Khóa luận nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng)

TỔ NG QUAN

T ổ ng quan v ề Tam th ất hoang và Sâm vũ diệ p

Sâm vũ diệp, hay còn gọi là Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất, và Vũ diệp tam thất, có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân Sâm - Araliaceae.

Sâm vũ diệp là cây thảo lâu năm với rễ dài có nhiều đốt và vết sẹo do thân rụng hàng năm Thân cây mảnh, cao từ 10-50 cm, thường lụi vào mùa khô Lá kép chân vịt mọc vòng ba chiếc một, gồm 3-7 lá chét mỏng, không lông và có mép răng cưa Hoa màu trắng lục, xếp thành tán đơn với 20-30 bông trên trục dài 15-20 cm ở ngọn thân, cuống hoa dài khoảng 1 cm Quả mọng, khi chín có màu đỏ, chứa 1-2 hạt.

Tam thất hoang, còn được biết đến với các tên gọi như Tam thất rừng, Dã tam thất, Bình biên tam thất và Thổ tam thất, có tên khoa học là Panax stipuleanatus H T Tsai et al.

K M Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], cây thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh Mỗi khóm thường có một thân mang lá Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5-10 cm Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm Hoa màu vàng xanh với năm lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2cm, khi chín màu đỏ Hạt 1 hoặc 2, màu xám trắng [4, 25]

Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có hình thái tương đối giống nhau, nhưng điểm khác biệt rõ rệt nhất là lá của Sâm vũ diệp có hình xẻ thùy, trong khi đó, Tam thất hoang không có đặc điểm này.

Hình 1.1 Sâm vũ diệp Hình 1.2 Tam thất hoang

1.1.2.Thực trạng và phân bố

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được Seemann phát hiện lần đầu tiên tại vùng núi Hymalaya của Ấn Độ và được công bố năm 1868 trên tạp chí J

Sâm vũ diệp, một loại thảo dược quý, được phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, bắc Myanma, đông bắc Ấn Độ và Nepal Tại Việt Nam, loại cây này chỉ xuất hiện hẹp ở vùng núi Hoàng Liên Sơn, đặc biệt là ở các khu vực Sapa, Bát Xát (Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu).

Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên thế giới ( khoảng

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) được hai nhà khoa học người Trung Quốc công bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica

Sinica là một loài động vật được phát hiện lần đầu tiên tại khu rừng Mã Quan, Trung Quốc, ở độ cao từ 1100 đến 1700 mét so với mực nước biển Hiện nay, loài này chỉ được tìm thấy tại tỉnh Vân Nam, Trung Quốc và một số khu vực trong Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn, tỉnh Lào Cai, Việt Nam.

Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy Sâm vũ diệp và Tam thất hoang chỉ phân bố tự nhiên ở sườn tây bắc dãy Hoàng Liên Sơn, chủ yếu tại 6 xã thuộc huyện Bát Xát và Sa Pa, tỉnh Lào Cai Phạm vi phân bố của hai loài này rất hạn chế, với quần thể nhỏ Gần đây, Sâm vũ diệp đã được thuần hóa và thử nghiệm trồng ở một số địa phương tại Hà Giang và Lào Cai.

1.1.3 Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang

Theo Đông y, Tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng và tính ấm, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như bổ dưỡng, cường tráng, tiêu viêm, giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu Tất cả các bộ phận của cây đều có thể sử dụng làm thuốc, trong đó thân rễ thường được dùng để bổ dưỡng, cầm máu, tăng cường sinh dục và chống stress Ngoài ra, lá, nụ và hoa của cây có thể pha thành trà, giúp kích thích tiêu hóa và an thần.

Sâm vũ diệp có vị đắng, nhạt, tính hàn, mang lại nhiều tác dụng như tư bổ cường tráng, tiêu viêm, giảm đau, khư ứ sinh tân và cầm máu Thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp được sử dụng để cầm máu cho các loại vết thương và xuất huyết Dược liệu này còn là thuốc bổ chữa thiếu máu, đặc biệt hiệu quả cho phụ nữ sau sinh, và có tác dụng kích thích sinh dục, hỗ trợ điều trị vô sinh Tại Vân Nam, Trung Quốc, rễ củ được dùng để chữa thổ huyết, chảy máu mũi, và các thương tổn gây đau lưng.

Nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy cao Tam thất hoang và Sâm vũ diệp có khả năng phục hồi giấc ngủ bị rút ngắn do stress về trạng thái bình thường với các liều 44, 88, và 176 mg/kg Cao saponin toàn phần của Tam thất hoang có tác dụng chống oxy hóa và ức chế sự hình thành MDA ở nồng độ 25, 50, và 100 µg/mL Năm 2009, Viện Dược liệu đã chỉ ra rằng phân đoạn saponin của Tam thất hoang có hoạt tính chống oxy hóa lipid peroxidation, trong khi dịch chiết ethanol tổng hợp cho thấy hiệu quả chống trầm cảm ở liều 44-176 mg/kg trên chuột.

Năm 2017, nghiên cứu của Lê Thị Tâm đã chỉ ra rằng Sâm vũ diệp có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro Các phân đoạn tổng, n-butanol và etylacetat đều thể hiện tác dụng ức chế tại các mức liều 0,5-1-2.

Tam thất hoang có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro với các phân đoạn và mức liều khác nhau, bao gồm phân đoạn tổng ở mức liều 1-2-5 mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, và phân đoạn n-hexan với các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL.

Nghiên cứu hóa học về lá và thân rễ Sâm vũ diệp cho thấy sự hiện diện của nhiều saponin thuộc khung dammaran và oleanan Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập 13 saponin khung dammaran, trong đó có hai saponin mới là bipinnatifidusoside F1 và F2, cùng với 11 saponin đã biết từ lá khô của Sâm vũ diệp thu thập ở dãy núi Qinling Các saponin đã biết được xác định bao gồm ginsenosid F1, F2, F3 và Rg2.

Re, Rd, Rb1, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1 [44]

Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định cấu trúc 10 saponin khung oleanan từ thân rễ Sâm vũ diệp ở Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, bao gồm 3 chất mới là bifinosid A-C và 7 hợp chất đã biết như narcissiflorine methyl ester và chikusetsusaponin IVa Đến năm 2015, Viện Dược liệu đã nghiên cứu thành phần hoá học của Sâm vũ diệp, phân lập được một hỗn hợp saponin và các hợp chất khác như stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và glycosphingolipid, đánh dấu lần đầu tiên một số hợp chất này được công bố.

Sinh lý h ọ c ti ể u c ầ u

Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, không có nhân, với đường kính khoảng 3-4 micromet, được sản xuất từ mẫu tiểu cầu Nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn từ tế bào nguồn dòng tủy, do tế bào gốc sinh máu tạo ra Mỗi mẫu tiểu cầu có khả năng tạo ra khoảng 3000 tiểu cầu.

Số lượng tiểu cầu lưu hành trong máu ngoại vi dao động từ 150 đến 450 × 10^9/L Tiểu cầu có tuổi thọ ngắn, chỉ từ 8 đến 14 ngày Hiện nay, tiểu cầu có thể được bảo quản ngoài cơ thể trong 7 ngày ở nhiệt độ 20-22 °C với điều kiện lắc liên tục.

Tiểu cầu có một cấu trúc phức tạp gồm 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu bào quan và khu màng

Khu ngoại vi của tiểu cầu bao gồm lớp màng kết nối với hệ thống ống mở, được cấu tạo từ hai lớp lipid bao quanh Màng tiểu cầu chứa các glycoprotein quan trọng, đóng vai trò là các receptor bề mặt trong quá trình đông máu.

Glycoprotein Ib (GPIb) là protein xuyên màng giúp tiểu cầu dính vào collagen thông qua yếu tố von Willebrand (vWF), đánh dấu bước đầu tiên trong quá trình đông cầm máu Glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) là protein màng phụ thuộc vào ion canxi, liên kết với fibrinogen để tạo thành đinh cầm máu Phospholipid điện tích âm, đặc biệt là phosphatidylserine (PS), đóng vai trò quan trọng trong đông máu, là nền tảng cho các phản ứng enzym tiểu cầu và sản xuất thromboxan A2 (TXA2), một chất chủ vận mạnh kích thích quá trình ngưng tập tiểu cầu Màng tiểu cầu cũng có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong.

Hình 1.3 Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [29]

Hệ thống kênh mở trong tiểu cầu bao gồm các không bào giúp tăng diện tích bề mặt và cho phép các hạt phóng thích chất qua các kênh này Hệ thống ống dẫn từ bào tương ra lớp màng ngoài tạo ra các lỗ nhỏ trên bề mặt tiểu cầu, đóng vai trò quan trọng trong việc dẫn các chất từ môi trường vào tế bào chất và đưa các chất được giải phóng từ hạt ra ngoài khi tiểu cầu bị hoạt hóa.

Khu sol-gel nằm dưới khu ngoại vi, bao gồm các vi ống và vi sợi Vi ống sát màng tiểu cầu tạo khung đỡ và tham gia vào hoạt động co rút khi tiểu cầu bị kích thích Vi sợi, với các sợi actin liên kết chặt chẽ với vi ống, cũng tham gia vào quá trình tạo giả túc của tiểu cầu Ngoài ra, khu sol-gel còn chứa glycogen.

Khu bào quan bao gồm các loại hạt và thành phần tế bào như lysosom và ty thể, đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất Những bào quan này không chỉ là nơi dự trữ enzym mà còn chứa nhiều chất thiết yếu khác, góp phần vào chức năng của tiểu cầu.

Platelet granules contain various substances, including ADP, ATP, GDP, GTP, serotonin, histamine, calcium, magnesium, pyrophosphate, and other nucleotides, which are released upon platelet activation The γ-granules (lysosomal vesicles) are rich in enzymes such as galactosidase, fucosidase, hexosaminidase, and glucuronidase α-granules are abundant in adhesive proteins like fibrin, fibronectin, von Willebrand factor (vWF), thrombospondin, thromboglobulin, and vitronectin, as well as growth factors like platelet-derived growth factor (PDGF) and connective tissue activating peptide (CTAP) They also contain platelet factor 4, coagulation factors including factor V, kininogen, fibrinogen, factor XI, protein S, and plasminogen activation inhibitors Lastly, λ-granules play a role in dissolving blood clots during the later stages of vascular recovery.

Khu vực màng là hệ thống ống dày đặc, có chức năng dự trữ canxi cho tiểu cầu và tổng hợp men cyclooxygenase cùng prostaglandin.

Hình 1.4 Cấu trúc của tiểu cầu [29]

Chức năng chính của tiểu cầu là làm vững bền mạch máu, tạo nút cầm máu ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [17, 29]

1.2.2.1 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu

Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không dính vào nội mô mạch máu nguyên vẹn Khi tế bào nội mô bị tổn thương, tiểu cầu nhanh chóng trải qua các phản ứng phối hợp tinh vi, dẫn đến việc hình thành một nút tiểu cầu tại vị trí mô tổn thương.

Quá trình chuyển đổi từ tiểu cầu bất hoạt sang tiểu cầu hoạt hóa diễn ra liên tục theo một chiều, và có thể được phân chia thành ba bước chính: bám dính, kết tập và phóng thích các chất.

Tiểu cầu có khả năng bám dính vào các bề mặt lạ, như tổ chức dưới nội mạc khi mạch máu bị tổn thương trong cơ thể (in vivo) hoặc bề mặt ống nghiệm thủy tinh và lam kính trong môi trường phòng thí nghiệm (in vitro).

Trong thành mạch khỏe mạnh, tiểu cầu được duy trì ở trạng thái không hoạt động nhờ vào oxid nitric và prostacyclin từ tế bào nội mô Tế bào nội mô cũng chứa ADPase, giúp kìm hãm quá trình kích hoạt ADP Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị mất, làm lộ ra lớp dưới với các protein dính như collagen, yếu tố von Willebrand, fibronectin và laminin Yếu tố vWF đóng vai trò quan trọng trong việc bám dính ban đầu của tiểu cầu thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V, hoạt động như một thụ thể.

Trong quá trình bám dính của tiểu cầu, vWF đóng vai trò quan trọng khi dòng máu có tốc độ cao, trong khi ở tốc độ thấp, sự bám dính ban đầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GPIa/IIa Những tương tác này giúp tiểu cầu lưu thông chậm lại, tạo điều kiện cho các cặp thụ thể - phối tử tương tác và dẫn đến bám dính tĩnh Đặc biệt, sự tương tác giữa collagen và GPVI kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, trong khi vWF và collagen tạo ra liên kết mạnh mẽ với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, fibrinogen liên kết với GPIIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ.

Hiện tượng tiểu cầu tập trung thành nút thông qua quá trình dính, mà trong đó tiểu cầu được kích hoạt, tạo điều kiện cho sự ngưng tập Quá trình ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ của chúng thành một nút cầm máu Các thụ thể tiểu cầu chủ yếu trong quá trình này là GPIIb/IIIa, giúp liên kết các tiểu cầu đã được kích hoạt thông qua cầu fibrinogen Một tiểu cầu chưa được kích hoạt có khoảng 4.000-5.000 phức hợp.

Các xét nghi ệm đánh giá chức năng tiể u c ầ u

Hiện nay, có nhiều phương pháp đánh giá chức năng tiểu cầu, bao gồm đo thời gian máu chảy, đo sức bền mao mạch, đếm số lượng tiểu cầu, co cục máu đông, đo độ dính tiểu cầu và đo độ ngưng tập tiểu cầu Những phương pháp này giúp xác định hiệu quả hoạt động của tiểu cầu trong cơ thể.

Khi mạch máu bị tổn thương, máu sẽ chảy ra ngoài và hệ thống cầm máu sẽ được kích hoạt, bao gồm vai trò của thành mạch và tiểu cầu Nếu chất lượng hoạt động cầm máu kém, thời gian để cầm máu sẽ kéo dài Xét nghiệm thời gian chảy máu được thực hiện bằng cách tạo tổn thương cho mạch máu và đo thời gian từ khi máu bắt đầu chảy cho đến khi ngừng chảy.

Phương pháp Duke sử dụng kim chủng để tạo một vết thương nằm ngang giữa dái tai, từ đó đo thời gian chảy máu Trị số bình thường của thời gian này được xác định để đánh giá tình trạng đông máu.

Phương pháp Ivy đo thời gian máu chảy từ các vết thương ở mặt duỗi cẳng tay dưới áp suất cố định, với trị số bình thường dao động từ 4 đến 8 phút.

Phương pháp Borchgrevink có trị số bình thường từ 7-10 phút [23]

1.3.2 Đo sức bền mao mạch

Có 2 phương pháp, nhưng phương pháp giảm áp ít dùng hơn phương pháp tăng áp: dùng huyết áp kế, duy trì lực bằng trung bình cộng giữa huyết áp tối đa và tối thiểu trong vòng 10 phút sau đó tháo hơi nhanh Đếm số nốt xuất huyết ngay dưới vùng dưới da nếp khuỷu Nếu trên 7 nốt xuất huyết là dương tính Sức bền

Giảm mao mạch có thể xảy ra trong một số bệnh lý như giảm tiểu cầu, viêm thành mạch dị ứng và viêm thành mạch do độc tố Bệnh von-Willebrand và rối loạn chức năng tiểu cầu cũng là những nguyên nhân gây ra tình trạng này Ngoài ra, người già, những người thiếu vitamin C, hoặc có thể do yếu tố di truyền cũng có nguy cơ cao gặp phải tình trạng giảm mao mạch.

Có nhiều phương pháp đếm tiểu cầu, nhưng phổ biến nhất hiện nay là sử dụng máy đếm dựa trên nguyên lý trở kháng hoặc laser Giá trị bình thường của tiểu cầu dao động từ 150.000 đến 300.000/mm³ Số lượng tiểu cầu giảm có thể xảy ra trong các trường hợp như xuất huyết do giảm tiểu cầu miễn dịch, suy tủy xương, leucemie cấp và sốt xuất huyết Ngược lại, số lượng tiểu cầu tăng thường gặp trong tình trạng tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt và đa hồng cầu tiên phát.

1.3.4 Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm Giêmsa

Rất cần thiết phải làm đặc biệt ở các trường hợp nghi ngờ bệnh lý tiểu cầu

Tiểu cầu thường có màu đỏ tím, không có nhân và chứa các hạt màu đỏ, tập trung thành cụm khi máu chưa được chống đông Nồng độ tiểu cầu có thể tăng trong các trường hợp như tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt và đa hồng cầu tiên phát Ngược lại, nồng độ tiểu cầu giảm có thể xảy ra trong suy tuỷ xương và leucemie cấp.

Kỹ thuật Budtz-Olzen là phương pháp lâm sàng đơn giản và đặc hiệu để đánh giá sự co cục máu Xét nghiệm này dựa trên nguyên lý rằng máu ra khỏi thành mạch sẽ đông lại, hình thành cục máu nhờ vào sự tạo thành các sợi fibrin Các sợi fibrin này ôm lấy các thành phần hữu hình, tạo ra cục máu đông tách biệt với huyết thanh Sự co của cục máu phụ thuộc vào vai trò của tiểu cầu và fibrin Cục máu co hoàn toàn cho thấy tình trạng bình thường của fibrinogen và tiểu cầu về số lượng và chất lượng Ngược lại, cục máu không co hoặc co không hoàn toàn là dấu hiệu bất thường liên quan đến tiểu cầu và fibrinogen, với mức độ bất thường càng nặng thì cục máu càng không co.

Xét nghiệm co cục máu phụ thuộc vào số lượng và chất lượng tiểu cầu, lượng fibrinogen, yếu tố VIII và hematocrit [16, 23]

1.3.6 Đo độ dính tiểu cầu

Phương pháp Borchrevink được sử dụng để đo độ dính tiểu cầu trong nghiên cứu in vivo bằng cách lấy máu trực tiếp từ vết thương ở các thời điểm cách đều nhau, với trị số bình thường từ 20-40% Trong nghiên cứu in vitro, có ba phương pháp chính là Salzman, Bowie và Hellem, dựa trên nguyên lý đo độ dính tiểu cầu sau khi cho máu hoặc huyết tương qua cột bi thủy tinh Độ dính tiểu cầu giảm trong các trường hợp như bệnh Von – Willebrand, một số rối loạn chức năng tiểu cầu, khi sử dụng một số loại thuốc giảm đau, hoặc sau khi truyền Dextran Ngược lại, độ dính tiểu cầu tăng lên trong các bệnh lý huyết khối, tiểu đường, hút thuốc lá, và cũng có thể xảy ra sau phẫu thuật, sau sinh, hoặc sau các chấn thương, đặc biệt là sau cắt lách.

1.3.7 Đo độngưng tập tiểu cầu

Có nhiều kỹ thuật để đo độ ngưng tập tiểu cầu, chủ yếu dựa trên nguyên lý rằng mật độ quang của huyết tương giàu tiểu cầu tỷ lệ thuận với nồng độ tiểu cầu Khi thêm chất gây ngưng tập như ADP hoặc adrenalin vào huyết tương, hiện tượng ngưng tập tiểu cầu xảy ra, dẫn đến việc nồng độ tiểu cầu dưới dạng phân tử riêng lẻ giảm và mật độ quang học tăng Việc ghi nhận hình ảnh quá trình thay đổi mật độ quang giúp xác định đặc điểm của quá trình ngưng tập tiểu cầu.

Hình 1.7 Nguyên lí của xét nghiệm đo độngưng tập tiểu cầu

(PPP: huyết tương nghèo tiểu cầu, PRP: huyết tương giàu tiểu cầu)

Phương pháp đo quang để xác định độ ngưng tập tiểu cầu sử dụng một quang phổ kế với bước sóng cố định Một chùm ánh sáng đỏ chiếu qua huyết tương giàu tiểu cầu và một chùm khác qua huyết tương nghèo tiểu cầu Mẫu huyết tương giàu tiểu cầu được dùng để thiết lập điểm chuẩn với độ dẫn truyền ánh sáng là 0%, trong khi huyết tương nghèo tiểu cầu có độ dẫn truyền là 100% Khi thêm các chất kết tập như ADP, collagen, thrombin, epinephrin, acid arachidonic, và ristocetin vào huyết tương giàu tiểu cầu, tiểu cầu sẽ ngưng tập lại, dẫn đến sự gia tăng độ dẫn truyền ánh sáng Kết quả cuối cùng được thể hiện dưới dạng phần trăm độ dẫn truyền ánh sáng của huyết tương giàu tiểu cầu khi tiểu cầu đạt mức ngưng tập tối đa.

Các thu ố c kháng ti ể u c ầ u

Tiểu cầu đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh huyết khối, với sự hoạt hóa tiểu cầu bao gồm dính, ngưng tập và phóng thích các yếu tố nội tiểu cầu, là những yếu tố quyết định cho sự hình thành huyết khối Do đó, liệu pháp kháng tiểu cầu ngày càng được chú trọng trong việc điều trị dự phòng và ngăn ngừa hình thành huyết khối Thuốc kháng tiểu cầu giúp ức chế quá trình kết dính, hoạt hóa và ngưng tập tiểu cầu, nhằm hạn chế tắc mạch Hiện nay, nhiều loại thuốc kháng tiểu cầu với cơ chế khác nhau như Aspirin, Ticlopidin, Clopidogrel và Prasugrel đang được sử dụng rộng rãi.

1.4.1 Nhóm ức chế men Cyclo-oxygenase: Aspirin

Aspirin được coi là thuốc kháng tiểu cầu hàng đầu và được sử dụng rộng rãi

Aspirin hoạt động bằng cách ức chế men cyclooxygenase 1 (COX-1), ngăn chặn sự tạo thành Thromboxan A2 (TXA2) và do đó ức chế quá trình ngưng tập tiểu cầu Hiệu quả ức chế này rất mạnh và kéo dài suốt vòng đời của tiểu cầu, vì chúng không thể tổng hợp thêm men mới Ngoài ra, Aspirin cũng ức chế sự tổng hợp prostaglandin kháng đông PGI2 từ tế bào nội mạc thông qua việc ức chế men prostacyclin synthetase, mặc dù tác dụng này không mạnh bằng và không kéo dài lâu do tế bào nội mạc có khả năng tổng hợp men mới Aspirin cũng có thể ức chế ngưng tập tiểu cầu do các chất như collagen, ADP và epinephrin.

1.4.2 Nhóm ức chế ADP Receptor (nhóm Thienopyridin)

Ticlopidin là một loại thuốc có cơ chế tác dụng ức chế sự kết dính tiểu cầu thông qua việc tương tác với glycoprotein IIb/IIIa receptor của fibrinogen, ngăn cản sự gắn kết của fibrinogen vào tiểu cầu hoạt hóa Thuốc cũng làm tăng mức độ prostaglandin D2 và E2, giúp chống đông vón tiểu cầu và kéo dài thời gian chảy máu Tuy nhiên, Ticlopidin hiện nay ít được sử dụng do các tác dụng phụ nghiêm trọng như giảm bạch cầu hạt, suy tủy và tắc mật.

Clopidogrel là một tiền thuốc không có hoạt tính kháng tiểu cầu Sau khi hấp thu ở ruột, khoảng 85% lượng thuốc được chuyển hóa bởi các enzym esterase thành các chất không có hoạt tính, trong khi 15% còn lại được chuyển hóa bởi hệ enzym cytochrome P-450 tại gan thành chất có hoạt tính ức chế thụ thể P2Y12 trên bề mặt tiểu cầu Điều này làm cho ADP không thể gắn vào thụ thể của nó, dẫn đến việc tiểu cầu không được hoạt hóa.

Prasugrel là thuốc mới nhất thuộc nhóm Thienopyridin, được chuyển hóa nhanh chóng trong ống tiêu hóa nhờ esterase trong ruột và máu Chất chuyển hóa trung gian này tiếp tục được biến đổi thành dạng có hoạt tính bởi enzym cytochrome P450 Dạng hoạt tính của prasugrel ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 của tiểu cầu, giúp khắc phục nhược điểm của Clopidogrel Do đó, prasugrel có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu mạnh mẽ, nhanh chóng và ổn định hơn so với clopidogrel.

Thuốc ức chế P2Y12 không thuộc nhóm thienopyridin là loại thuốc ức chế trực tiếp, có khả năng hồi phục thụ thể P2Y12 của tiểu cầu Đây là một liệu pháp đầy triển vọng, được chứng minh qua nghiên cứu PLATO (Nghiên cứu Ức chế Tiểu cầu và Kết quả Điều trị).

1.4.3 Các thuốc ức chế thụ thể Glycoprotein IIb/IIIa của tiểu cầu

Abciximab, Eptifibatide và Tirofiban là các thuốc ức chế glycoprotein IIb/IIIa, giúp ngăn chặn sự liên kết chéo giữa các tiểu cầu do fibrin, từ đó ức chế quá trình hình thành huyết khối.

1.4.4 Thuốc làm tăng AMP vòng tiểu cầu

Dipyridamol là một chất ức chế phosphodiesterase, giúp ngăn chặn sự phân hủy AMP vòng, từ đó làm tăng nồng độ AMP vòng trong cơ thể Điều này có tác dụng ngăn cản sự ngưng tập, phóng thích và kết dính của tiểu cầu, góp phần vào việc cải thiện sức khỏe tim mạch.

22] Thuốc có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu nhưng không làm kéo dài thời gian chảy máu [23]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Nguyên li ệu và đối tượ ng nghiên c ứ u

Mẫu Sâm vũ diệp toàn cây tươi thu hái ở Sa Pa – Lào Cai vào tháng 3 năm

Sâm vũ diệp, tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., được giám định bởi chuyên gia thực vật học tại Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu vào năm 2016 Phần dưới mặt đất của cây được rửa sạch, thái lát mỏng, và sấy khô ở nhiệt độ 40-50 °C để đạt độ ẩm dưới 10%, sau đó xay nhỏ và bảo quản trong túi nilon Sau khi sơ chế, mẫu được chiết xuất bằng EtOH 50% với tỷ lệ dung môi và dược liệu là 7:1, ở nhiệt độ 90 °C Quá trình chiết xuất diễn ra trong 2 giờ mỗi lần, thực hiện 3 lần cho mỗi mẻ Dịch chiết cồn 50% thu được sẽ được cô đặc dưới áp suất giảm cho đến khi tạo thành cao lỏng với tỷ lệ 1:1.

Cao chiết toàn phần của Sâm vũ diệp chứa nhiều tạp chất như hợp chất ít phân cực, dầu béo và saccarid tan trong nước Để loại bỏ tạp chất ít phân cực và dầu, phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với n-hexan theo tỷ lệ 1:1 được thực hiện qua 3 lần, sau đó cất thu hồi dung môi n-hexan để tái sử dụng Lớp nước sau chiết lỏng-lỏng sẽ chứa toàn bộ saponin, đã được loại bỏ dầu béo và tạp chất thân dầu Để loại bỏ các thành phần saccarid tan trong nước, sắc ký hấp phụ bằng resin diaion HP-20 được sử dụng và rửa giải bằng EtOH 96%.

Dịch sau loại tạp được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cao đặc, sau đó được sấy chân không ở nhiệt độ 55-60 °C trong 24 giờ Tiếp theo, sử dụng máy xay dược liệu để nghiền cao thành dạng bột, rây qua sàng 355, thu được cao khô định chuẩn giàu saponin.

Sâm vũ diệp nên được bảo quản trong túi nilon kín, ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng để duy trì chất lượng Các phân đoạn chiết cao khô chuẩn hóa giàu saponin của Sâm vũ diệp được thực hiện tại bộ môn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Hữu Tùng.

Hình 2.1 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp [27]

Mẫu toàn cây tươi Tam thất hoang thu hái ở Sa Pa - Lào Cai ngày 26 tháng

10 năm 2015 được giám định tên khoa học là Tam thất hoang-Panax stipuleanatus

H T Tsai et K M Feng Thân rễ Tam thất hoang rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 °C đạt độ ẩm dưới 10 %, xay nhỏ, thu được bột thô

Bột thô Tam thất được chiết xuất bằng ethanol 50% với tỷ lệ dung môi và dược liệu là 10:1, ở nhiệt độ 90 °C Quá trình chiết diễn ra trong 1 giờ cho mỗi lần, thực hiện 3 lần trong mỗi mẻ Dịch chiết cồn 50% sau đó được cô đặc dưới áp suất giảm để tạo ra cao lỏng với tỷ lệ 1:20.

Quá trình loại tạp được thực hiện bằng phương pháp chiết lỏng-rắn với nhựa hấp phụ D101, sau đó rửa giải bằng EtOH 80% Dịch rửa giải EtOH 80% được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm cho đến khi đạt độ cao đặc, tiếp theo sấy chân không ở nhiệt độ 55-60°C trong 24 giờ Sau đó, sử dụng máy xay dược liệu để nghiền cao thành dạng bột, rây qua rây 355 để thu được cao tam thất hoang, và bảo quản trong túi nilon kín ở nhiệt độ phòng.

Tại khoa Hóa thực vật, viện Dược liệu, PGS.TS Đỗ Thị Hà đã tiến hành nghiên cứu chiết xuất cao giàu hoạt chất từ tam thất hoang.

Hình 2.2 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang [8]

Trong nghiên cứu này, các vật liệu cần thiết bao gồm xylanh 10 mL và 20 mL, kim lấy máu 20 G, ống nghiệm chống đông citrate, ống nghiệm sạch, ống đo mẫu, viên khuấy từ, đầu côn, micropipet, găng tay, máy ly tâm, máy đo độ ngưng tập tiểu cầu chronolog, ADP, dung môi DMSO (Dimethyl sulfoxide), thuốc thử từ cao dược liệu, và thuốc chứng dương aspirin (Aspegic 100mg).

Cô dướ i áp su ấ t gi ả m

- C ấ t thu h ồi dung môi dướ i áp su ấ t gi ả m

Ki ể m tra TLC Đóng gói Tiêu chu ẩ n ki ể m nghi ệ m cơ sở

Sau khi nhận được sự đồng ý từ hội đồng đạo đức, chúng tôi đã tiến hành thu thập máu từ những tình nguyện viên khỏe mạnh, tuân thủ theo tuyên bố Helsinki về đạo đức nghiên cứu Những người tham gia được thông báo rõ ràng về lý do, mục đích, lợi ích và rủi ro của nghiên cứu, đồng thời ký vào bản đồng thuận tham gia Các tình nguyện viên đều đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ đã được xác định.

Tiêu chuẩn lựa chọn cho người tình nguyện bao gồm: sức khỏe tốt, độ tuổi từ 20 đến 25, không hút thuốc lá, không có tiền sử bệnh lý liên quan đến máu và không đang sử dụng các loại thuốc ảnh hưởng đến quá trình đông máu hoặc tiêu fibrin.

Tiêu chuẩn loại trừ bao gồm những trường hợp có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, và những người mới cho máu với lượng lớn hơn 450 mL trong vòng 28 ngày trước đó.

Tất cả các nghiên cứu được tiến hành vào buổi sáng, với các tình nguyện viên nhịn ăn trong 12 giờ trước khi lấy mẫu máu Máu tĩnh mạch toàn phần được thu thập bằng kim tiêm cỡ 20 gauge.

Phương pháp nghiên cứ u

Sử dụng phương pháp đo độ đục của Born: đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy Chrono - Log CA - 560 của Mỹ [34]

Lấy 10-15 ml máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh chống đông bằng natri citrate 3,8 % (1:10); người tình nguyện phải nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu, có số lượng tiểu cầu từ 200-400 G/L, hematocrit bình thường

Để đảm bảo máu được chống đông hoàn toàn, cần lắc đều trước khi ly tâm Tiến hành ly tâm ở tốc độ 500 vòng trong 10 phút để thu được huyết tương giàu tiểu cầu (PRP), sau đó cho vào ống falcon vô khuẩn và giữ ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, ly tâm phần huyết tương còn lại ở tốc độ cao 3000 vòng trong 10 phút để thu được huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP).

Cao chiết saponin từ Tam thất hoang và Sâm vũ diệp có nồng độ 200 mg/mL trong DMSO 10% Các phân đoạn saponin này được hòa tan trong DMSO và pha loãng với nước muối sinh lý, đạt nồng độ cuối cùng trong nghiên cứu là 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 và 1,6 mg/mL, sử dụng DMSO 0,1.

% làm chứng âm Nghiên cứu thăm dò từ giai đoạn trước của Lê Thị Tâm năm

Năm 2017, các nghiên cứu đã thử nghiệm Aspirin với các liều lượng 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,75 mg/mL và 1 mg/mL Kết quả cho thấy liều 1 mg/mL mang lại hiệu quả tối ưu và đạt được mức ức chế kết tập tiểu cầu như mong muốn Do đó, liều 1 mg/mL được chọn làm liều chứng dương cho nghiên cứu.

Tiến hành đo mẫu trên máy Chrono - Log CA – 560

Cho 450 µL huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) và 50 µL DMSO 0,1% vào cuvet thủy tinh không chứa bi khuấy từ Tiếp theo, thêm 450 µL huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) vào cuvet chứa bi khuấy từ Sau đó, lần lượt thêm 50 µL hóa chất gồm DMSO 0,1%, Aspirin (1 mg/mL), và các phân đoạn giàu saponin của Sâm vũ diệp hoặc Tam thất hoang với các nồng độ: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 mg/mL Ủ hỗn hợp trong 5 phút ở 37 °C Sau khi ủ, di chuyển ống vào vị trí đo trên máy, bao gồm 01 ống nghèo tiểu cầu và 01 ống giàu tiểu cầu Thêm 5 µL chất kết tập ADP vào ống giàu tiểu cầu và chờ máy chạy để đo mẫu tự động Ghi lại kết quả bao gồm phần trăm NTTC tối đa (MPA), tốc độ thay đổi ngưng tập trong 1 phút (Slope), và diện tích dưới đường cong (AUC) Lặp lại thí nghiệm 7 lần ở mỗi nồng độ Quy trình thí nghiệm được minh họa trong hình 2.3.

Hình 2.3 Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu

Ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP

Hình 2.4 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP

Sử dụng chất kết tập ADP 5 àL, ADP gắn vào receptor trên bề mặt tiểu cầu, kích thích giải phóng Canxi nội bào và acid arachidonic từ màng phospholipid, dẫn đến sự thay đổi hình dạng tiểu cầu từ hình đĩa sang hình cầu gai Quá trình này tạo ra đáp ứng nguyên phát, tiếp theo là đáp ứng thứ phát qua việc giải phóng hạt đặc thông qua hệ thống kênh mở, chứa adenine nucleotide, serotonin và thromboxan Đáp ứng này được gọi là sóng ngưng tập nguyên phát và thứ phát, và quá trình này được chia thành 5 giai đoạn.

1- Trước khi đưa chất kết tập ADP vào cuvet

2- Chất kết tập được thêm vào, đồ thì dạng đỉnh nhọn

3- Ánh sáng truyền qua cuvet giảm, tiểu cầu thay đổi hình dạng (kết quả của việc ADP bám vào tiểu cầu)

4- Tăng ánh sáng truyền qua cuvet, tạo sóng ngưng tập nguyên phát

5- Nếu kích thích không đủ mạnh, tiểu cầu sẽ không ngưng tập được (dữ liệu không hiển thị được) Nếu đủ mạnh, sẽ taọ sóng ngưng tập thứ phát của ADP – ngưng tập tăng lên Sự uốn cong nhẹ ở cuối giai đoạn 4 (mũi tên) cho

Sự khởi đầu của sóng ngưng tập thứ phát tại V NU dẫn đến việc giải phóng một số thành phần trong tiểu cầu, bao gồm fibrinogen, serotonin, thromboxan và ADP, từ đó làm tăng đáp ứng ngưng tập.

Các thông số nghiên cứu

Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) được thể hiện qua chỉ số Amplitude, trong đó độ ngưng tập tiểu cầu của các mẫu thử và mẫu chứng dương được chuẩn hóa dựa trên MPA của DMSO, coi MPA của DMSO là 100% MPA (%) của Aspirin và cao giàu Tam thất hoang cùng Sâm vũ diệp được tính toán theo công thức xác định.

Bên cạnh độ ngưng tập tiểu cầu tối đa MPA, tốc độ thay đổi trong một phút (Slope) cũng là chỉ số quan trọng để đánh giá giai đoạn đầu của quá trình ngưng tập và hoạt hóa tiểu cầu Slope được xác định bằng cách vẽ một đường tiếp tuyến với đường ngưng tập sau giai đoạn tiểu cầu biến dạng (giai đoạn 4).

Mức độ ngưng tập tiểu cầu (NTTC) được đo bằng chỉ số diện tích dưới đường cong (AUC), tính từ thời điểm tiểu cầu bắt đầu biến dạng cho đến khi đạt ngưỡng ngưng tập tối đa Chỉ số AUC là yếu tố quan trọng nhất trong việc đánh giá NTTC, vì nó phản ánh khả năng ngưng tập của tiểu cầu trong quá trình đông máu.

V NU phụ thuộc vào tốc độ thay đổi ngưng tập và phần trăm ngưng tập tối đa, điều này được nhấn mạnh trong các nghiên cứu gần đây Ba chỉ số này đang được các nhà lâm sàng chú trọng trong việc đánh giá chức năng tiểu cầu của bệnh nhân và có giá trị quan trọng trong việc phân loại các dạng bệnh lý tiểu cầu.

Hình 2.6 Chỉ số diện tích dưới đường cong - AUC Phương pháp phân tích số liệu

Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0, với kết quả được trình bày dưới dạng X ± SE (X là giá trị trung bình, SE là sai số chuẩn) Để so sánh giá trị trung bình giữa các nhóm, sử dụng Test one-way ANOVA và áp dụng kiểm định hậu Tukey hoặc Dunnett’T3 cho từng nhóm Sự khác biệt giữa các nhóm được xem là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

KẾ T QU Ả VÀ BÀN LU Ậ N

K ế t qu ả

3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp

3.1.1.1 Ảnh hưởng của cao giàu saponin Sâm vũ diệp lên mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC)

Bảng 3.1 Mức độngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin Sâm vũ diệp

Lô Thuốc dùng N AUC P so với lô dùng DMSO

P so với lô dùng Aspirin

Sâm vũ diệp chứa cao giàu saponin không làm thay đổi mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng Tuy nhiên, ở liều 0,8 mg/mL và 1,6 mg/mL, Sâm vũ diệp đã làm giảm mức độ ngưng tập tiểu cầu so với lô chứng DMSO, với AUC tương ứng là 213,78±21,50 và 145,93±12,76, trong khi lô chứng DMSO có AUC là 255,05±20,90.

3.1.1.2 Ảnh hưởng của cao giàu saponin Sâm vũ diệp đến phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA)

Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin Sâm vũ diệp

Lô Thuốc dùng N MPA (%) P so với lô dùng DMSO

Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy nồng độ 0,8 và 1,6 mg/mL của cao saponin từ Sâm vũ diệp có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu rõ rệt so với mẫu chứng DMSO (p0,05).

3.1.1.4 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp

Phần trăm NTTC tối đa (Maximum platelet aggregation -

MPA) Phần trăm NTTC điểm cuối (Final platelet aggregation -

Hình 3.1 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp

(A: DMSO; B: Aspirin 1 mg/mL; C: Sâm vũ diệp 0,1 mg/mL; D: Sâm vũ diệp 0,2 mg/mL;

E: Sâm vũ diệp 0,4 mg/mL; F: Sâm vũ diệp 0,8 mg/mL; G: Sâm vũ diệp 1,6 mg/mL)

Nghiên cứu cho thấy cao giàu saponin từ Sâm vũ diệp ở liều 0,8 mg/mL có khả năng làm giảm tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu tương đương với Aspirin 1 mg/mL Ở liều 1,6 mg/mL, tác dụng giảm ngưng tập còn mạnh hơn so với Aspirin, trong khi chứng âm DMSO không có hiệu quả Sau khi tiểu cầu ngưng tập tối đa, chúng có xu hướng phục hồi, cho thấy sau khoảng thời gian 5 phút, cả Aspirin và phân đoạn cao saponin của Sâm vũ diệp đều có xu hướng phân rã ngưng tập, dẫn đến sự giảm tiếp tục trong tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu, thể hiện qua sự gia tăng ở cuối đồ thị ngưng tập.

3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Tam thất hoang

3.1.2.1 Ảnh hưởng của cao giàu saponin Tam thất hoang lên mức độngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC)

Bảng 3.4 Mức độngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin Tam thất hoang

Lô Thuốc dùng N AUC P so với lô dùng DMSO

Nghiên cứu cho thấy cao saponin từ Tam thất hoang ở liều 0,8 và 1,6 mg/mL có khả năng giảm đáng kể mức độ ngưng tập tiểu cầu so với nhóm chứng DMSO Đặc biệt, liều 1,6 mg/mL còn cho thấy hiệu quả vượt trội hơn cả Aspirin (p

Tiêu đề	Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Ngưng Tập Tiểu Cầu In Vitro Của Cao Giàu Saponin Của Sâm Vũ Diệp (Panax Bipinnatifidus Seem.) Và Tam Thất Hoang (Panax Stipuleanatus H. T. Tsai Et K. M. Feng)
Tác giả	Lê Thị Thanh Hoa
Người hướng dẫn	TS. Vũ Thị Thơm, PGS.TS. Dương Thị Ly Hương
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	48
Dung lượng	0,92 MB