TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP
SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem [3,21], SVD thuộc chi
Sâm (Panax L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2]
Sâm vũ diệp là một loại cây thân thảo lâu năm, thích hợp với môi trường ẩm ướt và bóng râm Cây có thân rễ dài với nhiều đốt và dấu vết sẹo do sự rụng của thân hàng năm.
Thân khí sinh cao từ 20 - 30 cm, thường mọc đơn độc và thẳng, có đặc điểm rỗng giữa và vạch dọc Vào mùa đông, thân thường lụi nhưng sẽ mọc chồi mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 Lá kép chân vịt gồm 2 - 3 lá mọc vòng, với lá chét có hình thuôn, dài từ 2,5 - 14 cm và rộng từ 1,5 - 4 cm Lá có gốc tròn, đầu thuôn nhọn, xẻ thùy không đều, mép răng cưa và có lông.
Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21]
1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái
Sâm vũ diệp là loài sâm tự nhiên, được phát hiện sớm tại Việt Nam, chủ yếu phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn, gồm huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Gần đây, loài này đã được nghiên cứu và thử nghiệm trồng tại một số địa phương như Hà Giang và Lào Cai Tuy nhiên, vùng phân bố của sâm vũ diệp đang bị thu hẹp và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng, do đó, cần bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý hiếm này cho tương lai.
Sâm vũ diệp thường phát triển rải rác hoặc tập trung dưới tán rừng ẩm, nơi có sương mù gần như quanh năm Vào cuối tháng 2 và đầu tháng 3 hàng năm, từ phần đầu mầm của cây bắt đầu nhú lên.
Thân rễ phân nhánh ngang của cây sâm vũ diệp nằm sát mặt đất, từ đó sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân, tùy thuộc vào số đầu mầm Những chồi này phát triển nhanh chóng, sau một tháng đã có lá và gần đạt chiều cao tối đa Đến tháng 4, mỗi thân có lá có thể cho ra một cụm hoa, và quả xanh sẽ xuất hiện từ cuối tháng 4 đến tháng 6 Đến tháng 7, quả chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ Tuy nhiên, do quả chín vào thời điểm có lượng mưa lớn từ tháng 7 đến tháng 8, hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của cây Tuổi của cây có thể được xác định qua các vết sẹo trên thân hình thành sau khi quả chín.
Saponin được coi là hoạt chất chính trong chi Panax L., với gần 300 loại saponin đã được các nhà khoa học chiết tách và xác định Nghiên cứu trước đây của SVD cho thấy saponin là thành phần chủ yếu trong lá và rễ cây sâm vũ diệp, bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng cao và một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn.
Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập thành công 13 saponin khung dammaran từ lá của cây ginseng, bao gồm các ginsenosid đặc trưng như F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3.
Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002 đã chỉ ra rằng thân rễ và rễ củ SVD chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin, cùng với acid béo và acid amin Đến năm 2003, các nhà nghiên cứu xác định rằng thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan, bao gồm chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1 và ginsenosid Ro Bên cạnh đó, còn có các saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2.
Vào năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phát hiện và xác định 10 saponin khung oleanan (1-10) là thành phần chính trong rễ cây sâm vũ diệp thu hái từ núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, bao gồm 3 chất mới là bifinosid A-C (1-3).
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 1.2 Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [33]
Tính vị, công năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [3]
Nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy rằng nó có độc tính cấp rất thấp trên động vật thí nghiệm, đồng thời tăng cường chức năng sinh lý và có ảnh hưởng tích cực đến hệ thần kinh trung ương SVD cũng giúp tăng sức dẻo dai của cơ thể, nâng cao sức đề kháng và có tác dụng tán huyết Ngoài ra, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự chỉ ra rằng SVD có khả năng chống stress, chống trầm cảm, bảo vệ gan và kích thích tăng cường miễn dịch.
Sâm vũ diệp là một vị thuốc quý với nhiều tác dụng như chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, và tăng cường trí nhớ, đặc biệt hữu ích cho phụ nữ sau sinh Nó có khả năng chữa thiếu máu, xanh xao, và gầy yếu, đồng thời được sử dụng để cầm máu, tán ứ, và tiêu sưng Khi dùng ngoài, rễ phơi khô được tán mịn và rắc lên vết thương giúp làm lành nhanh chóng Ngoài ra, rễ sâm vũ diệp còn có thể ngâm rượu để chiết xuất tinh chất, hỗ trợ sức khỏe và chức năng sinh dục Người dân vùng trồng cũng sử dụng thân và lá để nấu cao, pha với nước hoặc rượu nhằm tận dụng tối đa lợi ích của cây.
Sâm vũ diệp không chỉ có tác dụng như rễ mà còn được sử dụng tại Trung Quốc như một loại thuốc chữa trị lao, chảy máu cam, thổ huyết và các tổn thương do đòn ngã.
TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 [41]
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:
(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [40]
Chất bột màu trắng Độ tan: 0,57 g/L [42] Điểm nóng chảy 210 - 215 0 C [41]
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Stipuleanosid R2 là một thành phần saponin quan trọng trong các dược liệu như sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis và Aralia elata, có tác dụng sinh học đáng chú ý Nghiên cứu cho thấy stipuleanosid R2 có khả năng gây độc tế bào ung thư, đặc biệt là đối với các dòng tế bào K562 và U937, đồng thời ức chế sự gia tăng của chúng Ngoài ra, nó còn có tác dụng chống oxy hóa, hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và giảm lipid máu.
1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC
Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào công bố về định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu bằng phương pháp HPLC trên toàn cầu, mà chủ yếu chỉ dừng lại ở việc phân lập chất này Vì vậy, việc phát triển phương pháp định lượng stipuleanosid R2 là rất cần thiết để ứng dụng dược liệu vào thực tiễn.
TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tách biệt các chất trong hỗn hợp phân tích, dựa trên nguyên lý phân tách giữa pha tĩnh và pha động Pha động trong HPLC là chất lỏng, trong khi pha tĩnh có thể là chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc chất lỏng phủ trên chất mang rắn, hoặc chất mang đã được liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Phương pháp này hoạt động dưới áp suất cao, giúp tối ưu hóa quá trình tách biệt.
Quá trình sắc ký lỏng được thực hiện dựa trên các cơ chế như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân bố theo kích cỡ, tùy thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng.
Tốc độ di chuyển của các chất trong quá trình phân tách phụ thuộc vào hệ số phân bố giữa hai pha, tức là ái lực tương đối của chúng với pha tĩnh và pha động Sự khác biệt này dẫn đến thứ tự rửa giải khác nhau, từ đó giúp phân tách hiệu quả các chất ra khỏi cột.
Sau khi các chất rời khỏi cột, chúng sẽ được phát hiện bởi detector, giúp đo nồng độ các chất phân tích Hiện nay, có nhiều loại detector như UV-Vis, huỳnh quang (FLD), diode array (DAD) và điện hoá Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn sử dụng detector DAD.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Khi thực hiện tách sắc ký cho hỗn hợp nhiều thành phần, kết quả thu được sẽ là một sắc đồ với nhiều pic khác nhau Quá trình sắc ký hiệu quả sẽ giúp tách biệt từng thành phần trong hỗn hợp, tạo ra số lượng pic tương ứng trên sắc ký đồ.
1.3.2 Một số thông số đặc trưng [2,3,5,9,10,15]
Hình 1.4 trình bày sắc ký đồ của hai chất cùng với các thông số đặc trưng Thời gian lưu t0 (thời gian chết) là khoảng thời gian mà pha động cần để đi qua hệ thống sắc ký Thời gian lưu tR được tính từ thời điểm chất phân tích được tiêm vào hệ thống cho đến khi đạt nồng độ cực đại Thời gian lưu thực tR’ được xác định bằng công thức tR’ = tR – t0.
Thời gian lưu là thông tin định tính quan trọng trong sắc ký đồ, phản ánh đặc trưng của một chất nhất định dưới các điều kiện sắc ký cụ thể Hệ số dung lượng k’ cũng là một yếu tố quan trọng, cho thấy khả năng tương tác của chất với pha tĩnh trong quá trình phân tách.
Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:
Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất giữa hai pha, thể hiện tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động tại thời điểm cân bằng Khi hệ số k’ nhỏ, thời gian lưu (tR) cũng sẽ nhỏ, cho thấy chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm.
Hệ số tách (k') ảnh hưởng lớn đến hiệu suất phân tích; nếu k' quá lớn, khả năng tách sẽ giảm, dẫn đến hiện tượng doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài Thực tế cho thấy, giá trị k' lý tưởng nằm trong khoảng từ 2 đến 5 Hệ số bất đối AF (tailing factor) cũng cần được xem xét để đảm bảo chất lượng phân tích.
Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ:
- W1/20: là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic
- a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic
Yêu cầu trong phép định lượng: 0,9 < AF < 2
Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối d) Hệ số chọn lọc
Yêu cầu về hệ số phân tách α cần nằm trong khoảng từ 1,05 đến 2; sự khác biệt giữa α và 1 càng lớn thì khả năng tách biệt giữa hai chất càng rõ ràng Độ phân giải (resolution) thể hiện mức độ tách biệt giữa hai chất trong điều kiện sắc ký, và độ phân giải của hai pic kề nhau được tính theo một công thức cụ thể.
- RS = 1,5: độ phân giải cơ bản đạt được, khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3%
- Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%
- RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC a) Yêu cầu chung
Các quy trình phân tích HPLC cần được thẩm định nếu chưa được công bố trong tiêu chuẩn Dược điển của các quốc gia Việc thẩm định phương pháp phân tích được hướng dẫn trong các tài liệu chuyên ngành và quy định trong các Dược điển.
Khi thẩm định phương pháp định lượng dược chất chính và đa lượng bằng kỹ thuật HPLC, cần đánh giá các thông số đặc trưng như tính thích hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng.
1.3.4 Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ diệp bằng HPLC
Năm 2009, nhóm nghiên cứu do Trần Công Luận dẫn đầu đã xác định hàm lượng saponin tổng số trong thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp bằng phương pháp trọng lượng của Namba, với kết quả đạt 5,86%.
Năm 2017, Nhóm nghiên cứu của Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội:
Nguyễn Thị Huệ đã tiến hành khảo sát và tối ưu hóa điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic và saponin toàn phần trong dược liệu sâm vũ diệp bằng phương pháp HPLC - DAD Kết quả cho thấy hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp là 0,034% (340 μg/g) và trong rễ sâm vũ diệp là 0,0066% (66 μg/g) Đồng thời, hàm lượng saponin trong cao sâm vũ diệp là 0,364% (3640 μg/g) và trong dược liệu SVD là 0,0698%.
Nghiên cứu này cung cấp những kết quả bước đầu về định lượng thành phần hóa học của sâm vũ diệp (SVD), đặc biệt là hàm lượng saponin tổng số Hiện tại, chưa có nhiều công bố phân tích và định lượng các thành phần saponin cụ thể trong SVD Chúng tôi sử dụng phương pháp HPLC để phân tích định lượng thành phần saponin, phương pháp được công nhận bởi Dược điển các nước với độ chính xác cao, vượt trội so với các phương pháp quang phổ hay khối lượng HPLC đáp ứng tốt yêu cầu phân tích từng thành phần riêng lẻ trong mẫu, đặc biệt là đối với các mẫu phức tạp như cao chiết từ dược liệu.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1 Nguyên liệu sâm vũ diệp
Mẫu nghiên cứu trong đề tài là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 Mẫu này đã được giám định tên khoa học bởi ThS Nguyễn Quỳnh Nga và CN Phan Văn Trường thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Hiện tại, mẫu tiêu bản (PB-150716) được lưu giữ tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu.
Thân rễ sâm vũ diệp có hình dạng cong ngoằn ngoèo với chiều dài từ 7-12 cm và đường kính 1,2-1,8 cm, mang nhiều đốt và vết sẹo Chất liệu của nó cứng chắc, giòn và dễ bẻ, với mặt bẻ lởm chởm và màu vàng nâu nhạt Sâm có mùi thơm nhẹ, vị đắng kèm theo chút ngọt.
Mẫu thân rễ SVD được thu hái tại Sa Pa, sau đó rửa sạch và cắt thành từng miếng mỏng Tiếp theo, mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 50 độ C và bảo quản trong túi nilong kín, để ở nơi khô ráo và thoáng mát, nhằm phục vụ cho nghiên cứu.
Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào
Cai vào ngày 15/7/2016 2.1.2 Chất tinh khiết stipuleanosid R2
Chúng tôi đã sử dụng chất stipuleanosid R2, được chiết xuất từ dược liệu sâm vũ diệp, trong một nghiên cứu trước đó của nhóm nghiên cứu chúng tôi.
Stipuleanosid R2 sau khi được phân lập sẽ được đánh giá độ tinh khiết để đảm bảo đạt tiêu chuẩn sử dụng làm chất chuẩn trong phương pháp định lượng nồng độ của chất này có trong SVD bằng HPLC.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được 2.1.3 Dung môi, hóa chất
Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC
- Dung môi dùng cho chiết xuất và phân lập: Ethanol 70%, methanol (MeOH), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH)
Dung môi chạy sắc ký HPLC như Methanol, Acetonitril và Acid acetic của Merck, Đức, cùng với nước cất hai lần, được sử dụng cho phân tích HPLC và đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã áp dụng các thiết bị và dụng cụ đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động
- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức)
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001 g, Precisa - Thụy Sĩ)
- Cân xác định độ ẩm Prescisa HA 60
- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml
- Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc)
- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ)
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
- Bếp điện, bếp đun cách thủy
- Cột sắc ký các loại kích cỡ
- Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 ml, ống nghiệm, pipet chính xác
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD bằng HPLC với chất chuẩn là stipuleanosid R2 tinh khiết được phân lập từ SVD
2 Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD thu hái ở Sa Pa, Lào Cai bằng phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định ở trên.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp cho thấy saponin là thành phần chính Để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất với mẫu thân rễ SVD, cần tham khảo tài liệu liên quan đến chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu.
- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%
- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng
Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau:
1 Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 70 0 C, chiết 3 lần
2 Tiến hành lọc loại bã dược liệu, các dịch chiết ethanol thu được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng ethanol
3 Cao ethanol này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetate và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ 1:1 Các phân đoạn ether, ethyl acetat, n-butanol đem cất quay chân không dưới áp
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU suất giảm để thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn
4 Cao butanol thu được trong quá trình chiết xuất sẽ được sử dụng để định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 có trong sâm vũ diệp
2.3.2 Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC a) Lựa chọn điều kiện sắc ký
Chúng tôi đã khảo sát các yếu tố như bước sóng, tỷ lệ dung môi, thành phần pha động, tốc độ dòng và thể tích bơm mẫu để xác định điều kiện sắc ký tối ưu cho việc phân tích stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD, nhằm đạt được kết quả chính xác nhất Đồng thời, chúng tôi cũng thẩm định stipuleanosid R2 phân lập từ SVD để đảm bảo đủ tiêu chuẩn làm chất chuẩn trong quy trình định lượng.
* Yêu cầu của chất sử dụng làm chất chuẩn [35]:
Nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn cần có độ tinh khiết cao, với yêu cầu đối với hợp chất hóa dược là trên 95% Những nguyên liệu này được lựa chọn từ các lô sản xuất thuốc chất lượng cao, đảm bảo tính đồng nhất và được cung cấp từ các nguồn đáng tin cậy, như các nhà sản xuất gốc.
Việc đánh giá tính phù hợp của nguyên liệu trong việc thiết lập tiêu chuẩn cần được thực hiện một cách cẩn thận, xem xét tất cả dữ liệu từ các phép thử và áp dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau để có được sự so sánh chính xác.
* Phương pháp thẩm định: Độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được được kiểm tra dựa vào ba phương pháp sau:
1 Sắc ký lớp mỏng: Sti phân lập được sẽ tiến hành sắc ký trên silicagel RP-
Để phát hiện chất 18 F254S (Merk), sử dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong Ethanol 96% Phun đều dung dịch lên bản mỏng, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 120°C và hơ nóng trên bếp điện từ cho đến khi xuất hiện màu Cuối cùng, quan sát vết xuất hiện dưới ánh sáng thường.
Yêu cầu: Sau khi phun thuốc thử trên sắc ký đồ phải xuất hiện một pic duy nhất màu hồng tím của stipuleanosid R2
2 HPLC Phương pháp đánh giá độ tinh khiết thông qua tổng tạp dựa theo phương pháp chuẩn hóa diện tích khi tiến hành định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
Tiến hành định lượng dung dịch stipuleanosid R2 bằng phương pháp HPLC với 06 lần lặp lại Kết quả sắc ký đồ cho phép tính toán lượng tạp thông qua phương pháp phần trăm diện tích pic.
Yêu cầu: độ tinh khiết > 95%
3 Đo độ nóng chảy: Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của stipuleanosid R2 phân lập được từ SVD
Yêu cầu: stipuleanosid R2 phân lập được phải có nhiệt độ nóng chảy nằm trong khoảng 210 - 215 0 C [41] c) Thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong SVD [4,5,40]
Độ đặc hiệu là khả năng xác định chính xác chất cần phân tích trong sự hiện diện của tạp chất hoặc các chất cản trở khác Phương pháp HPLC được xem là đặc hiệu khi có thể phân tích rõ ràng chất mục tiêu.
Trong sắc ký đồ, các mẫu thử có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê khi so sánh với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
* Kiểm tra tính thích hợp hệ thống
Tính thích hợp của hệ thống phân tích được xác định bởi độ chính xác của thiết bị, thông qua việc đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã xử lý Để đánh giá, tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn và ghi lại các giá trị về thời gian lưu và diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích.
Độ tuyến tính của đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hoặc chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp đến cao nhất trong đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Độ tuyến tính được mô tả bằng phương trình hồi quy y = ax + b, với hệ số tương quan tuyến tính R², trong đó y là đáp ứng của pic và x là nồng độ chất cần phân tích.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng độ
- Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng xác định của phương pháp
- Các mẫu chuẩn có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn ban đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau
* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được về mặt định tính
LOQ (Limit of Quantitation) là mức tối thiểu của chất cần phân tích có trong mẫu thử mà vẫn có thể xác định một cách định lượng với độ chính xác và độ tin cậy cao.
Để xác định LOD và LOQ, cần dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu nền (S/N) Tiến hành pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện bằng sắc ký Đồng thời, thực hiện đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng và mẫu thử.
LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà tại đó có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3/1)
LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N /1)
Độ lặp lại của phương pháp phân tích thể hiện mức độ thống nhất giữa các kết quả thử nghiệm riêng biệt khi áp dụng quy trình thử nghiệm lặp lại trên cùng một mẫu Để xác định độ lặp lại, cần thực hiện phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu, bắt đầu từ công đoạn đầu tiên như cân, pha, xử lý mẫu cho đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.
PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu nghiên cứu đã được xử lý thống kê bằng phương pháp sinh học, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 cùng với các công thức tính toán để phân tích kết quả.
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100 xRSD S
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU