Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo!
TỔNG QUAN
Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp
Sâm vũ diệp, hay còn gọi là Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất lá xẻ, và Hoàng liên thất, có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân Sâm - Araliaceae.
Sâm vũ diệp là cây thảo lâu năm, có rễ dài với nhiều đốt và vết sẹo do thân rụng hàng năm Thân cây mảnh, cao từ 10–50 cm và thường lụi vào mùa khô Lá cây có hình chân vịt, mọc vòng ba cái một, với 3-7 lá chét mỏng, không lông và mép có răng đôi cạn hoặc sâu Hoa của cây có màu trắng lục, xếp thành tán đơn với 20-30 bông trên một trục dài 15-20 cm ở ngọn thân, cuống hoa dài khoảng 1 cm Quả của sâm vũ diệp là quả mọng, khi chín có màu đỏ và chứa 1-2 hạt.
Tam thất hoang, còn được biết đến với các tên gọi như Tam thất rừng, Dã tam thất, Bình biên tam thất và Thổ tam thất, có tên khoa học là Panax stipuleanatus H T Tsai et.
K M Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], cây thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh Mỗi khóm thường có một thân mang lá Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5-10 cm Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm Hoa màu vàng xanh với năm lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2cm, khi chín màu đỏ Hạt 1 hoặc 2, màu xám trắng [4, 25]
Sâm vũ diệp và Tam thất hoang là hai loài thực vật có hình thái tương đối giống nhau, nhưng điểm khác biệt nổi bật là Sâm vũ diệp có lá xẻ thùy, trong khi Tam thất hoang không có đặc điểm này.
Hình 1.1 Sâm vũ diệp Hình 1.2 Tam thất hoang
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
1.1.2 Thực trạng và phân bố
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được Seemann phát hiện lần đầu tiên tại vùng núi Hymalaya của Ấn Độ và được công bố năm 1868 trên tạp chí J
Sâm vũ diệp, một loài thực vật quý, chủ yếu được tìm thấy ở Trung Quốc, bắc Myanma, đông bắc Ấn Độ và Nepal Tại Việt Nam, loài này phân bố hẹp tại vùng núi Hoàng Liên Sơn, đặc biệt ở các khu vực Sapa, Bát Xát (Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu).
Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên thế giới ( khoảng
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) được hai nhà khoa học người Trung Quốc công bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica
Loài Sinica được phát hiện lần đầu tại khu rừng Mã Quan, Trung Quốc, ở độ cao từ 1100-1700 m so với mực nước biển Hiện nay, loài này chỉ được tìm thấy tại tỉnh Vân Nam, Trung Quốc và một số khu vực trong Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn, tỉnh Lào Cai, Việt Nam.
Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang phân bố tự nhiên chủ yếu ở sườn tây bắc dãy Hoàng Liên Sơn, thuộc 6 xã ở huyện Bát Xát và Sa Pa, tỉnh Lào Cai Phạm vi phân bố của hai loài này rất hạn chế, với các quần thể nhỏ trong tự nhiên Gần đây, Sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bắt đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương như Hà Giang và Lào Cai.
1.1.3 Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
Theo Đông y, Tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng và tính ấm, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như bổ dưỡng, cường tráng, tiêu viêm, giảm đau, khử ứ, sinh tân và cầm máu Tất cả các bộ phận của cây đều có thể sử dụng làm thuốc; trong đó, thân rễ thường được dùng để bổ sung dinh dưỡng, cầm máu, tăng cường sinh lực và giảm stress Lá, nụ, hoa có thể pha trà, giúp kích thích tiêu hóa và an thần.
Sâm vũ diệp có vị đắng, nhạt, tính hàn, và mang lại nhiều tác dụng như tư bổ cường tráng, tiêu viêm, giảm đau, khư ứ sinh tân và cầm máu Thân rễ và rễ củ của loại dược liệu này được sử dụng để cầm máu cho các loại vết thương và xuất huyết, đồng thời làm thuốc bổ chữa thiếu máu, xanh xao gầy còm, đặc biệt là cho phụ nữ sau sinh Ngoài ra, Sâm vũ diệp còn có tác dụng kích thích sinh dục và hỗ trợ điều trị vô sinh Tại Vân Nam, Trung Quốc, rễ củ được dùng để chữa thổ huyết, chảy máu mũi và các tổn thương gây đau lưng.
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy cao Tam thất hoang và Sâm vũ diệp có khả năng phục hồi giấc ngủ bị rút ngắn do stress về trạng thái bình thường ở các liều 44, 88, 176 mg/kg Cao saponin toàn phần của Tam thất hoang cũng cho thấy tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA ở nồng độ 25, 50, 100 µg/mL Năm 2009, Viện Dược liệu đã chỉ ra rằng phân đoạn saponin của Tam thất hoang có hoạt tính chống oxy hóa lipid peroxidation, và dịch chiết tổng ethanol có tác dụng chống trầm cảm trên chuột ở liều 44-176 mg/kg.
Năm 2017, nghiên cứu của Lê Thị Tâm đã chỉ ra rằng Sâm vũ diệp có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro, với hiệu quả rõ rệt ở các phân đoạn tổng, n-butanol và etylacetat tại các mức liều 0,5-1-2.
Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro ở các phân đoạn và mức liều khác nhau, cụ thể là phân đoạn tổng với các mức liều 1-2-5 mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, và phân đoạn n-hexan với các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL.
Nghiên cứu hóa học về lá và thân rễ Sâm vũ diệp cho thấy sự hiện diện của nhiều saponin thuộc khung dammaran và oleanan Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được 13 saponin khung dammaran, trong đó có hai saponin mới là bipinnatifidusoside F1 và F2, cùng với 11 saponin đã biết từ lá khô Sâm vũ diệp thu thập ở dãy núi Qinling Các saponin đã biết bao gồm ginsenosid F1, F2, F3 và Rg2.
Re, Rd, Rb1, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1 [44]
Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc đã phân lập và xác định cấu trúc 10 saponin khung oleanan từ thân rễ Sâm vũ diệp ở Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới là bifinosid A-C và 7 hợp chất đã biết như narcissiflorine methyl ester, chikusetsusaponin IVa, và pseudoginsenoside RP1 methyl ester Đến năm 2015, Viện Dược liệu đã nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm vũ diệp, phân lập được một hỗn hợp saponin bao gồm stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid, cùng với glycosphingolipid và dichaccarid saccharose từ phân đoạn chiết ethyl acetat Đây là lần đầu tiên một số hợp chất này được công bố.
Sinh lý học tiểu cầu
Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, không có nhân, với đường kính khoảng 3-4 micromet, được sản xuất từ mẫu tiểu cầu Nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn từ tế bào nguồn dòng tủy, do tế bào gốc sinh máu tạo ra Mỗi mẫu tiểu cầu có khả năng tạo ra khoảng 3000 tiểu cầu.
Tiểu cầu trong máu ngoại vi có nồng độ khoảng 150 - 450 × 10^9/L và có tuổi thọ ngắn, từ 8 đến 14 ngày Hiện tại, tiểu cầu có thể được bảo quản ngoài cơ thể trong 7 ngày ở nhiệt độ 20-22 °C với điều kiện lắc liên tục.
Tiểu cầu có một cấu trúc phức tạp gồm 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu bào quan và khu màng
Khu ngoại vi bao gồm lớp màng tiểu cầu kết nối với hệ thống ống mở, trong đó màng tiểu cầu có hai lớp lipid bao quanh Màng tiểu cầu chứa các glycoprotein quan trọng, hoạt động như các receptor bề mặt liên quan đến quá trình đông máu.
Glycoprotein Ib (GPIb) là protein xuyên màng giúp tiểu cầu liên kết với yếu tố von Willebrand (wWF), đóng vai trò quan trọng trong việc dính bám vào collagen, khởi đầu quá trình đông cầm máu Glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) là protein màng phụ thuộc vào ion canxi, có chức năng liên kết với fibrinogen, hỗ trợ tiểu cầu ngưng tập tạo thành đinh cầm máu Phospholipid điện tích âm, đặc biệt là phosphatidylserine (PS), cũng có vai trò thiết yếu trong quá trình đông máu, là nền tảng cho các phản ứng enzym tiểu cầu tạo ra thromboxan A2 (TXA2), một chất chủ vận mạnh kích thích ngưng tập tiểu cầu Màng tiểu cầu có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong, góp phần vào hoạt động của tiểu cầu.
Hình 1.3 Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [29]
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hệ thống kênh mở trong tiểu cầu bao gồm các không bào giúp tăng diện tích bề mặt, cho phép các hạt tiểu cầu phóng thích chất qua các kênh này Hệ thống ống dẫn từ bào tương ra lớp màng ngoài tạo ra các lỗ nhỏ trên bề mặt tiểu cầu, đóng vai trò là đường dẫn cho các chất từ môi trường bên ngoài vào tế bào chất và cũng là nơi giải phóng các chất từ hạt khi tiểu cầu bị hoạt hóa.
Khu sol-gel nằm dưới khu ngoại vi, bao gồm các vi ống và vi sợi, trong đó vi ống sát màng tiểu cầu tạo khung đỡ và tham gia vào co rút khi tiểu cầu bị kích thích Vi sợi, chứa các sợi actin liên kết chặt chẽ với vi ống, cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo giả túc của tiểu cầu Ngoài ra, khu sol-gel còn chứa glycogen.
Khu bào quan bao gồm các loại hạt và thành phần tế bào như lysosom và ty thể, tham gia vào quá trình trao đổi chất Những bào quan này không chỉ dự trữ enzym mà còn chứa nhiều chất quan trọng cho chức năng của tiểu cầu.
Platelet granules contain various substances such as ADP, ATP, GDP, GTP, serotonin, histamine, calcium, magnesium, pyrophosphate, and other nucleotides, which are released upon platelet activation The γ-granules (lysosomal vesicles) house enzymes like galactosidase, fucosidase, hexosaminidase, and glucuronidase α-granules are rich in adhesive proteins including fibrin, fibronectin, von Willebrand factor (vWF), thrombospondin, thromboglobulin, and vitronectin, as well as growth factors like platelet-derived growth factor (PDGF) and connective tissue activating peptide (CTAP), along with coagulation factors such as factor V, kininogen, fibrinogen, factor XI, protein S, and plasminogen activation inhibitors λ-granules play a crucial role in dissolving blood clots during the later stages of vascular recovery.
Khu vực màng chứa hệ thống ống dày đặc có khả năng gắn kết canxi một cách chọn lọc, đóng vai trò quan trọng trong việc dự trữ canxi cho tiểu cầu Ngoài ra, đây cũng là nơi diễn ra quá trình tổng hợp men cyclooxygenase và prostaglandin trong tiểu cầu.
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 1.4 Cấu trúc của tiểu cầu [29]
Chức năng chính của tiểu cầu là làm vững bền mạch máu, tạo nút cầm máu ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [17, 29]
1.2.2.1 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu
Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không dính vào nội mô mạch máu còn nguyên vẹn Tuy nhiên, khi tế bào nội mô thành mạch bị tổn thương, tiểu cầu sẽ nhanh chóng trải qua một loạt các phản ứng phối hợp tinh xảo, dẫn đến việc hình thành một nút tiểu cầu tại vị trí mô tổn thương.
Quá trình chuyển đổi tiểu cầu từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt hóa diễn ra liên tục theo một chiều dọc và có thể được chia thành các bước chính: bám dính, kết tập và phóng thích các chất.
Tiểu cầu bám vào các bề mặt lạ, như tổ chức dưới nội mạc khi mạch máu bị tổn thương trong cơ thể (in vivo) hoặc bề mặt thủy tinh, lam kính trong môi trường ống nghiệm (in vitro).
Trong một mạch máu khỏe mạnh, tiểu cầu được giữ ở trạng thái không hoạt động nhờ vào oxid nitric và prostacyclin từ tế bào nội mô Tế bào nội mô cũng chứa ADPase, giúp kìm hãm quá trình kích hoạt ADP Khi mạch máu bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị mất, làm lộ ra lớp dưới nội mô với các protein dính như collagen, yếu tố von Willebrand, fibronectin, và laminin Yếu tố vWF đóng vai trò quan trọng trong việc bám dính ban đầu của tiểu cầu thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V, là thụ thể trên bề mặt tiểu cầu.
Màng tiểu cầu và vWF đóng vai trò quan trọng trong việc bám dính của tiểu cầu khi có tốc độ dòng máu cao Ở tốc độ dòng máu thấp hoặc trong điều kiện tĩnh, bám dính ban đầu của tiểu cầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GPIa/IIa, cho phép tiểu cầu lưu thông chậm lại để tạo điều kiện cho các tương tác và ràng buộc giữa các cặp thụ thể - phối tử, dẫn đến bám dính tĩnh Sự tương tác giữa collagen và GPVI kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, trong khi vWF và collagen tạo ra liên kết mạnh mẽ với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, cùng với fibrinogen liên kết với GPIIb/IIIa giúp giữ tiểu cầu tại chỗ.
Tiểu cầu tập trung thành nút qua hiện tượng dính, được kích hoạt và ngưng tập nhờ vào sự liên kết của các thụ thể GPIIb/IIIa với fibrinogen Trong trạng thái không hoạt động, tiểu cầu có khoảng 4.000-5.000 phức hợp GPIIb/IIIa nhưng không thể gắn với fibrinogen và các yếu tố khác Khi tiểu cầu được kích hoạt, phức hợp GPIIb/IIIa trở nên hoạt động, cho phép gắn kết fibrinogen và tạo cầu nối giữa các tiểu cầu, dẫn đến quá trình ngưng tập và hoạt hóa diễn ra liên tục cho đến khi hình thành nút tiểu cầu.
Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu
Hiện nay, có nhiều phương pháp đánh giá chức năng tiểu cầu, bao gồm đo thời gian máu chảy, đo sức bền mao mạch, đếm số lượng tiểu cầu, co cục máu đông, cũng như đo độ dính và độ ngưng tập tiểu cầu.
Khi mạch máu bị tổn thương, máu sẽ chảy ra ngoài và hệ thống cầm máu sẽ bắt đầu hoạt động, bao gồm vai trò của thành mạch và tiểu cầu Nếu hoạt động cầm máu không hiệu quả, thời gian để cầm máu sẽ kéo dài hơn Xét nghiệm thời gian máu chảy được thực hiện bằng cách tạo ra tổn thương mạch máu và đo thời gian từ khi máu bắt đầu chảy cho đến khi ngừng chảy.
Phương pháp Duke sử dụng kim chủng để tạo ra một vết thương nằm ngang tại vùng giữa dái tai và tiến hành đo thời gian chảy máu Trị số bình thường của thời gian chảy máu này là một yếu tố quan trọng trong đánh giá sức khỏe.
Phương pháp Ivy đo thời gian chảy máu từ các vết thương ở mặt duỗi cẳng tay dưới áp suất cố định Thời gian chảy máu bình thường dao động từ 4 đến 8 phút.
Phương pháp Borchgrevink có trị số bình thường từ 7-10 phút [23]
1.3.2 Đo sức bền mao mạch
Có 2 phương pháp, nhưng phương pháp giảm áp ít dùng hơn phương pháp tăng áp: dùng huyết áp kế, duy trì lực bằng trung bình cộng giữa huyết áp tối đa và tối thiểu trong vòng 10 phút sau đó tháo hơi nhanh Đếm số nốt xuất huyết ngay dưới vùng dưới da nếp khuỷu Nếu trên 7 nốt xuất huyết là dương tính Sức bền
Giảm mao mạch có thể xảy ra trong một số bệnh lý như giảm tiểu cầu, viêm thành mạch dị ứng và viêm thành mạch do độc tố Ngoài ra, bệnh von-Willebrand và rối loạn chức năng tiểu cầu cũng liên quan đến tình trạng này Những người già, thiếu vitamin C, hoặc có yếu tố di truyền cũng có nguy cơ cao hơn.
1.3.3 Đếm số lượng tiểu cầu
Hiện nay, phương pháp đếm tiểu cầu phổ biến tại các bệnh viện là sử dụng máy dựa trên nguyên lý trở kháng hoặc laser, với trị số bình thường từ 150.000 đến 300.000/mm³ Số lượng tiểu cầu giảm có thể xảy ra do nhiều nguyên nhân như xuất huyết do giảm tiểu cầu miễn dịch, suy tủy xương, leucemie cấp, hoặc sốt xuất huyết Ngược lại, số lượng tiểu cầu tăng thường gặp trong các trường hợp như tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt, và đa hồng cầu tiên phát.
1.3.4 Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm Giêmsa
Rất cần thiết phải làm đặc biệt ở các trường hợp nghi ngờ bệnh lý tiểu cầu
Tiểu cầu thường có màu đỏ tím, không nhân và chứa các hạt màu đỏ, thường đứng thành cụm khi máu chưa được chống đông Độ tập trung tiểu cầu tăng cao có thể thấy trong các tình trạng như tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt và đa hồng cầu tiên phát Ngược lại, độ tập trung tiểu cầu giảm có thể xảy ra trong suy tuỷ xương và leucemie cấp.
Kỹ thuật Budtz-Olzen là phương pháp lâm sàng đơn giản và đặc hiệu để đánh giá sự co cục máu Xét nghiệm này dựa trên nguyên lý rằng máu ra khỏi thành mạch sẽ đông lại nhờ sự hình thành các sợi fibrin, tạo thành cục máu đông tách rời khỏi huyết thanh Cục máu đông co lại nhờ vai trò của tiểu cầu và fibrin, phản ánh tình trạng bình thường của fibrinogen và tiểu cầu về cả số lượng và chất lượng Nếu cục máu không co hoặc co không hoàn toàn, điều này cho thấy có sự bất thường về tiểu cầu và/hoặc fibrinogen, với mức độ bất thường càng nặng thì cục máu càng không co.
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Xét nghiệm co cục máu phụ thuộc vào số lượng và chất lượng tiểu cầu, lượng fibrinogen, yếu tố VIII và hematocrit [16, 23]
1.3.6 Đo độ dính tiểu cầu
Phương pháp Borchrevink được sử dụng để đo độ dính tiểu cầu in vivo thông qua việc lấy máu và đếm tiểu cầu tại vết thương với trị số bình thường từ 20-40% Trong khi đó, trên in vitro có ba phương pháp chính là Salzman, Bowie và Hellem, dựa trên nguyên lý đo độ dính tiểu cầu sau khi cho máu hoặc huyết tương qua cột bi thủy tinh Độ dính tiểu cầu có thể giảm trong các bệnh như Von – Willebrand, một số rối loạn chức năng tiểu cầu, hoặc do tác dụng của một số thuốc giảm đau và sau khi truyền Dextran Ngược lại, độ dính tiểu cầu có thể tăng trong các tình trạng như bệnh lý huyết khối, tiểu đường, hút thuốc lá, cũng như sau phẫu thuật, sinh nở hoặc chấn thương, đặc biệt là sau cắt lách.
1.3.7 Đo độ ngưng tập tiểu cầu
Có nhiều kỹ thuật đo độ ngưng tập tiểu cầu, chủ yếu dựa vào nguyên lý rằng mật độ quang của huyết tương giàu tiểu cầu tỷ lệ thuận với nồng độ tiểu cầu Khi thêm chất gây ngưng tập như ADP hoặc adrenalin vào huyết tương, hiện tượng ngưng tập tiểu cầu xảy ra, làm giảm nồng độ tiểu cầu dưới dạng phân tử riêng lẻ và tăng mật độ quang học Ghi nhận hình ảnh của quá trình thay đổi mật độ quang giúp xác định đặc điểm của quá trình ngưng tập tiểu cầu.
Hình 1.7 Nguyên lí của xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu
(PPP: huyết tương nghèo tiểu cầu, PRP: huyết tương giàu tiểu cầu)
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Phương pháp đo quang để xác định độ ngưng tập tiểu cầu sử dụng thiết bị quang phổ kế với bước sóng cố định Một chùm ánh sáng đỏ được chiếu qua huyết tương giàu tiểu cầu và một chùm khác qua huyết tương nghèo tiểu cầu Điểm chuẩn được thiết lập bằng huyết tương giàu tiểu cầu, nơi độ dẫn truyền ánh sáng là 0%, và huyết tương nghèo tiểu cầu, nơi độ dẫn truyền ánh sáng là 100% Khi thêm các chất kết tập như ADP, collagen, thrombin, epinephrin, acid arachidonic, và ristocetin vào huyết tương giàu tiểu cầu, hiện tượng ngưng tập xảy ra, dẫn đến tăng độ dẫn truyền ánh sáng Kết quả cuối cùng thể hiện bằng % độ dẫn truyền ánh sáng của huyết tương giàu tiểu cầu khi tiểu cầu đã ngưng tập tối đa.
Các thuốc kháng tiểu cầu
Tiểu cầu đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh huyết khối, với sự hoạt hóa tiểu cầu bao gồm dính, ngưng tập và phóng thích các yếu tố nội tiểu cầu Điều này tạo nên cơ sở sinh lý và sinh hóa cho sự hình thành huyết khối, vì vậy liệu pháp kháng tiểu cầu ngày càng được chú trọng trong điều trị dự phòng và ngăn ngừa tắc mạch Thuốc kháng tiểu cầu hoạt động bằng cách ức chế quá trình kết dính và ngưng tập tiểu cầu, giúp hạn chế nguy cơ huyết khối Hiện nay, có nhiều loại thuốc kháng tiểu cầu với cơ chế khác nhau như Aspirin, Ticlopidin, Clopidogrel và Prasugrel được sử dụng rộng rãi.
1.4.1 Nhóm ức chế men Cyclo-oxygenase: Aspirin
Aspirin được coi là thuốc kháng tiểu cầu hàng đầu và được sử dụng rộng rãi
Aspirin hoạt động bằng cách ức chế men cyclooxygenase 1 (COX-1), ngăn cản sự tạo thành Thromboxan A2 (TXA2), từ đó ức chế sự ngưng tập tiểu cầu một cách mạnh mẽ và kéo dài suốt vòng đời của tiểu cầu Do tiểu cầu không thể tổng hợp thêm men mới, tác dụng này rất bền vững Đồng thời, Aspirin cũng ức chế sự tổng hợp prostaglandin kháng đông PGI2 từ tế bào nội mạc thông qua việc ức chế men prostacyclin synthetase, tuy nhiên tác dụng này không mạnh và không kéo dài như tác dụng ức chế COX-1, vì tế bào nội mạc có khả năng tổng hợp men mới Ngoài ra, Aspirin có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu với các chất như collagen, ADP và epinephrin.
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
1.4.2 Nhóm ức chế ADP Receptor (nhóm Thienopyridin)
Ticlopidin hoạt động bằng cách ức chế sự kết dính tiểu cầu thông qua việc tương tác với glycoprotein IIb/IIIa receptor của fibrinogen, ngăn cản fibrinogen gắn vào tiểu cầu đã hoạt hóa Thuốc cũng làm tăng nồng độ prostaglandin D2 và E2, góp phần vào quá trình chống đông và kéo dài thời gian chảy máu Tuy nhiên, Ticlopidin hiện nay ít được sử dụng do các tác dụng phụ nghiêm trọng như giảm bạch cầu, suy tủy và tắc mật, có thể dẫn đến tử vong.
Clopidogrel là một tiền thuốc không có hoạt tính kháng tiểu cầu Sau khi được hấp thu ở ruột, khoảng 85% lượng thuốc được chuyển hóa bởi các enzym esterase thành những chất không có hoạt tính, trong khi 15% còn lại được chuyển hóa bởi hệ enzym cytochrome P-450 tại gan thành chất có hoạt tính ức chế thụ thể P2Y12 trên bề mặt tiểu cầu Điều này làm cho ADP không thể gắn vào thụ thể, dẫn đến việc tiểu cầu không được hoạt hóa.
Prasugrel là thuốc mới nhất thuộc nhóm Thienopyridin, có khả năng ức chế kết tập tiểu cầu mạnh mẽ hơn, nhanh hơn và ổn định hơn so với Clopidogrel Sau khi vào ống tiêu hóa, prasugrel được thủy phân nhanh chóng bởi esterase trong ruột và máu thành chất chuyển hóa trung gian Chất này sau đó được biến đổi thành chất chuyển hóa có hoạt tính nhờ enzym cytochrome P450, có khả năng ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 của tiểu cầu Nhờ vào cơ chế này, Prasugrel khắc phục được nhược điểm của Clopidogrel.
Thuốc ức chế P2Y12 không thuộc nhóm thienopyridin là loại thuốc ức chế trực tiếp có khả năng hồi phục thụ thể P2Y12 của tiểu cầu, cho thấy tiềm năng lớn qua nghiên cứu PLATO (Nghiên cứu ức chế tiểu cầu và kết quả bệnh nhân).
1.4.3 Cá c thuốc ức chế thụ thể Glycoprotein IIb/IIIa của tiểu cầu
Abciximab, Eptifibatide và Tirofiban là các thuốc ức chế glycoprotein IIb/IIIa, có tác dụng ngăn chặn liên kết chéo giữa các tiểu cầu do fibrin, từ đó ức chế quá trình hình thành huyết khối.
1.4.4 Thuốc làm tăng AMP vòng tiểu cầu
Dipyridamol ức chế enzym phosphodiesterase, từ đó làm tăng nồng độ AMP vòng trong cơ thể Điều này giúp ngăn chặn sự ngưng tập, phóng thích và kết dính của tiểu cầu, góp phần vào hiệu quả điều trị các bệnh lý liên quan đến tim mạch.
22] Thuốc có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu nhưng không làm kéo dài thời gian chảy máu [23]
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu
Mẫu Sâm vũ diệp toàn cây tươi thu hái ở Sa Pa – Lào Cai vào tháng 3 năm
Sâm vũ diệp, tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem, được giám định bởi chuyên gia thực vật học tại Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu vào năm 2016 Phần dưới mặt đất của cây được rửa sạch, thái lát mỏng, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 40-50 °C cho đến khi đạt độ ẩm dưới 10% Sau khi được xay nhỏ và bảo quản trong túi nilon, mẫu được chiết xuất bằng ethanol 50% với tỷ lệ dung môi và dược liệu là 7:1 ở nhiệt độ 90 °C Quá trình chiết diễn ra trong 2 giờ cho mỗi lần, thực hiện 3 lần mỗi mẻ, và dịch chiết cồn 50% thu được sẽ được cô đặc dưới áp suất giảm cho đến khi tạo thành cao lỏng với tỷ lệ 1:1.
Cao chiết toàn phần của Sâm vũ diệp chứa nhiều tạp chất như hợp chất ít phân cực, dầu béo và các saccarid tan trong nước Để loại bỏ các tạp chất này, phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với n-hexan được thực hiện theo tỷ lệ 1:1 qua ba lần, sau đó dung môi n-hexan được cất để tái sử dụng Lớp nước sau chiết chứa toàn bộ saponin đã được tách khỏi dầu béo và tạp chất Cuối cùng, để loại bỏ các saccarid tan trong nước, sắc ký hấp phụ bằng resin diaion HP-20 được sử dụng và rửa giải bằng EtOH 96%.
Dịch sau loại tạp được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cao đặc, sau đó sấy chân không ở nhiệt độ 55-60 °C trong 24 giờ Sử dụng máy xay dược liệu để nghiền cao thành dạng bột, rây qua rây 355 để thu được cao khô định chuẩn giàu saponin của Sâm vũ diệp Sản phẩm được bảo quản trong túi nilon kín ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Các phân đoạn chiết cao khô định chuẩn này được tiến hành tại bộ môn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, do TS Nguyễn Hữu Tùng cung cấp.
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 2.1 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp [27]
Mẫu toàn cây tươi Tam thất hoang thu hái ở Sa Pa - Lào Cai ngày 26 tháng
10 năm 2015 được giám định tên khoa học là Tam thất hoang- Panax stipuleanatus
H T Tsai et K M Feng Thân rễ Tam thất hoang rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 °C đạt độ ẩm dưới 10 %, xay nhỏ, thu được bột thô
Bột thô Tam thất được chiết xuất bằng dung môi EtOH 50% với tỷ lệ 10:1 ở nhiệt độ 90 °C Quá trình chiết diễn ra trong 1 giờ cho mỗi lần chiết, thực hiện 3 lần cho mỗi mẻ Dịch chiết cồn 50% thu được sẽ được cô dưới áp suất giảm để tạo ra cao lỏng với tỷ lệ 1:20.
Quá trình loại tạp sử dụng phương pháp chiết lỏng-rắn với nhựa hấp phụ D101 và rửa giải bằng EtOH 80% Dịch rửa giải được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cao đặc, sau đó sấy chân không ở 55-60°C trong 24 giờ Sau khi sử dụng máy xay dược liệu để nghiền cao thành dạng bột và rây qua rây 355, thu được cao tam thất hoang, được bảo quản trong túi nilon kín ở nhiệt độ phòng.
Tại Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu, Trường Đại học Y Dược, VNU, quy trình chiết xuất cao giàu hoạt chất từ tam thất hoang được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đỗ Thị Hà.
Hình 2.2 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang [8]
Trong nghiên cứu này, các vật liệu sử dụng bao gồm xylanh 10 mL và 20 mL, kim lấy máu 20 G, ống nghiệm chống đông citrate, ống nghiệm sạch, ống đo mẫu, viên khuấy từ, đầu côn, micropipet, găng tay, máy ly tâm, máy đo độ ngưng tập tiểu cầu chronolog, ADP, dung môi DMSO (Dimethyl sulfoxide), thuốc thử từ cao dược liệu, và thuốc chứng dương aspirin (Aspegic 100mg).
Bột thô tam thất hoang
Cô dưới áp suất giảm
- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
- Sấy chân không tại 55-60 o C, 24 h Kiểm tra TLC Đóng gói Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Sau khi nhận được sự đồng ý từ hội đồng đạo đức, chúng tôi tiến hành thu thập máu từ những người tình nguyện khỏe mạnh, tuân thủ tuyên bố Helsinki về đạo đức nghiên cứu Người tham gia được thông báo về lý do, mục đích, lợi ích và rủi ro của nghiên cứu, đồng thời ký vào bản đồng thuận tham gia Những người tình nguyện phải đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ đã được xác định.
Tiêu chuẩn lựa chọn người tình nguyện bao gồm: sức khỏe tốt, độ tuổi từ 20 đến 25, không hút thuốc lá, không có tiền sử bệnh lý về máu, và không đang sử dụng thuốc ảnh hưởng đến quá trình đông máu hoặc tiêu fibrin.
Tiêu chuẩn loại trừ bao gồm: sự bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận có hiện tượng vỡ hồng cầu, và những người mới hiến máu với lượng lớn hơn 450 mL trong vòng 28 ngày trước đó.
Tất cả các nghiên cứu đều được tiến hành vào buổi sáng với tình nguyện viên đã nhịn ăn trong 12 giờ trước khi lấy máu Máu tĩnh mạch toàn phần được thu thập bằng kim tiêm cỡ 20 gauge.
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp đo độ đục của Born: đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy Chrono - Log CA - 560 của Mỹ [34]
Lấy 10-15 ml máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh chống đông bằng natri citrate 3,8 % (1:10); người tình nguyện phải nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu, có số lượng tiểu cầu từ 200-400 G/L, hematocrit bình thường
Để đảm bảo máu được chống đông hoàn toàn, cần lắc đều trước khi ly tâm Tiến hành ly tâm ở tốc độ 500 vòng trong 10 phút để thu thập huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) vào ống falcon vô khuẩn có nút và bảo quản ở nhiệt độ phòng Sau đó, ly tâm phần huyết tương còn lại ở tốc độ cao 3000 vòng trong 10 phút để thu được huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP).
Cao chiết saponin từ Tam thất hoang và Sâm vũ diệp có nồng độ 200 mg/mL trong DMSO 10% Các phân đoạn saponin được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong dung dịch nước muối sinh lý để đạt nồng độ cuối cùng là 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 và 1,6 mg/mL Sử dụng DMSO 0,1 cho nghiên cứu.
% làm chứng âm Nghiên cứu thăm dò từ giai đoạn trước của Lê Thị Tâm năm
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Năm 2017, nghiên cứu đã thử nghiệm Aspirin với các liều 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,75 mg/mL và 1 mg/mL, trong đó liều 1 mg/mL cho hiệu quả tối ưu, đạt được mức ức chế kết tập tiểu cầu mong muốn Do đó, liều 1 mg/mL đã được chọn làm liều chứng dương.
Tiến hành đo mẫu trên máy Chrono - Log CA – 560
Cho 450 µl huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) và 50 µl DMSO 0,1% vào cuvet thủy tinh không chứa bi khuấy từ Chia 450 µl huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) vào cuvet chứa bi khuấy từ, sau đó thêm 50 µl hóa chất gồm DMSO 0,1%, Aspirin (1 mg/mL) và các phân đoạn giàu saponin của Sâm vũ diệp hoặc Tam thất hoang với các nồng độ 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 mg/mL Ủ hỗn hợp trong 5 phút ở 37 °C, sau đó chuyển ống vào vị trí đo trên máy Thêm 5 µl chất kết tập ADP vào ống giàu tiểu cầu, chờ máy chạy và tự động đo mẫu Ghi lại kết quả bao gồm phần trăm NTTC tối đa (MPA), tốc độ thay đổi ngưng tập trong 1 phút (Slope) và diện tích dưới đường cong (AUC) Lặp lại thí nghiệm 7 lần ở mỗi nồng độ, quy trình thí nghiệm được thể hiện trong hình 2.3.
Hình 2.3 Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP
Hình 2.4 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP
Sử dụng chất kết tập ADP 5 àL kích thích receptor ADP trên bề mặt tiểu cầu, dẫn đến giải phóng Canxi nội bào và acid arachidonic từ màng phospholipid Quá trình này làm thay đổi hình dạng tiểu cầu từ hình đĩa sang hình cầu gai, tạo ra đáp ứng nguyên phát, tiếp theo là đáp ứng thứ phát với sự giải phóng hạt đặc qua hệ thống kênh mở, bao gồm adenine nucleotide, serotonin, và thromboxan Đáp ứng này được gọi là sóng ngưng tập nguyên phát và thứ phát, và quá trình này được chia thành 5 giai đoạn.
1- Trước khi đưa chất kết tập ADP vào cuvet
2- Chất kết tập được thêm vào, đồ thì dạng đỉnh nhọn
3- Ánh sáng truyền qua cuvet giảm, tiểu cầu thay đổi hình dạng (kết quả của việc ADP bám vào tiểu cầu)
4- Tăng ánh sáng truyền qua cuvet, tạo sóng ngưng tập nguyên phát
5- Nếu kích thích không đủ mạnh, tiểu cầu sẽ không ngưng tập được (dữ liệu không hiển thị được) Nếu đủ mạnh, sẽ taọ sóng ngưng tập thứ phát của ADP – ngưng tập tăng lên Sự uốn cong nhẹ ở cuối giai đoạn 4 (mũi tên) cho
The School of Medicine and Pharmacy at VNU observes the initiation of secondary platelet aggregation, which releases various components such as fibrinogen, serotonin, thromboxane, and ADP, thereby enhancing the aggregation response.
Các thông số nghiên cứu
Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA) được thể hiện qua chỉ số Amplitude Mẫu thử và mẫu chứng dương được chuẩn hóa dựa trên độ ngưng tập tiểu cầu của DMSO, với MPA của DMSO được coi là 100% MPA (%) của Aspirin và cao từ Tam thất hoang và Sâm vũ diệp được tính toán theo công thức cụ thể ở các nồng độ khác nhau.
Bên cạnh độ ngưng tập tiểu cầu tối đa MPA, tốc độ thay đổi trong một phút (Slope) cũng là chỉ số quan trọng để đánh giá giai đoạn đầu của quá trình ngưng tập và hoạt hóa tiểu cầu Slope được xác định bằng cách vẽ một đường tiếp tuyến với đường ngưng tập sau giai đoạn tiểu cầu biến dạng (giai đoạn 4).
Mức độ ngưng tập tiểu cầu (NTTC) được đánh giá qua chỉ số diện tích dưới đường cong (AUC), tính từ thời điểm tiểu cầu biến dạng cho đến khi đạt mức ngưng tập tối đa Chỉ số AUC là yếu tố quan trọng nhất trong việc xác định mức độ NTTC.
Ba chỉ số quan trọng trong đánh giá chức năng tiểu cầu của bệnh nhân bao gồm tốc độ thay đổi ngưng tập, phần trăm ngưng tập tối đa và các giai đoạn liên quan Những chỉ số này không chỉ được các nhà lâm sàng quan tâm mà còn có giá trị lớn trong việc phân loại các dạng bệnh lý tiểu cầu.
Hình 2.6 Chỉ số diện tích dưới đường cong - AUC Phương pháp phân tích số liệu
Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0, với kết quả được trình bày dưới dạng X ± SE (X là giá trị trung bình, SE là sai số chuẩn) Để so sánh giá trị trung bình giữa các nhóm, sử dụng phương pháp Test one-way ANOVA, kèm theo kiểm định hậu Tukey hoặc Dunnett’T3 cho từng nhóm Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả
3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp
3.1.1.1 Ảnh hưởng của cao giàu saponin Sâm vũ diệp lên mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC)
Bảng 3.1 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin Sâm vũ diệp
Lô Thuốc dùng N AUC P so với lô dùng DMSO
P so với lô dùng Aspirin
Nghiên cứu cho thấy cao giàu saponin Sâm vũ diệp không làm thay đổi mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng Tuy nhiên, ở liều 0,8 mg/mL và 1,6 mg/mL, Sâm vũ diệp đã giảm mức độ NTTC so với lô chứng DMSO, với AUC lần lượt là 213,78±21,50 và 145,93±12,76, trong khi lô chứng DMSO có AUC là 255,05±20,90.
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
3.1.1.2 Ảnh hưởng của cao giàu saponin Sâm vũ diệp đến phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA)
Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin Sâm vũ diệp
Lô Thuốc dùng N MPA (%) P so với lô dùng DMSO
P so với lô dùng Aspirin
Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy nồng độ 0,8 và 1,6 mg/mL của cao saponin từ Sâm vũ diệp có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu đáng kể so với nhóm chứng DMSO (p0,05).
3.1.1.4 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp
Phần trăm NTTC tối đa (Maximum platelet aggregation -
Phần trăm NTTC điểm cuối (Final platelet aggregation -
Hình 3.1 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp
(A: DMSO; B: Aspirin 1 mg/mL; C: Sâm vũ diệp 0,1 mg/mL; D: Sâm vũ diệp 0,2 mg/mL;
E: Sâm vũ diệp 0,4 mg/mL; F: Sâm vũ diệp 0,8 mg/mL; G: Sâm vũ diệp 1,6 mg/mL)
Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU
Cao giàu saponin của Sâm vũ diệp ở liều 0,8 mg/mL cho thấy tác dụng giảm tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu tương đương với Aspirin 1 mg/mL, trong khi liều 1,6 mg/mL mạnh hơn so với Aspirin Ngược lại, lô chứng âm DMSO không có tác dụng Sau khi đạt ngưng tập tối đa, tiểu cầu có xu hướng phục hồi, cho thấy rằng sau 5 phút, cả Aspirin và phân đoạn cao giàu saponin của Sâm vũ diệp đều có xu hướng phân rã ngưng tập, dẫn đến sự giảm tiếp tục trong tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu.
3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Tam thất hoang
3.1.2.1 Ảnh hưởng của cao giàu saponin Tam thất hoang lên mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC)
Bảng 3.4 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin Tam thất hoang
Lô Thuốc dùng N AUC P so với lô dùng DMSO
P so với lô dùng Aspirin
Cao giàu saponin của Tam thất hoang ở liều 0,8 và 1,6 mg/mL đã chứng minh khả năng giảm ngưng tập tiểu cầu rõ rệt so với nhóm chứng DMSO Đặc biệt, liều 1,6 mg/mL cho hiệu quả giảm ngưng tập tiểu cầu mạnh hơn cả Aspirin với p