T Ổ NG QUAN
T Ổ NG QUAN V Ề SÂM VŨ DIỆ P
SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem [3,21], SVD thuộc chi Sâm (Panax L), họNgũ gia bì (Araliaceae) [2].
Sâm vũ diệp là một loại cây thân thảo lâu năm, thích hợp với môi trường ẩm ướt và bóng râm Cây có thân rễ dài, với nhiều đốt và dấu vết do thân cây rụng hàng năm để lại.
Thân khí sinh của cây cao từ 20 đến 30 cm, thường mọc đơn độc và thẳng, có rỗng ở giữa và có vạch dọc Cây thường lụi vào mùa đông và bắt đầu mọc chồi mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 Lá của cây có hình chân vịt, gồm 2 đến 3 lá mọc vòng, với lá chét từ 5 đến 7 (hiếm khi 3) có hình thuôn, dài từ 2,5 đến 14 cm và rộng từ 1,5 đến 4 cm Gốc lá tròn, đầu lá thuôn nhọn, có xẻ thùy không đều, mép lá có răng cưa và có lông.
Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21]
1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái
Sâm vũ diệp là loài sâm quý hiếm, mọc tự nhiên và được phát hiện sớm ở Việt Nam, chủ yếu phân bố tại dãy núi Hoàng Liên Sơn, bao gồm huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Gần đây, loài này đã được nghiên cứu và thử nghiệm trồng tại một số địa phương như Hà Giang và Lào Cai Tuy nhiên, vùng phân bố của Sâm vũ diệp đang bị thu hẹp và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng, do đó cần được bảo tồn và phát triển để đảm bảo sự tồn tại trong tương lai.
Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm, gần như
Thân rễ phân nhánh ngang của cây sâm vũ diệp mọc sát mặt đất và phát triển thành một hoặc vài chồi thân, tùy thuộc vào số đầu mầm Chồi này sinh trưởng nhanh chóng, chỉ trong một tháng đã ra lá và gần đạt chiều cao tối đa Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có khả năng cho ra một cụm hoa Quả xanh xuất hiện từ cuối tháng 4 đến tháng 6, và đến tháng 7, quả chín và rụng xung quanh gốc cây mẹ Tuy nhiên, do quả chín vào thời điểm có lượng mưa lớn từ tháng 7 đến tháng 8, hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của cây Tuổi của cây có thể được xác định qua các vết sẹo trên thân do quả chín để lại.
Saponin được xác định là hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Panax L., với gần 300 loại saponin đã được chiết tách và xác định Nghiên cứu trước đây cho thấy saponin là thành phần chủ yếu trong lá và rễ cây sâm vũ diệp, bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng cao và một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn.
Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập thành công 13 saponin khung dammaran từ lá cây, trong đó có nhiều ginsenosid đặc trưng như F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3.
Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự vào năm 2002 đã chỉ ra rằng thân rễ và rễ củ SVD chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin, cùng với acid béo và acid amin Đến năm 2003, nghiên cứu xác định rằng thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan, bao gồm các chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1 và ginsenosid Ro, bên cạnh các saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2.
Vào năm 2011, một nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định 10 saponin khung oleanan (1-10) là thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam Trong số đó, có 3 chất mới được phát hiện là bifinosid A-C (1-3).
Hình 1.2 Các hợp chất tách được từ rễcây sâm vũ diệp [33]
Tính vị, công năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [3]
Nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy loại thảo dược này có độc tính cấp rất thấp khi thử nghiệm trên động vật, đồng thời tăng cường chức năng sinh lý và có ảnh hưởng tích cực đến hệ thần kinh trung ương SVD còn giúp nâng cao sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề kháng và có tác dụng tán huyết Đặc biệt, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng SVD có khả năng chống stress, chống trầm cảm, bảo vệ gan và kích thích tăng cường miễn dịch.
Sâm vũ diệp là một vị thuốc quý với nhiều công dụng như chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng và tăng cường trí nhớ Nó hiệu quả trong việc chữa trị thiếu máu, xanh xao và gầy yếu, đặc biệt là cho phụ nữ sau sinh Ngoài ra, sâm vũ diệp còn giúp cầm máu, tán ứ và tiêu sưng Rễ phơi khô, tán bột mịn có thể rắc lên vết thương để giúp lành nhanh chóng Rễ cũng có thể được ngâm rượu để chiết xuất tinh chất, rất tốt cho sức khỏe và chức năng sinh dục Người dân vùng trồng thường sử dụng cả thân và lá để nấu cao, pha với nước hoặc rượu.
Rễ và lá của sâm vũ diệp đều có tác dụng chữa bệnh Tại Trung Quốc, sâm vũ diệp được sử dụng để điều trị các bệnh như lao phổi, chảy máu cam, thổ huyết và chấn thương do ngã.
T Ổ NG QUAN V Ề STIPULEANOSID R2
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 [41]
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:
(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [40]
Chất bột màu trắng Độ tan: 0,57 g/L [42] Điểm nóng chảy 210 - 215 0 C [41]
Stipuleanosid R2 là một thành phần saponin quan trọng trong các loại dược liệu như sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis và Aralia elata Nghiên cứu đã chỉ ra rằng stipuleanosid R2 có khả năng gây độc tế bào ung thư, đặc biệt là ức chế sự phát triển của các tế bào bạch cầu như K562 và U937 Ngoài ra, nó còn có tác dụng chống oxy hóa, hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và giảm lipid máu.
1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC
Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào công bố về định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu bằng phương pháp HPLC trên thế giới; hầu hết chỉ dừng lại ở việc phân lập chất này Vì vậy, việc phát triển một phương pháp định lượng stipuleanosid R2 là rất cần thiết để ứng dụng dược liệu trong thực tiễn.
T Ổ NG QUAN V Ề S Ắ C KÝ L Ỏ NG HI ỆU NĂNG CAO (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp phân tích dựa trên sự phân tách trên pha tĩnh trong cột, kết hợp với dòng pha động lỏng dưới áp suất cao Pha động là chất lỏng, trong khi pha tĩnh có thể là chất rắn dạng tiểu phân, chất lỏng phủ trên chất mang rắn, hoặc chất mang đã được liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.
Quá trình sắc ký lỏng hoạt động dựa trên các cơ chế như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân bố theo kích cỡ, tùy thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng.
Tốc độ di chuyển của các chất trong quá trình phân tách phụ thuộc vào hệ số phân bố giữa hai pha, liên quan đến ái lực tương đối của chúng với pha tĩnh và pha động Sự khác biệt này dẫn đến thứ tự rửa giải khác nhau, từ đó hỗ trợ hiệu quả trong việc phân tách các chất.
Sau khi các chất rời khỏi cột, chúng sẽ được phát hiện và đo nồng độ bởi detector Hiện nay, có nhiều loại detector như UV-Vis, huỳnh quang (FLD), diode array (DAD) và điện hoá Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng detector DAD để phân tích.
Quá trình tách sắc ký hỗn hợp nhiều thành phần sẽ tạo ra một sắc đồ với nhiều pic riêng biệt Sắc ký hiệu quả sẽ cho phép tách rời từng thành phần trong hỗn hợp, từ đó thu được số lượng pic tương ứng trên sắc ký đồ.
1.3.2 Một số thông sốđặc trưng [2,3,5,9,10,15]
Sắc ký đồ của hai chất thể hiện các thông số đặc trưng quan trọng trong quá trình phân tích Thời gian lưu t0, hay còn gọi là thời gian chết, là khoảng thời gian cần thiết để pha động di chuyển qua hệ thống sắc ký Trong khi đó, thời gian lưu tR được tính từ lúc chất phân tích được tiêm vào hệ thống cho đến khi đạt nồng độ cực đại Thời gian lưu thực tR’ được xác định bằng công thức tR’ = tR – t0, cho phép hiểu rõ hơn về hiệu suất của quá trình sắc ký.
Thời gian lưu là thông tin định tính quan trọng trong sắc ký, phản ánh thời gian mà một chất cụ thể lưu lại trong hệ thống sắc ký dưới các điều kiện nhất định Hệ số dung lượng k’ cũng là một yếu tố quan trọng, cho biết khả năng tương tác của chất với pha tĩnh trong quá trình phân tách.
Trong thực nghiệm hệ sốdung lượng k’ được tính theo công thức:
Hệ số dung lượng phản ánh khả năng phân bố của chất vào hai pha, thể hiện tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động khi đạt trạng thái cân bằng Nếu hệ số k’ nhỏ, thời gian t cũng sẽ nhỏ, cho thấy chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm.
Mẫu V NU làm giảm khả năng tách, và nếu k’ quá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng doãng pic, giảm độ nhạy và kéo dài thời gian lưu Trong thực tế, k’ lý tưởng nằm trong khoảng từ 2 đến 5 Hệ số bất đối AF (tailing factor) cũng là yếu tố cần được chú ý.
Hệ số bất đối AF cho biết mức độcân đối của pic trên sắc ký đồ:
- W1/20: là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic
- a: là khoảng cách từđường vuông góc hạ từđỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic
Yêu cầu trong phép định lượng: 0,9 < AF < 2
Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối d) Hệ số chọn lọc
Yêu cầu về α là nằm trong khoảng từ 1,05 đến 2; nếu α khác 1 càng nhiều, khả năng tách biệt giữa hai chất càng rõ ràng Độ phân giải (resolution) thể hiện mức độ tách biệt giữa hai chất trong điều kiện sắc ký Độ phân giải của hai pic kề nhau được tính bằng một công thức cụ thể.
- RS = 1,5: độ phân giải cơ bản đạt được, khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3%
- Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%
- RS= 0,75: Hai pic chưa tách nhau
1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC a) Yêu cầu chung
Các quy trình phân tích HPLC cần được thẩm định nếu chúng chưa được công nhận trong tiêu chuẩn Dược điển của các quốc gia Quy trình thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các tài liệu phân tích và được quy định cụ thể trong các Dược điển.
Khi thẩm định phương pháp định lượng dược chất chính và đa lượng bằng kỹ thuật HPLC, cần đánh giá các thông số đặc trưng như tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng.
1.3.4 Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ diệp bằng HPLC
Năm 2009, nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã xác định hàm lượng saponin tổng số trong thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp bằng phương pháp trọng lượng Namba, đạt tỷ lệ 5,86%.
Năm 2017, Nhóm nghiên cứu của Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội:
Nguyễn Thị Huệ đã thực hiện khảo sát và tối ưu hóa điều kiện sắc ký để phát triển phương pháp định lượng acid oleanolic và saponin toàn phần trong dược liệu sâm vũ diệp bằng HPLC - DAD Kết quả cho thấy hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp và rễ sâm vũ diệp lần lượt là 0,034% (340 μg/g) và 0,0066% (66 μg/g) Bên cạnh đó, hàm lượng saponin trong cao sâm vũ diệp và dược liệu SVD lần lượt đạt 0,364% (3640 μg/g) và 0,0698% (69,8 μg/g).
Nghiên cứu này cung cấp những kết quả bước đầu về định lượng thành phần hóa học của Sâm Vũ Diệp (SVD) và xác định hàm lượng saponin tổng số Hiện tại, chưa có nhiều công bố phân tích và định lượng các thành phần saponin cụ thể trong SVD Chúng tôi đã sử dụng phương pháp HPLC để phân tích định lượng saponin, phương pháp được Dược điển các nước công nhận vì tính tiên tiến hơn so với các phương pháp quang phổ hay khối lượng hiện nay HPLC với độ chính xác cao sẽ đáp ứng tốt yêu cầu phân tích từng thành phần riêng lẻ trong mẫu, đặc biệt là với các mẫu phức tạp như cao chiết từ dược liệu.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
ĐỐI TƯỢ NG NGHIÊN C Ứ U
2.1.1 Nguyên liệu sâm vũ diệp
Mẫu nghiên cứu trong đề tài là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 Mẫu này đã được giám định tên khoa học bởi ThS Nguyễn Quỳnh Nga và CN Phan Văn Trường, thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản (PB-150716) hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu.
Mẫu nghiên cứu thân rễ sâm vũ diệp có đặc điểm nhiều đốt và vết sẹo, với hình dạng cong ngoằn ngoèo, dài từ 7-12 cm và đường kính 1,2-1,8 cm Chất liệu của thân rễ cứng chắc, giòn và dễ bẻ, bề mặt bẻ có hình dạng lởm chởm với màu vàng nâu nhạt Sâm vũ diệp tỏa ra mùi thơm nhẹ, vị đắng kèm theo chút ngọt.
Thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa được rửa sạch, cắt thành miếng mỏng và sấy khô ở nhiệt độ 50°C Sau đó, sản phẩm được bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo và thoáng mát, nhằm làm nguyên liệu cho nghiên cứu.
Hình 2.1 Mẫusâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào
Cai vào ngày 15/7/2016 2.1.2 Chất tinh khiết stipuleanosid R2
Chúng tôi đã sử dụng chất stipuleanosid R2, được phân lập từ dược liệu sâm vũ diệp, trong nghiên cứu này, dựa trên kết quả của một nghiên cứu trước đó do cùng nhóm nghiên cứu thực hiện.
Stipuleanosid R2 sẽ được đánh giá độ tinh khiết để đảm bảo đạt tiêu chuẩn sử dụng làm chất chuẩn trong phương pháp định lượng nồng độ của chất này trong SVD bằng HPLC.
Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được 2.1.3 Dung môi, hóa chất
Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC
- Dung môi dùng cho chiết xuất và phân lập: Ethanol 70%, methanol (MeOH), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH)
- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, Acetonitril, Acid acetic) của Merck, Đức; nước cất hai lần dùng cho phân tích HPLC đạt tiêu chuẩn Dược điển
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị và dụng cụ đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà Nội.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tựđộng
- Tủ sấy Memmert (Memmert –Đức)
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001 g, Precisa - Thụy Sĩ)
- Cân xác định độẩm Prescisa HA 60
- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml
- Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc)
- Bếp điện, bếp đun cách thủy
- Cột sắc ký các loại kích cỡ
- Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 ml, ống nghiệm, pipet chính xác
N Ộ I DUNG NGHIÊN C Ứ U
1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD bằng HPLC với chất chuẩn là stipuleanosid R2 tinh khiết được phân lập từ SVD
2 Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD thu hái ở Sa Pa, Lào Cai bằng phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định ở trên.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp cho thấy saponin là thành phần chính Để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất cho mẫu thân rễ sâm vũ diệp, cần tham khảo tài liệu liên quan đến chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu.
- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%
- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng
Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau:
1 Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 70 0 C, chiết 3 lần
2 Tiến hành lọc loại bã dược liệu, các dịch chiết ethanol thu được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng ethanol
3 Cao ethanol này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetate và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ1:1 Các phân đoạn ether, ethyl acetat, n-butanol đem cất quay chân không dưới áp
V NU suất giảm để thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn
4 Cao butanol thu được trong quá trình chiết xuất sẽ được sử dụng để định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 có trong sâm vũ diệp
2.3.2 Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC a) Lựa chọn điều kiện sắc ký
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các yếu tố như bước sóng, tỷ lệ dung môi, thành phần pha động, tốc độ dòng và thể tích bơm mẫu để lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu nhất cho phân tích stipuleanosid R2 có trong thân rễ SVD Mục tiêu là đảm bảo đạt được kết quả chính xác nhất Đồng thời, chúng tôi cũng thẩm định stipuleanosid R2 được phân lập từ SVD đủ tiêu chuẩn làm chất chuẩn trong quy trình định lượng.
* Yêu cầu của chất sử dụng làm chất chuẩn [35]:
Nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn cần có độ tinh khiết cao, đặc biệt đối với hợp chất hóa dược phải đạt trên 95% Những nguyên liệu này được lựa chọn từ các lô sản xuất thuốc chất lượng cao, đảm bảo tính đồng nhất và được cung cấp từ các nguồn đáng tin cậy, cụ thể là các nhà sản xuất gốc.
Việc đánh giá tính phù hợp của nguyên liệu dự kiến để thiết lập tiêu chuẩn cần được thực hiện một cách cẩn thận, bao gồm việc xem xét tất cả dữ liệu từ các phép thử Đồng thời, nên áp dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau để thực hiện đánh giá và so sánh hiệu quả.
* Phương pháp thẩm định: Độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được được kiểm tra dựa vào ba phương pháp sau:
1 Sắc ký lớp mỏng: Sti phân lập được sẽ tiến hành sắc ký trên silicagel RP-
Để phát hiện chất 18 F254S (Merk), sử dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong Ethanol 96% Phun đều dung dịch lên bản mỏng, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 120°C và hơ nóng trên bếp điện từ cho đến khi màu xuất hiện Cuối cùng, quan sát vết xuất hiện dưới ánh sáng thường.
Yêu cầu: Sau khi phun thuốc thử trên sắc ký đồ phải xuất hiện một pic duy nhất màu hồng tím của stipuleanosid R2
Phương pháp đánh giá độ tinh khiết thông qua tổng tạp dựa theo phương ẩ ệ ến hành định lượ ằ
Tiến hành định lượng 01 dung dịch stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần bằng HPLC Dựa vào kết quả sắc ký đồtính lượng tạp bằng phương pháp phần trăm diện tích pic
Yêu cầu: độ tinh khiết > 95%
3 Đo độ nóng chảy: Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của stipuleanosid R2 phân lập được từ SVD
Yêu cầu: stipuleanosid R2 phân lập được phải có nhiệt độ nóng chảy nằm trong khoảng 210 - 215 0 C [41] c) Thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong SVD [4,5,40]
Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá chính xác chất cần phân tích trong sự hiện diện của các tạp chất hoặc chất cản trở khác Phương pháp HPLC được xem là có tính đặc hiệu cao khi có thể phân biệt rõ ràng chất cần phân tích.
Sắc ký đồ của các mẫu thử với thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê so với sắc ký đồ của chất chuẩn Điều này cho thấy rằng các mẫu thử không thể so sánh một cách chính xác với các tiêu chuẩn đã được thiết lập.
- Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
* Kiểm tra tính thích hợp hệ thống
Tính thích hợp của hệ thống phân tích được đánh giá qua độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách thực hiện nhiều lần đo trên cùng một mẫu đã xử lý Để kiểm tra độ lặp lại, tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn và ghi lại các giá trị về thời gian lưu và diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích.
Độ tuyến tính của đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hoặc chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử Khoảng tuyến tính là dải nồng độ từ thấp đến cao nhất trong đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính, được mô tả bằng phương trình hồi quy y = ax + b với hệ số tương quan tuyến tính R² Trong đó, y đại diện cho đáp ứng của pic và x là nồng độ chất cần phân tích.
V NU Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng độ
- Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng xác định của phương pháp.
- Các mẫu chuẩn có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn ban đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau
* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được về mặt định tính
LOQ, hay giới hạn phát hiện định lượng, là lượng tối thiểu của chất cần phân tích có trong mẫu thử để có thể xác định chính xác và đáng tin cậy.
Để xác định LOD và LOQ, cần dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu nền (S/N) Quá trình này bao gồm việc pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện bằng sắc ký Tiến hành đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng và mẫu thử để thiết lập tỷ số S/N.
LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà tại đó có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3/1)
LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N /1)
Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử nghiệm trên cùng một mẫu, được xác định thông qua việc thực hiện nhiều lần phân tích từ công đoạn đầu tiên đến công đoạn cuối cùng Điều này đảm bảo rằng các kết quả thu được là nhất quán và tin cậy, phản ánh chính xác tính chất của mẫu được phân tích.
Tiến hành pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu, sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký và thực hiện tiêm lặp lại nhiều lần để lấy giá trị trung bình Độ lặp lại được thể hiện qua giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích.
* Độđúng Độđúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực
PHƯƠNG PH ÁP X Ử LÝ S Ố LI Ệ U
Các số liệu nghiên cứu đã được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 để tính toán và phân tích kết quả.
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100 xRSD S
K Ế T LU Ậ N VÀ BÀN LU Ậ N
KI ỂM TRA ĐỘ TINH KHI Ế T C Ủ A STIPULEANOSID R2 PHÂN L Ậ P ĐƯỢ C
3.1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Stipuleanosid R2 đã được phân lập và kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM trên bản mỏng silicagel RP-18 F254S, sử dụng hệ dung môi Methanol:H2O với tỷ lệ 2:1 Kết quả sắc ký đồ được trình bày trong hình 3.1.
Hình 3.1 Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun H 2 SO 4
Sau khi thực hiện phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, SKĐ của stipuleanosid R2 chỉ xuất hiện một vết màu hồng đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng của các dẫn xuất triterpen Điều này cho thấy stipuleanosid R2 phân lập được là chất tinh khiết.
3.1.2 Phương pháp HPLC a) Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên việc phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát các yếu tố như thành phần pha động, tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng, chúng tôi đã phát triển một chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity.
- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)
- Detector DAD phát hiện ởbước sóng: 203 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Dung môi pha mẫu: Methanol
- Pha động: Acetonitril (kênh A): Acid acetic 0,5%/H2O (kênh B) với chương trình dung môinhư bảng 1
Bảng 1 Chương trình dung môi
Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid acetic 0,5% (%) Kiểu rửa giải
Dưới các điều kiện sắc ký đã thiết lập, các thành phần saponin trong mẫu thử từ dịch chiết n-butanol SVD được tách ra một cách hiệu quả với pic cân đối Do đó, các điều kiện sắc ký này có thể được áp dụng để phân tích định lượng stipuleanosid R2 có trong sâm vũ diệp Bên cạnh đó, độ tinh khiết của stipuleanosid R2 được phân lập từ SVD sẽ được xác định thông qua phương pháp HPLC.
Để pha mẫu stipuleanosid R2, trước tiên cần cân chính xác khoảng 1,0 mg Sti để phân lập Sau đó, hòa tan trong methanol để tạo dung dịch gốc với nồng độ 1,0 mg/mL (1000 ppm) Tiếp theo, siêu âm dung dịch trong 10 phút và lọc qua màng lọc 0,45 µm Cuối cùng, pha loãng dung dịch để đạt nồng độ 500 ppm.
Tiến hành phân tích dung dịch stipuleanosid R2 lặp lại 6 lần nhằm kiểm tra tính thích hợp của hệ thống HPLC đã chọn, đồng thời xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 đã được phân lập.
Kết quả thẩm định độ tinh khiết được thực hiện thông qua tổng tạp theo phương pháp chuẩn hóa diện tích Để tính toán, sử dụng phương pháp phần trăm diện tích pic, loại trừ pic của pha động và pic có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) nhỏ hơn 2/1 Kết quả cuối cùng xác định độ tinh khiết của mẫu.
V NU phương pháp HPLC được ghi nhận ở bảng 2 và hình 3.2
Bảng 2 Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết
TT % Diện tích pic chính
% Tổng diện tích pic tạp
Hình 3.2 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 bằng HPLC
* Nhận xét: Kết quảSKĐ của chất stipuleanosid R2 phân lập được cho thấy xuất hiện 2 pic:
- Tại thời gian lưu t R = 15,539: xuất hiện 1 pic chính là pic của stipuleanosid R2 chiếm 96,183% tổng diện tích pic trên SKĐ
Tại thời gian lưu t R = 16,173, có một pic phụ chiếm 3,817% tổng diện tích pic trên SKĐ Độ lệch chuẩn tương đối về diện tích của pic stipuleanosid R2 giữa các lần tiêm cùng nồng độ là 0.32% ( 95%)
3.1.3 Phương pháp đo độ nóng chảy
Kết quảđo độ nóng chảy của stipuleanosid R2 phân lập được là 214 0 C
Nhiệt độ nóng chảy đo được của stipuleanosid R2 tinh khiết trùng khớp với nhiệt độ nóng chảy của mẫu phân lập, điều này xác nhận rằng stipuleanosid R2 được phân lập là chất tinh khiết.
Kết luận: Qua việc xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 bằng sắc ký lớp mỏng, HPLC và đo độ nóng chảy, chúng tôi đã xác định rằng stipuleanosid R2 phân lập có độ tinh khiết đạt yêu cầu Chất này sẽ được sử dụng làm chất chuẩn trong quy trình định lượng nồng độ của nó trong các mẫu SVD.
XÂY D ỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢ NG STIPULEANOSID R2
BẰNG HPLC 3.2.1 Chương trình sắc ký
Thực hiện chương trình sắc ký đã lựa chọn ở mục 3.1.2
3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng a) Chuẩn bị mẫu
Dung dịch mẫu trắng: Dung dịch MeOH
Để chuẩn bị dung dịch mẫu thử, cân chính xác khoảng 0,1 g cao BuOH từ sâm vũ diệp và hòa tan trong MeOH Sau đó, cho dung dịch vào bình định mức 10 ml và thực hiện siêu âm ở nhiệt độ phòng.
Lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 μm thu được dung dịch thử dùng để triển khai sắc ký
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cân chính xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 bằng cân phân tích, sau đó hòa tan trong methanol (MeOH) và pha loãng với dung môi cho đến khi đạt nồng độ 1000 μg/ml Tiến hành siêu âm ở nhiệt độ phòng và lọc dung dịch qua.
Với việc sử dụng methanol (MeOH) và các hệ số pha loãng khác nhau, chúng tôi đã tạo ra các dung dịch chuẩn có nồng độ phù hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn Điều này giúp đảm bảo tính đặc hiệu trong quá trình phân tích.
* Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu
- Mẫu trắng: Dung dịch MeOH
- Mẫu chuẩn: Stipuleanosid R2 phân lập được từ sâm vũ diệp pha trong MeOH
- Mẫu thử: Cao BuOH của thân rễ SVD hòa tan trong MeOH
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn Ghi lại sắc ký đồ và xác định thời gian lưu của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn.
Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng
Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn
Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch thử
Kết quả cho thấy: Tín hiệu pic của Sti xuất hiện tại thời gian lưu tR= 15,565
Sắc ký đồ của dung dịch thử cho thấy một pic với thời gian lưu tương ứng với stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn, tách biệt với các tín hiệu pic khác Ngược lại, sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic nào trong khoảng thời gian lưu của stipuleanosid R2 Điều này chứng tỏ phương pháp phân tích có độ đặc hiệu cao, phù hợp cho việc xác định stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD.
Để thực hiện phân tích dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 với nồng độ 150 àg/ml, cần lặp lại quá trình này 06 lần theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn (mục 3.1.2) Sau khi hoàn tất, tiến hành sắc ký và ghi lại các sắc ký đồ để xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic và hệ số đối xứng.
Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,16%; 3,01% và 1,33%, đều thấp hơn 5%, chứng tỏ các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn là ổn định Hệ thống sắc ký HPLC sử dụng phù hợp cho việc phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp.
Bảng 3 Tính thích hợp hệ thống
(phút) Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối
Để tiến hành, cần chuẩn bị các dãy dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc 1000 μg/ml với MeOH Các dung dịch chuẩn thu được sẽ có nồng độ lần lượt là 15,625 μg/ml, 37,5 μg/ml, 75 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml và 400 μg/ml.
Lọc qua màng lọc có kích cỡ 0,45 μm được dung dịch dùng để triển khai sắc ký
Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn bằng cách tiêm mỗi dung dịch ba lần, sau đó ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic Tiến hành xác định phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ thông qua phương pháp bình phương tối thiểu.
Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối tương quan tuyến tính mạnh mẽ giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch, được mô tả qua phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R² = 0,9988 Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 15,625 đến 400 µg/ml, sự tương quan này cho thấy tính chính xác cao, khẳng định mối liên hệ chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid R2.
Bảng 4 Kết quả khảo sát khoảngtuyến tính của stipuleanosid R2
TT Nồng độ (àg/ml) Diện tớch pic (mAU*s)
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 e) Giới hạn phát hiệu (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Để xác định giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp, dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 được pha loãng và phân tích bằng HPLC cho đến khi tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) đạt khoảng 2-3 Trong đó, S là chiều cao pic của stipuleanosid R2 và N là chiều cao tín hiệu nhiễu lớn nhất Kết quả cho thấy ở nồng độ 1,953 µg/mL, tỉ số S/N là 3,03, và khi pha loãng ở nồng độ thấp hơn, không còn đáp ứng, xác nhận đây là giới hạn LOD của hệ thống Phương trình hồi quy là y = 2.6081x + 49.1185 với R² = 0.9988.
Nồng độ (àg/ml) Đồ thị đường chuẩn của stipuleanosid R2
Giới hạn định lượng (LOQ): Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện theo công thức LOQ = 3,3 x LOD
Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện (LOD) là 1,953 àg/ml và giới hạn định lượng (LOQ) là 6,445 àg/ml, tương ứng với 3,3 lần LOD Điều này chứng tỏ phương pháp có độ nhạy cao và giới hạn phát hiện, định lượng thấp hơn nhiều so với nồng độ định lượng, từ đó phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD.
- Tiến hành định lượng 6 mẫu thửđộc lập, mỗi mẫu tiêm 3 lần
Để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử, cần sử dụng đường chuẩn trong phần xác định khoảng tuyến tính Độ lặp lại được đánh giá bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng, với kết quả khảo sát được thể hiện qua RSD Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 5.
Bảng 5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Nồng độ cao (mg/ml)
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng trung bình của Sti trong cao SVD đạt 2,477% với độ lệch chuẩn tương đối RSD là 2,02% (dưới 5%) Điều này chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt, có khả năng ứng dụng hiệu quả trong việc phân tích stipuleanosid R2 trong SVD.
- Dung dịch thử: Hòa tan 6 mẫu cao SVD trong MeOH Xác định được lượng stipuleanosid R2 có sẵn trong mỗi mẫu thử
Dung dịch thử thờm chuẩn được sử dụng bằng cách thêm vào mỗi mẫu cao dược liệu 50 µg Sti chuẩn Sau đó, tiến hành chạy sắc ký cho 6 mẫu thử thêm chuẩn Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng, lượng Sti trong các mẫu sẽ được tính toán, từ đó xác định độ thu hồi của phương pháp Kết quả được trình bày rõ ràng trong bảng 6.
Bảng 6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Lượng tìm lại (àg) Độ thu hồi (%)
ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢ C LI ỆU SÂM VŨ
Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp HPLC được xây dựng hoàn toàn phù hợp để định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp.
Để tiến hành phân tích stipuleanosid R2, cần chuẩn bị 6 mẫu cao sâm vũ diệp bằng cách cân và hòa tan chúng trong MeOH Sau đó, sử dụng siêu âm và lọc qua màng lọc có kích thước 0,45 μm trước khi tiến hành tiêm vào hệ thống HPLC.
- Tiến hành sắc ký Xác định thời gian lưu, diện tích pic tương ứng với thời gian lưu của Sti trên sắc ký đồthu được
Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính và phương pháp nội suy để xác định hàm lượng Sti trong mẫu cao BuOH của SVD và dược liệu liên quan Kết quả định lượng được trình bày trong bảng 7.
Bảng 7 Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp
Diện tích pic stipuleanosid R2 (mAU.s)
Hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao (%)
Hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu khô (%)
* Kết quả trình bày ở bảng 7 cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao BuOH của sâm vũ diệp là 2,477% và trong dược liệu sâm vũ diệp là 0,117%.
BÀN LU Ậ N
Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm và trang thiết bị hiện có tại Khoa Y Dược, chúng tôi đã tham khảo tài liệu công bố và xây dựng phương pháp phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp bằng kỹ thuật HPLC.
- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)
- Detector DAD phát hiện ởbước sóng: 203 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Thểthớch bơm mẫu: 20 àl ệt độ
- Dung môi pha mẫu: Methanol
- Pha động: Acetonitril (A) - Acid acetic 0,5%/H2O (B) theo chương trình dung môi trong 45 phút: (0-5 phút: 20% A; 5-15 phút: 20→40% A; 15-20 phút:
* Đường chuẩn: y = 2,6081x + 49,1185; R 2 = 0,9988; khoảng nồng độ 15,625 – 400 àg/ml
* Độ đúng: Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 96,25% đến 104,64%, RSD 3,18 %; n=6
* Giới hạn phỏt hiện: 1,953 àg/ml
* Giới hạn định lượng: 6,445 àg/ml
Kết quả phân tích stipuleanosid R2 bằng HPLC cho thấy độ tin cậy cao, xác nhận đây là phương pháp định lượng đầu tiên được xây dựng cho stipuleanosid R2 trong SVD Kết quả thẩm định đáp ứng yêu cầu của một phương pháp phân tích, cho phép ứng dụng phương pháp này để phân tích stipuleanosid R2 trong sâm vũ diệp và các loài dược liệu khác.
3.4.2 Về định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu và cao sâm vũ diệp
Các hợp chất saponin khung oleanan là thành phần chính và đặc trưng của sâm vũ diệp, hiện đang được trồng thử nghiệm tại Sa Pa và Hà Giang Nghiên cứu hóa học và tác dụng dược lý của sâm vũ diệp đang được tiến hành, tuy nhiên, thành phần stipuleanosid R2 trong dược liệu này chưa được phân tích cụ thể Nghiên cứu của chúng tôi khảo sát hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa bằng phương pháp phân tích HPLC Kết quả cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao BuOH của sâm vũ diệp là 2,477% (24,77 mg/g) và trong thân rễ là 0,117% (1,17 mg/g) Đây là lần đầu tiên hàm lượng stipuleanosid R2 được định lượng trong dược liệu sâm vũ diệp, góp phần cung cấp cơ sở dữ liệu đầy đủ hơn về tác dụng dược lý của loại dược liệu này.
Sâm vũ diệp, một loại dược liệu quý được trồng tại Việt Nam, đang thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu với mục tiêu khám phá tác dụng dược lý của các thành phần trong loại sâm này Hướng nghiên cứu hiện tại không chỉ tập trung vào việc tìm hiểu các lợi ích sức khỏe mà còn định hướng ứng dụng thực tiễn của sâm vũ diệp trong y học tương lai.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN Đề tài đã thực hiện được các mục tiêu nghiên cứu đã đềra như sau:
1 Xây dựng được phương pháp định lượng stipuleanpsid R2 và thẩm định được phương pháp HPLC về các mặt: tính thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độđặc hiệu, độ chính xác Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp phân tích
2 Định lượng được thành phần stipuleanosid R2 trong sâm vũ diệp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - DAD Kết quả thu được cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong mẫu cao BuOH của thân rễ sâm vũ diệp là 2,477% tương đương với 24,77 mg/g và trong dược liệu SVD là 0,117% tương đương với 1,17 mg/g
Với những kết quả đầy tiềm năng và hứa hẹn mà đề tài đã thực hiện được, tôi xin phép được kiến nghị đề tài cần tiếp tục:
1 Thiết lập thêm điều kiện cho chất chuẩn stipuleanosid R2 sử dụng trong đề tài để có thể cho kết quả xác định hàm lượng chất này trong dược liệu SVD được chính xác và ổn định hơn.
2 Áp dụng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC trong dược liệu SVD và các loài Panax khác có chứa chất này
[1] Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, Hà Nội
[2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007) Thực vật học tập 1, NXBY học, Hà Nội
[3] ĐỗHuy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập
2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr 711 - 714
[4] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích -
Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009 TT-BYT Quy định vềđăng ký thuốc
[5] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một sốphương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-113, 216-250
[6] Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr 79-82, 84-110
[7] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn Thị Thu Hương
(2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội, tr 263-266
[8] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr 8-99, 162-196, 234-242
Đỗ Thị Hà và Lê Thị Loan (2016) đã nghiên cứu và xây dựng phương pháp định lượng tanshinon IIA trong dược liệu đan sâm trồng tại Việt Nam bằng kỹ thuật HPLC – DAD Nghiên cứu được công bố trên Tạp chí dược liệu, số 21(1+2), trang 50-54, góp phần nâng cao hiểu biết về thành phần hóa học của đan sâm và ứng dụng của nó trong y học.
[10] Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc Gia Hà Nội
[11] Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic và saponin tổng số trong rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc
[12] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh (2005),
"Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr 196-200
[13] Nguyễn Thị Thu Hương và Bùi Thị Kim Cúc (2006), Nghiên cứu phát triển dược liệu và Đông dược ở Việt Nam, Tác dụng bảo vệ gan của sâm Việt Nam
V NU trong tổn thương gan thực nghiệm bằng ethanol, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 288-295
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và Trần Mỹ Tiên (2001) về tác dụng chống stress và trầm cảm của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv Araliaceae) cho thấy hoạt chất chính majonosid-R2 có hiệu quả đáng kể Công trình này được đăng tải trên Tạp chí Dược liệu, góp phần mở rộng hiểu biết về lợi ích sức khỏe của sâm Việt Nam.
[15] Nguyễn Thị Thu Hương và và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam, NXB
Khoa học và Kỹ thuật, tr 464-466
[16] Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y
Nghiên cứu của Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên và Nguyễn Tập (2009) đã chỉ ra thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et al.) Những phát hiện này góp phần làm rõ giá trị dược liệu của các loại sâm trong y học cổ truyền và hiện đại.
Feng)”, Tạp chí dược liệu, 14(1), tr 17-23
Trần Công Luận (2002) đã thực hiện nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của hai loài sâm, gồm sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Nghiên cứu này đóng góp quan trọng vào việc hiểu rõ hơn về giá trị dược liệu của các loài sâm này.
[19] Nguyễn Thị Bích Ngọc (2014), Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp- Trường ĐH Dược Hà Nội
[20] Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương - Bộ y tế
[21] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr 71-76
Nghiên cứu của Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền và Lê Thanh Sơn (2006) đã chỉ ra kết quả về phân bố và sinh thái của sâm vũ diệp và tam thất hoang tại Việt Nam, được công bố trong Tạp chí Dược liệu, tập 11, số 5, trang 177-180.
[23] Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1, NXB Y học – Bộ Y tế, tr 191-213
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Thủy và các cộng sự (2018) tập trung vào thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) được thu hái tại Sa Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về giá trị dược liệu của sâm vũ diệp, góp phần làm rõ các hoạt chất có lợi cho sức khỏe từ loại cây này.
[25] Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam trên trí nhớ",
Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr 202-206
Nghiên cứu của Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005) đã chỉ ra rằng lá sâm Việt Nam có nhiều tác dụng dược lý, đặc biệt là khả năng chống stress và chống oxy hóa Bài viết được đăng trên Tạp chí Dược liệu, cung cấp thông tin quan trọng về các lợi ích sức khỏe của loại thảo dược này.
[27] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hoá phân tích (2006), Hoá phân tích
[28] Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr 199 – 222, 493 – 685
[29] Y Fan, D Y Guo, Q Song, and T Li (2013), "Effect of total saponin of aralia taibaiensis on proliferation of leukemia cells", "Zhong Yao Cai", 36(4), pp 604-607
[30] C Liang, Y Ding, H T Nguyen, J A Kim, H J Boo, H K Kang, et al
(2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", "Bioorg Med Chem Lett", 20(23), pp 7110-7115
[31] Zhitao Liang, Zhihong Jiang, David Wangfun Fong, ZhongzhenZhao (2009),
“Determination of acid oleanolic and ursolic acid in Oldenlandia diffusa and its substitute using high performance liquid chromatography”, Journal of food and drug analysis, 17(2), pp 69-77
[32] B Mutschlechner, S Schwaiger, T V A Tran, and H Stuppner (2018),
"Development of a selective HPLC-DAD/ELSD method for the qualitative and quantitative assessment of commercially available Eurycoma longifolia products and plant extracts", "Fitoterapia", 124,pp 188-192
[33] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L
Pham, et al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", "Chem Pharm Bull (Tokyo)", 59(11), pp 1417-1420
[34] Y Satoh, S Sakai, M Katsumata, M Nagasao, M Miyakoshi, Y Ida, et al
(1994), "Oleanolic acid saponins from root-bark of Aralia elata",
[35] M Schwarz, B Klier, and H Sievers (2009), "Herbal reference standards",
[36] H F Tang, Y H Yi, Z Z Wang, Y P Jiang, and Y Q Li (1997),
"Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", "Yao Xue
[37] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al
(1989), "[Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng]", "Yao Xue Xue Bao", 24(8), pp 593-599
[38] Y Weng, L Yu, J Cui, Y R Zhu, C Guo, G Wei, et al (2014),
"Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type 2 diabetic rats", "J Ethnopharmacol", 152(3), pp 553-560
[39] M Xi, C Hai, H Tang, A Wen, H Chen, R Liu, et al (2010), "Antioxidant and antiglycation properties of triterpenoid saponins from Aralia taibaiensis traditionally used for treating diabetes mellitus", "Redox Rep", 15(1), pp 20-
[40] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva
[41] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/74029835#section=Top
[42] http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB0040855
Phụ lục 01 Phiếu kết quả giám định mẫu
Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính
Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính
Phụ lục 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH)
Phụ lục 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp
Phụ lục 01 Phiếu kết quảgiám định mẫu
Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R 2 n ồng độ 15,625 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 37,5 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 75 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 150 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 200 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 300 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 400 àg/ml
Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Kiểm tra tính thích hợp hệ thống
PHỤ LỤC 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH)
PHỤ LỤC 05 Sắc ký đồcao sâm vũ diệp