT2: Xơ dừa + trấu hun + CT3: Cát sạch + trấu hun
+ CT4: Cát sạch + trấu hun + xơ dừa + CT5: Xơ dừa + đất phù sa + trấu hun
* Các chỉ tiêu theo dõi củ lily, loa kèn in vitro:
Tổng số mẫu nhiễm x 100 + Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =
Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu sống sạch x100 + Tỷ lệ mẫu sống sạch (%)
Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu nhiễm x 100 + Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =
Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu chết x 100 + Tỷ lệ mẫu chết (%) =
Tổng số mẫu cấy Tổng số mẫu tạo củ x 100 + Tỷ lệ mẫu tạo củ (%) = Tổng số mẫu cấy
Tổng số củ x100 + Hệ số tạo củ (củ/mẫu) =
Tổng số mẫu tạo củ Tổng số củ bật chồi x100
Tổng số củ trồng + Tỷ lệ bật chồi (%) =
+ Khối lượng củ (gam) + Chiều cao cây (cm)