Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 có độ tinh khiết trên 95% từ dược liệu sâm vũ diệp. Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu phổ. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được.

TỔNG QUAN

CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU

Chất chuẩn, hay còn gọi là chất chuẩn đối chiếu, là yếu tố quan trọng trong việc đánh giá nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm theo các quy trình đã được xác định Việc sử dụng chất chuẩn giúp đảm bảo rằng kết quả phân tích đạt được độ chính xác và độ tin cậy cao.

Chất chuẩn đối chiếu là một phần quan trọng của đo lường và thiết lập tính khả thi trong so sánh (comparability) và có thể truy nguyên được (traceability)[6]

Theo dược điển Việt Nam V, chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định chính xác để sử dụng trong các phép thử hóa học, vật lý và sinh học Trong các phép thử này, các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất thử Độ tinh khiết của chất đối chiếu phải phù hợp với mục đích sử dụng.

Theo định nghĩa của FDA, chất chuẩn đối chiếu là một lô hợp chất thuốc được chế tạo đặc biệt qua tổng hợp hoặc tinh chế nguyên liệu, được xác minh qua các thử nghiệm phân tích để đảm bảo tính xác thực và độ tinh khiết cao Chất này thường được sử dụng để phân giải cấu trúc và làm chuẩn cho các chất chuẩn làm việc.

Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau:

- Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại

- Định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến, quang phổ huỳnh quang

- Các phép thử định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký

- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật

- Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lượng

- Các phép thử sinh học

- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng [3]

Ngoài ra chất đối chiếu còn dùng để:

- Thẩm định một phương pháp mới

- Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

- Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hóa [15]

Chất chuẩn trong lĩnh vực khoa học dược phẩm được phân loại thành hai loại chính: chất chuẩn sơ cấp (primary standards) và chất chuẩn thứ cấp (secondary standards).

Chất chuẩn sơ cấp là các hợp chất có chất lượng và độ tinh khiết được xác định độc lập, được công nhận mà không cần tham chiếu đến các tiêu chuẩn khác.

Chất chuẩn thứ cấp là các hợp chất có chất lượng và độ tinh khiết được xác định thông qua việc so sánh với chất chuẩn phân tích.

So sánh 2 loại chất chuẩn:

B ả ng 1 So sánh 2 lo ạ i ch ấ t chu ẩ n [18]

Chất chuẩn sơ cấp Chất chuẩn thứ cấp

Tên gọi khác Chất chuẩn gốc Chất chuẩn phòng thí nghiệm, chất chuẩn làm việc Độ tinh khiết 99.5% 95%

Chất lượng Cao Kém hơn chất chuẩn sơ cấp Đặc tính Được chấp nhận mà không cần so sánh

Yêu cầu phải so sánh với chất chuẩn phân tích

- Dùng trong mục đích công nghiệp:

+ Quá trình phát triển thuốc + Nghiên cứu và phát triển (R&D) + Chuẩn hóa dụng cụ, phương pháp và vật liệu

+ Chuẩn hóa chất chuẩn thứ cấp

Dùng trong phòng thí nghiệm và kiểm tra chất lượng (QC)

Như thuốc hoặc mỹ phẩm cho người tiêu dùng

Cho mục đích nghiên cứu yêu cầu độ tinh khiết trên 95%

Tính sẵn có Tổng hợp độc lập và lượng sẵn có vô cùng ít Được cung cấp từ nhà máy Bulk hoặc bào chế trong phòng thí nghiệm

Giá cả Rất cao Thấp hơn

1.1.4 Sự cần thiết của việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Hiện nay, trên thế giới đã có một số chất chuẩn đặc trưng của dược liệu với mức độ tinh khiết cao Tuy nhiên, chỉ có một vài chất chuẩn có sẵn để mua, và giá cả thường rất đắt Việc nghiên cứu và sản xuất các chất chuẩn này hỗ trợ hiệu quả cho công tác kiểm tra và giám sát chất lượng thuốc cũng như nguyên liệu làm thuốc.

Hiện nay, Việt Nam có hơn 500 chất chuẩn, bao gồm chất chuẩn Quốc tế, khu vực, Dược điển Việt Nam, phòng thí nghiệm và chuẩn chính Tuy nhiên, chủ yếu là chất chuẩn hóa học, trong khi chất chuẩn từ dược liệu lại rất ít Sự thiếu hụt này đang gây nhiều khó khăn cho ngành Dược.

Việc kiểm tra và giám sát các dược liệu cùng các dạng bào chế có nguồn gốc từ dược liệu đang lưu hành trên thị trường hiện nay chưa được thực hiện một cách đầy đủ và toàn diện.

Việc không tiêu chuẩn hóa các thuốc sản xuất trong nước từ dược liệu hoặc chiết xuất dược liệu về hàm lượng dược chất đã gây khó khăn trong việc bào chế thuốc chất lượng cao, ảnh hưởng đến nhu cầu phòng bệnh và chữa bệnh.

Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn cho các hợp chất chiết xuất từ dược liệu là một nhiệm vụ khoa học công nghệ quan trọng, đáp ứng nhu cầu thực tiễn khách quan.

1.1.5 Phương pháp thiết lập chất chuẩn

1.1.5.1 Thi ế t l ậ p, b ả o qu ả n và phân ph ố i ch ấ t chu ẩn sơ cấ p

Quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp bao gồm các bước như sau [34]:

- Đánh giá nhu cầu thiết lập chất chuẩn đối chiếu (CCĐC)

- Lựa chọn nguồn nguyên liệu dùng để thiết lập CCĐC từ nhà cung cấp

- Đánh giá chất chuẩn đối chiếu:

+ CCĐC dùng cho phép thử định tính: Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá từ một phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn

CCĐC được sử dụng để thử độ tinh khiết, yêu cầu mô tả đặc tính rộng hơn so với phép thử định tính, đặc biệt trong các phép thử giới hạn Kỹ thuật SKLM thường yêu cầu độ tinh khiết tối thiểu ≥ 90%, trong khi HPLC hoặc GC yêu cầu cao hơn, ≥ 95% Thông thường, chỉ cần một phòng thí nghiệm tham gia đánh giá CCĐC cho phép thử độ tinh khiết Nếu CCĐC được phân lập hoặc điều chế lần đầu tiên, cần thực hiện một số phép thử hóa lý như phổ NMR, phổ MS và phân tích nguyên tố để mô tả đặc tính.

Các chất chuẩn định lượng (CCĐC) có phạm vi thử nghiệm rộng, sử dụng nhiều kỹ thuật đã được thiết lập và thẩm định, bao gồm cả các phương pháp trong dược điển Khi định lượng CCĐC bằng phương pháp không đặc hiệu như đo quang phổ UV hoặc so màu, cần xác định hàm lượng nước và dung môi tồn dư Đối với các phương pháp đặc hiệu, việc xác định hàm lượng tạp chất là cần thiết Ngoài ra, khuyến khích sử dụng các phương pháp tuyệt đối để định lượng chất chính.

+ Các CCĐC dùng để hiệu chuẩn thiết bị: Yêu cầu phạm vi các test đánh giá như đối với định lượng

- Phân tích định tính, định lượng để đánh giá chất chuẩn sơ cấp

- Xác định giá trị ấn định

- Xác định thông tin cần cung cấp kèm theo chất chuẩn sơ cấp

- Đóng gói, bảo quản, nghiên cứu độ ổn định

1.1.5.2 Thi ết lập, bảo quản v à phân ph ối chất chuẩn thứ cấp

Các hội đồng dược điển quốc gia hoặc phòng thí nghiệm được ủy quyền xây dựng quy trình thiết lập chất chuẩn thứ cấp dựa trên quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp Việc này thường diễn ra khi nguồn chất chuẩn sơ cấp không đủ đáp ứng nhu cầu trong nghiên cứu và đảm bảo chất lượng thuốc.

Việc phân loại chất chuẩn làm việc có ý nghĩa tương đối, vì một chất chuẩn của khu vực hay quốc gia có thể được xem là chất chuẩn sơ cấp để thiết lập các chất chuẩn trong phòng thí nghiệm hoặc cho các nhà sản xuất dược phẩm Những chất chuẩn này được gọi là chuẩn liên kết.

TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP

Sâm vũ diệp có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem [2,12], thuộc chi

Nhân sâm (Panax L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae), bộ Hoa tán (Apiales) [1]

SVD là một loại cây thân thảo sống lâu năm, ưa bóng và ẩm Cây có thân rễ dài với nhiều đốt và vết sẹo do thân rụng hàng năm Thân khí sinh mảnh, cao từ 20 đến 30 cm, thường mọc thẳng và rỗng ở giữa, có vạch dọc Vào mùa đông, cây thường lụi và bắt đầu mọc chồi mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3.

Lá kép chân vịt thường có từ 2 đến 3 chiếc mọc theo hình vòng, với lá chét gồm 5 đến 7 lá (đôi khi chỉ có 3 lá) có hình thuôn Kích thước lá dài từ 2,5 đến 14 cm và rộng từ 1,5 đến 4 cm, có gốc tròn và đầu thuôn nhọn Các lá này có đặc điểm xẻ thùy không đều, mép lá có răng cưa và bề mặt có lông.

Cụm hoa tán đơn mọc ở ngọn, có cuống dài từ 5 đến 10 cm và chứa từ 20 đến 90 hoa Hoa có màu trắng đục, gồm 5 cánh và bầu 2-3 ô Quả hình cầu hoặc cầu dẹt, đường kính từ 0,6 đến 1,2 cm, khi chín có màu đỏ với chấm đen ở đầu, chứa 1-2 hạt Hạt có hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng, vỏ cứng và có rốn hạt.

Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

SVD là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta

SVD được phân bố rộng rãi tại các quốc gia như Trung Quốc, Ấn Độ và Nepal, đặc biệt là ở vùng cận Himalaya Tại Việt Nam, dược liệu này chủ yếu tìm thấy ở dãy núi Hoàng Liên Sơn, thuộc huyện.

Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc [2,11-12] ở độ cao 1900-2400 m, trong rừng ẩm

Saponin là thành phần chủ yếu có trong lá và rễ cây SVD, bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng cao và một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn Các hợp chất chính có hoạt tính trong nhóm dược liệu này bao gồm ginsenoside, notoginsenoside và chikusetsusaponin.

Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập thành công 13 saponin khung dammaran từ lá của một loại dược liệu, trong đó có nhiều ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3.

Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận chỉ ra rằng thân rễ và rễ củ của SVD chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin, bên cạnh đó còn có acid béo và acid amin.

Năm 2003, nghiên cứu đã xác định rằng thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan, bao gồm các hợp chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1 và ginsenosid Ro Bên cạnh đó, còn có các saponin triterpen thuộc nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2.

Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được hai saponin từ rễ của SVD: stipuleanosid R2 và aralosid A methyl este [30]

Như vậy, tổng cộng có 28 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần của cây SVD

Hình 1.2 Các h ợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [2 4]

Năm 2016, một nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư từ 57 loại cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc, trong đó Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) nổi bật với khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư.

Năm 2017, nghiên cứu cho thấy SVD có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro với các phân đoạn khác nhau và các mức liều cụ thể Cụ thể, phân đoạn tổng, n-butanol và ethylacetat thể hiện tác dụng ở các liều 0,5-1-2-5 mg/mL, trong khi phân đoạn ether có hiệu quả ở các mức liều 1-2-5 mg/mL.

Me Methyl Ara(f) α- L-arabinofuranosyl Ara(p) α-L-arabinopyranosyl Glc β-D-glucopyranosyl Xyl β-O-xylopyranosyl

Nghiên cứu cho thấy các thành phần ginsenoside Rh1, Rh2, Rg1, Rg2 và chikusetsusaponin L5 có khả năng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase hơn 50% Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin, một sắc tố da Khi enzyme này hoạt động quá mức, sẽ dẫn đến tình trạng da sạm màu, đen và hình thành nám.

Rễ cây SVD ngâm rượu và chiết xuất dưới dạng tinh sâm rất tốt cho sức khỏe, đặc biệt là chức năng sinh dục Người dân vùng trồng còn sử dụng thân và lá để nấu cao, pha với nước hoặc rượu, mang lại tác dụng tương tự như rễ Tại Trung Quốc, SVD được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết và các tổn thương do va chạm.

TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2

Stipuleanosid R2 là hợp chất saponin quan trọng, chiếm tỷ lệ lớn nhất trong SVD hiện nay và đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu từ các nhà khoa học Hợp chất này đã được phân lập từ một số dược liệu như sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis và Aralia elata.

1.2.1 Công thức hóa học và đặc điểm

Hình 1.3 C ấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 [ 37]

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:

(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [33]

Tính chất lý hóa: Chất bột màu trắng, độ tan: 0,57 g/l [38], điểm nóng chảy 210 -

Nghiên cứu in vitro cho thấy stipuleanosid R2 có khả năng gây độc tế bào ung thư, đặc biệt là ức chế sự gia tăng của các tế bào ung thư bạch cầu như K562 và U937 Ngoài ra, hợp chất này còn có tác dụng chống oxy hóa, hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và giảm lipid máu.

1.2.3 Các nghiên cứu về stipuleanosid R2

Hiện nay, nghiên cứu về hợp chất stipuleanosid R2 trong dược liệu vẫn còn hạn chế cả ở trong nước và quốc tế Các công trình hiện tại chủ yếu tập trung vào việc phân lập hợp chất này từ dược liệu và phát triển phương pháp định lượng trong thân rễ SVD Để nâng cao chất lượng nghiên cứu, việc thiết lập các tiêu chuẩn cho chất chuẩn stipuleanosid R2 là rất cần thiết.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được trồng và thu hái ở Sa Pa, Lào Cai là dược liệu được nghiên cứu trong đề tài này

Thân rễ SVD có đặc điểm là nhiều đốt, vết sẹo, và hình dạng cong ngoằn ngoèo, với chiều dài từ 7-12 cm và đường kính 1,2-1,8 cm Chúng có thể chất cứng chắc, giòn và dễ bẻ gãy, mặt bẻ lởm chởm với màu vàng nâu nhạt Ngoài ra, thân rễ này còn có mùi thơm nhẹ, vị đắng và hơi ngọt.

Để xử lý mẫu thân rễ SVD, cần rửa sạch, để khô, thái lát mỏng và sấy khô ở nhiệt độ 50°C cho đến khi hàm ẩm đạt dưới 10% Sau đó, bảo quản trong túi nilong kín và để nơi khô ráo, thoáng mát để sử dụng trong nghiên cứu.

Hình 2.1 M ẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào

- Dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng (chiết xuất dược liệu, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột) gồm:

+ Ethanol (EtOH) + Methanol (MeOH) + n-Hexan

+ Dicloromethan (CH 2 Cl 2 ) + Cloroform (CHCl 3 )

- Chất chuẩn liên kết stipuleanosid R2 (Wako Chemicals, Nhật Bản, độ tinh

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU khiết 98%, mã sản phẩm 155-01701)

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, acetonitril) của Merck, Đức

- Hạt nhồi dùng cho sắc ký cột loại:

+ Pha thường silica gel 60 (230-400 mesh, Nacalai Tesque, Nhật Bản) + Pha đảo YMC ODS-A (50 μm, YMC Co Ltd., Nhật Bản)

Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại Kieselgel 60 F254 và TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức) được sử dụng để phát hiện chất Việc phát hiện có thể thực hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc bằng cách sử dụng dung dịch thuốc thử.

H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị và dụng cụ đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức), tủ hút

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa - Thụy Sĩ)

- Cân xác định hàm ẩm Prescisa HA 60

- Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc)

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ)

- Máy đo điểm nóng chảy BUCHI 535

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Cột sắc ký các loại kích cỡ

- Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 mL, ống nghiệm, pipet chính xác

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 từ dược liệu sâm vũ diệp

- Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu phổ

- Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế, xác định cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2

2.3.1.1 Phương pháp chiết xuất các hợp chất saponin từ dược liệu

Nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp cho thấy saponin là thành phần chính Để xác định phương pháp chiết xuất phù hợp nhất cho thân rễ SVD, cần tham khảo tài liệu về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu.

- Phương pháp chiết mẫu: chiết siêu âm với dung môi ethanol 70%

- Phương pháp chiết phân đoạn: chiết lỏng-lỏng

1 Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết siêu âm bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 40 0 C, chiết 3 lần

2 Thu dịch chiết, sau đó lọc dịch chiết qua giấy lọc, gom lại, cất quay loại dung môi dưới áp suất giảm, đun cách thủy thu được cao tổng ethanol

3 Cao ethanol thu được cho phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetat và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ 1:1

4 Các phân đoạn thu được cho cất quay chân không dưới áp suất giảm để thu hồi dung môi, đun cách thủy thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn

2.3.1.2 Phương pháp phân lập v à tinh ch ế stipuleanosid R 2 trong cao r ễ SVD

Để tiến hành phân lập n-butanol, chúng ta lựa chọn phân đoạn này và áp dụng phương pháp sắc ký cột pha thường cùng với sắc ký cột pha đảo Quá trình phân lập chất được theo dõi thông qua sắc ký lớp mỏng.

Sắc ký cột (SKC) sử dụng chất hấp phụ là silica gel pha thường silica gel 60 (0,04 - 0,063 nm, Nacalai Tesque, Inc., Nhật) và pha đảo YMC ODS-A (50àm, YMC Co Ltd, Nhật) Quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM).

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM): được thực hiện trên bản mỏng Silicagel 60 F254

Merk và Silicagel RP-18 F 254 S đã được hoạt hóa ở 105°C trong 1 giờ Để phát hiện chất, có thể sử dụng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, hoặc dùng dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng trên bếp điện từ cho đến khi xuất hiện màu.

Tinh chế chất phân lập bằng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi thích hợp

2.3.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập được

Sử dụng các phương pháp phổ như phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) kết hợp với việc so sánh dữ liệu thu được với các tài liệu tham khảo đã công bố là cách hiệu quả để xác định cấu trúc của chất phân lập.

2.3.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất

Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng chuẩn Việc nhận dạng chất dựa vào:

- So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện

So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lý và hằng số vật lý của chất phân tích với tài liệu khoa học hoặc thông tin đã công bố giúp xác định chính xác đối tượng nghiên cứu Việc tập hợp các dữ liệu chuẩn này là cần thiết để khẳng định hợp chất đúng như mong đợi.

Các phương pháp xây dựng bộ dữ liệu bao gồm: đo điểm chảy, đo phổ tử ngoại khả kiến trong dung môi MeOH, đo phổ hồng ngoại trong KBr, và các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân như H1 NMR, C13 NMR, DEPT, cũng như phổ 2 chiều như COSY, HMBC, HSQC, và đo phổ khối lượng (MS).

2.3.3 Phương pháp định tính, định lượng stipuleanosid R2 trong SVD bằng HPLC

The analysis of high-performance liquid chromatography (HPLC) is conducted using the Agilent 1260 Infinity Series system from Agilent Technologies, USA, which features a DAD detector and an automatic sample injection unit.

 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Khảo sát các điều kiện sắc ký dựa trên tài liệu hiện có của phòng thí nghiệm, bao gồm bước sóng, thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, và thể tích bơm mẫu, nhằm đảm bảo phân tích định tính và định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD.

 Nhận dạng các pic trên sắc ký đồ của chất stipuleanosid R2 phân lập được từ thân rễ SVD

Tiến hành sắc ký HPLC để phân tích mẫu chất phân lập và mẫu cao BuOH theo điều kiện đã chọn Nhận diện pic trên sắc ký đồ (SKĐ) của chất phân lập dựa vào thời gian lưu tương ứng với mẫu thử, đồng thời xác định hàm lượng hợp chất stipuleanosid R2 trong dược liệu thông qua tương quan diện tích pic trên SKĐ.

Yêu c ầu của chất sử dụng làm chất đối chiếu: Diện tích pic chính phải >

Trên sắc ký đồ, tỷ lệ của các pic chính đạt 95,0%, trong khi các pic phụ có tổng diện tích không vượt quá 5,0% so với tổng diện tích pic chính Các pic của pha động và những pic có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) nhỏ hơn 2/1 sẽ được loại bỏ khỏi phân tích.

Saponin trong thân rễ SVD đạt độ tinh khiết cần thiết, được sử dụng làm chất đối chiếu hóa học cho các phép phân tích định tính và kiểm nghiệm dược liệu SVD.

Hàm lượng stipuleanosid R2 trong dung dịch thử được tính theo công thức:

S T , S C : Diện tích pic stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng (mAU.min)

C c : Nồng độ của stipuleanosid R2 trong dung dịch chuẩn (mg/mL) m cân : Khối lượng mẫu cân thực nghiệm (mg) V: Thể tích dung dịch thử (mL)

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 trong Sâm vũ diệp

Cân 500 g thân rễ SVD (độ ẩm 7,81%) và chiết bằng phương pháp siêu âm ở 70°C với dung môi ethanol 70% trong 3 giờ (chiết 3 lần, mỗi lần 1500 mL) Dịch chiết ethanol được lọc qua giấy lọc, sau đó cất dưới áp suất giảm thu được 95,9 g cao chiết tổng ethanol Cao chiết này được hòa tan trong 500 mL nước cất và tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là ether, ethyl acetat và n-butanol.

Quá trình chiết xuất được thực hiện với mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL Các dịch chiết phân đoạn sau khi cất thu hồi dung môi và sấy dưới áp suất giảm cho ra 3 cặn tương ứng với từng phân đoạn: ether (5,82 g), ethyl acetat (2,70 g) và n-butanol (21,70 g), như mô tả trong hình 3.1.

Hàm lượng cắn 3 phân đoạn trong nguyên liệu khô được trình bày ở bảng 3.1

B ả ng 3.1 Hàm lượ ng c ắn các phân đoạ n chi ế t xu ấ t t ừ Sâm v ũ diệ p

STT Phân đoạn Khối lượng dược liệu (g)

% so với nguyên liệu khô

Phân đoạn n-butanol cho khối lượng cắn cao nhất, đạt 4,71% so với nguyên liệu khô, trong khi khối lượng cắn từ phân đoạn ether và ethyl acetat thấp hơn, lần lượt chỉ đạt 1,26% và 0,59%.

Hình 3.1 Quy trình chi ế t xu ấ t stipuleanosid R2

Phân lập các chất trong phân đoạn BuOH bằng sắc ký cột yêu cầu làm sạch cột và lót một lớp bông mỏng ở đáy Cột được nhồi bằng phương pháp nhồi ướt với silica gel pha thường hoặc silica gel pha đảo Sau đó, cột cần được ổn định trong 24 giờ.

Tiến hành phân lập sắc ký với cột nhồi silica gel (Φ85 mm × 80 mm) sử dụng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH theo gradient nồng độ từ tỷ lệ 5:1 đến 0:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL Các dịch rửa giải được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và gom các ống có cùng thành phần Dưới áp suất giảm, thu được 4 phân đoạn được ký hiệu là B1, B2, B3, B4.

Thân rễ SVD sau sơ chế

1 Chiết siêu âm DM EtOH 70%

3 Cất quay áp suất giảm

Cắn Ether Dịch còn lại

Cất quay áp suất giảm, sấy

Cắn EtOAc Dịch còn lại

Ethyl acetat, lắc, gạn Cất quay áp suất giảm, sấy

Cắn n-butanol Dịch còn lại n-butanol, lắc, gạn

Cất quay áp suất giảm, sấy

Từ phân đoạn B4 (5,1 g), hợp chất stipuleanisid R2 (180 mg) được thu nhận qua sắc ký cột pha đảo RP18 (Φ50 mm x 350 mm) bằng cách rửa giải đẳng dòng với hệ pha động MeOH - H2O (1:1, v/v, 1600 mL).

3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được bằng SKLM

Hợp chất stipuleanosid R2 được phân lập và kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM Silicagel RP-18 F 254 S trên cùng một bản mỏng Hệ dung môi sử dụng là Methanol : H2O với tỷ lệ 2:1, và kết quả sắc ký đồ được trình bày trong hình 3.3.

Hình 3.3 S ắc ký đồ của h ợp chất stipuleanosid R2 phân l ập được sau khi phun

Hình 3.2 S ơ đồ phân l ậ p h ợ p stipuleanosid R2 t ừ phân đoạ n n-butanol

SKC pha đảo C18 (Φ50 mm × 350 mm) MeOH - H 2 O

3,7 g Sắc ký cột Silica gel (Φ85 mm × 80 mm)

Sau khi phun thuốc thử, hợp chất stipuleanosid R2 xuất hiện vết màu hồng đậm, sau đó chuyển sang màu tím, đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen với hệ số Rf là 0,4, cho thấy chất phân lập là tinh khiết Để xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2, chúng tôi đã áp dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích bằng HPLC, được trình bày chi tiết ở mục 3.3.2.

3.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2 3.2.1 Đặc điểm cảm quan Đặc điểm cảm quan của đối tượng nghiên cứu được quan sát bằng mắt thường dưới ánh sáng ban ngày: bột màu trắng

Tiến hành đo điểm chảy theo DĐVN V (PL-168, phương pháp 1 – phương pháp đo trong mao quản) Thu được kết quả là:

B ả ng 3.2 K ế t qu ả đo điể m ch ả y c ủ a stipuleanosid R2

Lần đo Kết quả ( o C) Điểm chảy lý thuyết ( o C)

Góc quay cực của hợp chất stipuleanosid R2 là +7,5 (trong dung môi c 0,2, MeOH) Phổ ESI-MS cho thấy m/z 1087 [M-H], tương ứng với khối lượng phân tử M = 1088 Thông tin chi tiết về phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz), DEPT được trình bày trong bảng 3.3.

* c của stipuleanosid R2 đo trong CD3OD [25]; a Đo trong CD3OD, b 125 MHz, c 500 MHz

Hợp chất stipuleanosid R2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng, năng suất quay cực riêng [α] =+7,5 (c 0,2, MeOH) Hợp chất này phản ứng với H2SO 4 10

Trong quá trình hơ nóng, mẫu xuất hiện màu hồng đậm và sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng của các dẫn xuất triterpen Phân tích phổ 13C NMR và DEPT cho thấy có 7 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 6 nguyên tử C bậc 4, cùng với 1 nhóm COOR Phổ 13C NMR của stipuleanosid R2 ghi nhận tín hiệu của 30 carbon, cho thấy đây là một saponin với phần aglycon là triterpene khung oleanan đã được xác nhận từ sâm vũ diệp Ngoài ra, phổ 1H NMR xuất hiện 7 tín hiệu singlet của các nhóm methyl bậc ba tại các vị trí δ 0,81, 0,85, 0,93, 0,95, 0,96, 1,05 và 1,17.

CH 3 , s, CH 3 -25, 26, 24, 23, 30, 29, 27), một nối đôi ở C-12/C-13 với sự có mặt của tín hiệu tại [δ 5,27 (1H, br s, H-12)] Ngoài ra trên phổ này còn xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng trong vùng từ δ 3,0-4,0 đặc trưng cho sự có mặt của các nhóm

The article discusses the oxymetin and oxymethylen structures consisting of four sugar molecules, which include one unit of glucuronic acid (GluA), two units of glucose (Glc), and one unit of arabinofuranose (Ara(f)) These components are identified by their anomeric proton signals at δ 4.01 (1H, d, J = 1.0).

Trên phổ 13 C NMR, có 53 tín hiệu nguyên tử cacbon, trong đó 23 tín hiệu thuộc bốn đơn vị đường [GluA, 2 Glc và Ara(f)], và 30 tín hiệu còn lại thuộc phần aglycon oleanolic acid Các tín hiệu này bao gồm một oxymethin tại δ 91,03 (C-3), nối đôi C-12/C-13 tại δ 123,8 và 144,7 ppm, cùng với một nhóm carbonyl acid carboxylic tại δ 178,1 (C-28) Phổ khối ESI-MS của stipuleanosid R2 xuất hiện pic ion tại 1087 [M-H] -, phù hợp với công thức phân tử C53H84O23 (M = 1088) Những dữ kiện phổ này, kết hợp với so sánh với tài liệu đã được công bố, cho phép xác định cấu trúc hóa học chính xác là stipuleanosid R2.

Hình 3.4 C ấ u trúc hóa h ọ c c ủ a h ợ p ch ấ t stipuleanosid R2

Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được bằng HPLC 22 1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

3.3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Trong luận văn Thạc sĩ của Nguyễn Thị Thu Thủy, đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp” được trình bày với phương pháp nghiên cứu chi tiết Bài viết tập trung vào việc phân tích và xác định các thành phần saponin có trong thân rễ của sâm vũ diệp, nhằm làm rõ giá trị dược liệu và ứng dụng của loại cây này trong y học Phương pháp nghiên cứu được áp dụng bao gồm thu thập mẫu, phân tích hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của các thành phần saponin.

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích hợp chất saponin bằng phương pháp định lượng HPLC tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity

- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)

- Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203nm

- Tốc độ dòng: 0,8mL/phút

- Thể thớch bơm mẫu: 20àl

- Dung môi pha mẫu: Methanol

- Pha động: Acetonitril (kênh A) : 0,5% acid acetic/H 2 O (kênh B) với chương trình gradient như bảng 3.4

B ảng 3.4 Chương tr ình dung môi

3.3.2 Nhận dạng pic trên sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được

Pha mẫu stipuleanosid R2 phân lập, sử dụng cân phân tích để cân chính xác khoảng 1,0 mg chất Sau đó, hòa tan trong methanol để tạo dung dịch có nồng độ 1000 µg/mL, tiếp theo siêu âm trong 10 phút và lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Để pha mẫu thử, cân chính xác khoảng 100,0 mg cao n-butanol từ thân rễ SVD, sau đó hòa tan trong methanol với nồng độ 100,0 mg/mL Tiến hành siêu âm trong 10 phút, sau đó ly tâm để thu dịch chiết và lọc qua màng lọc 0,45 μm.

Để pha mẫu chất chuẩn stipuleanosid R2, trước tiên cần cân chính xác khoảng 1,0 mg chất này Sau đó, hòa tan trong methanol với nồng độ 400,0 µg/mL, siêu âm trong 10 phút và cuối cùng lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Tiến hành sắc ký HPLC hợp chất phân lập được và cao butanol so sánh với SKĐ thu được của mẫu chất chuẩn

Hình 3.5 cho thấy SKĐ HPLC của stipuleanosid R2, cao BuOH và chất chuẩn đối chiếu Kết quả phân tích HPLC cho thấy stipuleanosid R2 là hợp chất thiên nhiên có trong SVD, với thời gian lưu trong dung dịch cao butanol lần lượt là 15,565 và 15,564 phút, tương đương với thời gian lưu của chất chuẩn là 15,565 phút.

3.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 phân lập được

Yêu cầu: Hàm lượng không được thấp hơn 95,0% tính theo nguyên trạng

Để phân lập hợp chất stipuleanosid R2, tiến hành cân 6 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10 mg, vào bình định mức 20 mL Sau đó, hòa tan và pha loãng bằng methanol (MeOH) đủ lượng, siêu âm trong 10 phút, và cuối cùng lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Pha mẫu dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn stipuleanosid R2 vào bình định mức 20 mL, hòa tan và pha

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU loãng vừa đủ bằng MeOH, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 àm

Tiến hành chạy HPLC với điều kiện sắc ký như đã nêu ở mục 3.3.1 Thu được kết quả sắc ký trình bày ở bảng 3.6

B ả ng 3.6 K ế t qu ả định lượ ng nguyên li ệ u thi ế t l ậ p ch ấ t chu ẩ n

Mẫu thử Khối lượng (mg) Diện tích pic (mAU*s)

Hàm lượng (%) Pic chính Tổng pic

Các mẫu thử đều đạt hàm lượng trên 95,0% (tính theo nguyên trạng), đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn đối chiếu Tuy nhiên, để đưa ra kết luận chắc chắn, cần thực hiện thêm các phương pháp phân tích đặc hiệu và chính xác hơn.

BÀN LUẬN

Về chiết xuất, phân lập và tinh chế

Quy trình chiết xuất dược liệu SVD sử dụng phương pháp chiết siêu âm với dung môi ethanol 70 độ, cất quay thu cắn toàn phần, mang lại nhiều ưu điểm như tăng tốc độ chiết và giảm nhiệt độ, áp suất Qua phương pháp chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần như ether, ethyl acetat và n-butanol, thu được các cắn phân đoạn với khối lượng lần lượt là 1,26% (ether), 0,59% (EtOAc) và 4,71% (BuOH) so với nguyên liệu khô ban đầu Hợp chất stipuleanosid R2, là một saponin phân cực, đòi hỏi việc chiết lỏng - lỏng nhằm loại bỏ các thành phần không phân cực và kém phân cực, từ đó giúp quá trình phân lập diễn ra nhanh chóng và chính xác hơn.

4.1.2 Phân lập và tinh chế

Phân đoạn n-butanol với hàm lượng cao nhất đã được sử dụng để phân lập stipuleanosid R2 qua sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH theo gradient nồng độ Phân đoạn B4 cho thấy một vết màu hồng tím rõ nét trên bản mỏng, phù hợp với đặc tính của hợp chất cần phân lập Tiếp theo, sắc ký cột pha đảo đã được thực hiện để tinh chế stipuleanosid R2 từ dược liệu SVD, thu được 180 mg bột màu trắng Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM cho thấy vết tinh chế chuyển từ màu hồng sang màu tím, đặc trưng cho dẫn xuất triterpen Kết quả này cho thấy stipuleanosid R2 có độ tinh khiết cao, mở ra khả năng ứng dụng phương pháp này trong việc phân lập hợp chất trong SVD và các dược liệu khác chứa thành phần tương tự.

Stipuleanosid R2 có nhiều tác dụng dược lý quan trọng trên lâm sàng, đặc biệt trong việc điều trị một số bệnh và gây độc trên các dòng tế bào ung thư Mặc dù hiện tại, các tác dụng này chưa được áp dụng rộng rãi trong lâm sàng, nhưng nếu stipuleanosid R2 được nghiên cứu và ứng dụng trên người trong tương lai, việc lập pháp và tinh chế hợp chất này sẽ là cần thiết để phục vụ cho nghiên cứu tác dụng sinh học của nó.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU như vậy thì quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế mà chúng tôi đưa ra có thể ứng dụng được.

Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng

Việc xác minh cấu trúc của stipuleanosid R2 tinh chế từ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thông qua các phương pháp NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phân tích khối phổ (ESI-MS) đã xác nhận công thức phân tử và cấu trúc của hợp chất này phù hợp với lý thuyết Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của chất phân lập cũng khẳng định rằng sản phẩm tinh chế là đúng là stipuleanosid R2.

Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được bằng HPLC30 1 Xây dựng phương pháp

Chúng tôi đã phát triển phương pháp HPLC với detector DAD để định tính và định lượng stipuleanosid R2 tinh chế Phương pháp phân tích định lượng saponin bằng HPLC được công nhận bởi Dược điển các nước, cho thấy tính tiên tiến so với các phương pháp quang phổ và khối lượng hiện nay Phương pháp này có nhiều ưu điểm, từ việc pha mẫu, chuẩn bị dung môi đến thực hiện sắc ký đều rất đơn giản Trong khoảng nồng độ khảo sát, có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích, đồng thời đảm bảo độ đúng và độ đặc hiệu cao.

Dựa trên tài liệu tham khảo và các điều kiện hiện có, chúng tôi đã chọn chương trình sắc ký như mô tả ở mục 3.3.1 Với điều kiện sắc ký đã được xác định, chất nghiên cứu trong mẫu thử từ dịch chiết n-butanol của thân rễ SVD được tách ra một cách hiệu quả, với pic cân đối và thời gian lưu hợp lý, phù hợp cho việc định lượng các thành phần trong thân rễ SVD.

4.3.2 Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được 4.3.2.1 Định tính

Kết quả trên SKĐ chạy HPLC của 3 mẫu: stipuleanosid R2 phân lập được, cao BuOH và chất chuẩn đối chiếu đều cho pic ở thời gian lưu ở khoảng phút thứ

15 Theo các tài liệu nghiên cứu cho đến hiện nay, có thể khẳng định thời gian lưu đó là của hợp chất stipuleanosid R2

Bằng phương pháp HPLC với detector UV, chúng tôi đã xác định hàm lượng stipuleanosid R2 tinh chế đạt 96,22  0,11 (%), vượt qua tiêu chuẩn 95,0% (tính theo nguyên trạng) Kết quả này cho thấy chất chuẩn đối chiếu được thiết lập đạt yêu cầu.

Stipuleanosid R2 đã được tinh chế và phát triển thành chất đối chiếu cho phân tích và xây dựng tiêu chuẩn Mục tiêu là thiết lập chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu SVD, sau khi xác định độ tinh khiết qua SKLM và HPLC Tuy nhiên, do thời gian hạn chế, chúng tôi chỉ thực hiện chiết xuất, phân lập và tinh chế Việc thiết lập chất chuẩn stipuleanosid R2 còn cần đánh giá thêm một số chỉ tiêu khác theo tiêu chí của DĐVN và Dược điển quốc tế.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Với các kết quả thực nghiệm thu được đề tài đã đạt được các mục tiêu đề ra là:

1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 từ dược liệu sâm vũ diệp

2 Bước đầu xác minh cấu trúc hóa học, xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng của chất tinh chế được

3 Định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được

Việc xây dựng tiêu chuẩn cho hợp chất saponin chính từ thân rễ SVD – stipuleanosid R2 đã đóng góp quan trọng vào cơ sở dữ liệu về hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD Điều này cũng tạo nền tảng cho các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các đối tượng tiềm năng thuộc chi Panax Hơn nữa, các kết quả này có ý nghĩa thực tiễn trong công tác kiểm nghiệm thuốc và kiểm nghiệm dược liệu.

Hướng nghiên cứu tiếp theo, tôi xin phép được kiến nghị:

1 Nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn chất chuẩn stipuleanosid R2 để có tài liệu bổ sung về chất chuẩn đối chiếu trên vào Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ

2 Tiến hành nghiên cứu thiết lập các chất chuẩn đối chiếu khác có nguồn gốc dược liệu phục vụ nhu cầu kiểm tra chất lượng dược liệu cũng như các sản phẩm từ dược liệu

[1] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007) Thực vật học tập 1, NXB Y học, Hà Nội

Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, và Nguyễn Thượng Dong cùng các cộng sự đã xuất bản cuốn "Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam" tập 2 vào năm 2003, được phát hành bởi Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, trang 711 - 714.

[3] Bộ y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 2, Nhà xuất bản y học, tr PL-113,

Tiêu đề	Chiết Xuất, Phân Lập Stipuleanosid R2 Từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Làm Nguyên Liệu Xây Dựng Chất Chuẩn Cho Dược Liệu
Tác giả	Bùi Thị Thanh Vân
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Hữu Tùng
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	45
Dung lượng	1,71 MB