Luận văn xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời omeprazole, lansoprazole, pantoprazole và rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC DAD)

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Các hoạt chất OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong huyết tương

Dung môi sử dụng cho sắc ký lỏng bao gồm acetonitril, methanol và nước, tất cả đều đạt tiêu chuẩn từ Merck, Đức Các hóa chất như kali dihydrophosphat, kali hydroxyd, triethylamin, natri acetat và acid acetic cũng được cung cấp bởi Merck, Đức, đảm bảo tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.

2.1.3 Chất đối chiếu, vật liệu nghiên cứu

Các chất đối chiếu được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thành Phố

Hồ Chí Minh, huyết tương người cung cấp bởi Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh (số kiểm soát: 1620 16L19) được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Hợp chất Số lô Hàm lượng Nơi cung cấp

Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM

PPZ Natri QT219 030715 94,21 % RPZ Natri QT226 010813 96,29 %

2.1.4 Dụng cụ, máy móc, thiết bị

Dụng cụ: Các loại pipet, micropipet, bình định mức, các loại dụng cụ lấy mẫu: bơm tiêm, ống ly tâm, ống đựng huyết tương

Bảng 2.2 trình bày các thiết bị nghiên cứu, tất cả đều được hiệu chuẩn định kỳ theo quy định Các dụng cụ thủy tinh chính xác của hãng Vitlab – Đức được sử dụng, đảm bảo đạt chuẩn chính xác cấp A.

Bảng 2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Hãng sản xuất, xuất xứ

Hệ thống HPLC 1260 Infinity Agilent, Mỹ

19 Đầu dò dãy diod quang (1260 diod) Agilent, Mỹ

Cột sắc ký XDB Zobrax

Máy đo pH S220K Mettler Toledo, Thụy Sĩ

Cân phân tích 0,01 mg, max 120 g Mettler Toledo, Thụy Sĩ

Bể siêu âm gia nhiệt Power Sonic, Taiwan

Máy quang phổ UV 1800 Shimadzu, Nhật

Máy ly tâm Hermle Z306K Hermle Z336K, Đức

Máy lắc vortex S200 Labnet, Mỹ

Hệ thống lọc dung môi Rooker 400, Taiwan

Màng lọc PTFE 0,22 àm; 0,45 àm Sartorius, Đức

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các dung dịch thử nghiệm

Dung dịch nội chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn nội

Indomethacin (IDM) được cho vào bình định mức 10 ml, sau đó thêm khoảng 5 ml methanol (MeOH) và siêu âm trong 5 phút Tiếp theo, thêm MeOH đến vạch định mức và lắc đều Dung dịch thu được có nồng độ IDM khoảng 500 µg/ml Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng đến nồng độ phù hợp cho việc khảo sát.

Dung dịch chuẩn gốc được tạo ra bằng cách cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn PPIs và hòa tan trong bình định mức 10 ml Sau khi thêm khoảng 5 ml MeOH và siêu âm trong 5 phút, tiếp tục thêm MeOH đến vạch định mức và lắc đều Dung dịch thu được có nồng độ hỗn hợp OPZ, LPZ, PPZ và RPZ khoảng 1000 àg/ml.

2.2.1.2 Dung dịch chuẩn làm việc

Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng với MeOH để tạo ra hai dung dịch chuẩn làm việc (SW) Nồng độ hỗn hợp các PPIs trong dung dịch SW1 là 144 g/ml, trong khi nồng độ trong dung dịch SW2 là 18 g/ml.

Thực hiện tính toán lượng thể tích cần thiết của dung dịch SW1 và SW2 trong

400 l huyết tương để thu được các mẫu đối chiếu có nồng độ hỗn hợp các PPIs là

2000 ng/ml và IS là 8000 ng/ml sau khi xử lý mẫu

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn gốc thứ hai và pha loãng đến nồng độ phù hợp Sau đó, thêm một lượng nhất định dung dịch này vào 400 µl huyết tương để tạo ra các mẫu có nồng độ thấp (LQC), trung bình (MQC) và cao (HQC) với nồng độ sau khi xử lý tương ứng là 1000 ng/ml, 3000 ng/ml và 5000 ng/ml.

Lấy 400 µl huyết tương trắng cho vào ống ly tâm, sau đó thêm 50 µl dung dịch SW hỗn hợp PPIs (hoặc QC) và vortex trong 30 giây Tiếp theo, thêm 50 µl dung dịch chất nội chuẩn và vortex trong 1 phút để thu được mẫu giả lập.

Qui trình nghiên cứu được thực hiện qua các giai đoạn như Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.2.2.1 Xây dựng điều kiện sắc ký

Nghiên cứu xây dựng điều kiện sắc ký được thực hiện trên máy HPLC Agilent

1260 (Mỹ), đầu dò dãy diod (DAD) với mẫu MQC Dựa vào tính chất hóa lý của

Xây dựng điều kiện sắc ký

Phương pháp xử lý mẫu

Thẩm định quy trình phân tích đã chọn

Xử lý kết quả và viết báo cáo

Nghiên cứu này tập trung vào 21 chất bằng kỹ thuật sắc ký pha đảo, khảo sát các điều kiện sắc ký trên cột C18 kích thước 150 x 4,6 mm và độ hạt 5 µm, với cột bảo vệ cùng loại.

Bước sóng phát hiện được xác định thông qua việc khảo sát các dung dịch chuẩn OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong methanol với nồng độ khoảng 5 µg/ml Quá trình này sử dụng máy quang phổ UV 1800 (Shimadzu) để thực hiện quét phổ hấp thu UV của bốn dung dịch, từ đó chọn ra bước sóng phát hiện phù hợp.

Pha động: Thăm dò một số pha động, sử dụng hỗn hợp pha động là MeOH,

ACN được kết hợp với dung dịch có pH thay đổi, như dung dịch đệm hoặc dung dịch kiềm, ở các tỷ lệ phù hợp nhằm đảm bảo sự tách biệt và độ cân đối của pic đạt yêu cầu.

Tốc độ dòng, nhiệt độ cột và thể tích tiêm mẫu được khảo sát đồng thời để tối ưu hóa điều kiện sắc ký Mục tiêu là đảm bảo các pic PPIs và IDM tách hoàn toàn, đồng thời phân tách khỏi các pic tạp, đạt độ tinh khiết cần thiết cho định lượng và các thông số sắc ký yêu cầu.

 Hệ số phân giải giữa các chất không nhỏ hơn 1,5

 Số đĩa lý thuyết của các pic không nhỏ hơn 3000

 Hệ số bất đối xứng của các pic từ 0,9 đến 1,5

 Thời gian phân tích cho một mẫu khoảng 20 phút

 RSD % của thời gian lưu của các pic với 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0

 RSD% của tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/nội chuẩn của 6 lần tiêm lặp lại ở nồng độ định lượng không lớn hơn 2,0 %

2.2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

Tiến hành khảo sát các phương pháp chiết tách sau đây:

Phương pháp gây tủa protein bằng dung môi hữu cơ bao gồm việc thêm 50 µl dung dịch KOH 0,25 M và 1,2 ml dung dịch MeOH hoặc ACN vào mẫu thử giả lập Sau đó, vortex trong 5 phút và ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút Lấy dịch nổi và lọc qua màng PTFE 0,22 µm để thu được dịch lọc, sau đó tiến hành phân tích bằng sắc ký Đồng thời, thực hiện song song với mẫu được chiết không kiềm hóa.

Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng bắt đầu bằng cách thêm 4,5 ml hỗn hợp dung môi diethyl ether và triethylamin (tỷ lệ 99:1) vào mẫu thử giả lập, sau đó vortex trong 5 phút Tiếp theo, ly tâm ở tốc độ 4500 vòng/phút trong 10 phút để tách lớp Lấy 3 ml dịch nổi và bốc hơi ở 40 °C bằng máy ủ nhiệt khô Sau khi thu được cặn, hòa tan vào 1 ml dung dịch pha động và lọc qua màng PTFE 0,45 µm để thu dịch lọc, sẵn sàng cho quá trình tiềm sắc ký.

2.2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích đã chọn

Quy trình phân tích được thực hiện theo hướng dẫn của FDA, đảm bảo các chỉ tiêu về tính đặc hiệu, đường chuẩn, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu suất chiết và độ ổn định mẫu Bước đầu tiên là kiểm tra tính tương thích của hệ thống.

Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối chiếu với cùng nồng độ và điều kiện, yêu cầu RSD % của thời gian lưu hoặc thời gian di chuyển phải ≤ 2 %, và tỷ số diện tích pic (RS/IS) của chất cần định lượng cũng phải ≤ 2 % Hệ số T cần nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5, cùng với độ phân giải giữa các pic cần định lượng đạt Rs ≥ 1,5.

Tiến hành sắc ký mẫu pha động và mẫu đối chiếu, bao gồm mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa thử và mẫu huyết tương chứa thử thêm chất đối chiếu Các mẫu này được xử lý theo quy trình tối ưu dựa trên kết quả khảo sát các phương pháp xử lý mẫu Đồng thời, ghi lại các sắc ký đồ và đánh giá độ tinh khiết của tín hiệu sắc ký bằng đầu dò dãy diod quang.

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau [26]:

Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu pha động không xuất hiện các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng trong sắc ký đồ mẫu đối chiếu.

 Sắc ký đồ của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ hoặc điện di đồ của mẫu đối chiếu

PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê để phân tích các đại lượng đặc trưng, kết hợp với tính toán hỗ trợ từ Microsoft Office Excel 16, giúp tối ưu hóa quá trình phân tích dữ liệu Một số công thức tính toán quan trọng trong xử lý thống kê sẽ được áp dụng để đạt được kết quả chính xác và hiệu quả.

𝑛 − 1 tương ứng với hàm STDEV.S trong Microsoft Excel

 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD %):

Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất, y = ax + b, mô tả mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích Để kiểm tra độ phù hợp của phương trình hồi quy, cần thực hiện phân tích trắc nghiệm Fischer, đồng thời sử dụng trắc nghiệm Student để đánh giá ý nghĩa thống kê của các hệ số a và b.

 Các kết quả khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

Dựa trên tính chất hóa lý của các PPIs và tài liệu tham khảo, chúng tôi đã chọn kỹ thuật sắc ký pha đảo với đầu dò dãy diod quang để khảo sát Điều kiện sắc ký ban đầu bao gồm cột sắc ký XDB Zobrax C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) và cột bảo vệ C18 (4 x 4,6 mm, 5 µm) từ Agilent (Mỹ) Thể tích tiêm mẫu là 20 µl, tốc độ dòng là 1,0 ml/phút và bước sóng ghi nhận tín hiệu.

Trong khoảng sóng 190 – 400 nm, chúng tôi tiến hành thăm dò các hỗn hợp dung môi ACN/MeOH và nước ở các pH và tỷ lệ khác nhau Mục tiêu là chọn điều kiện sắc ký để các pic PPIs tách biệt rõ ràng và không bị lẫn với các pic tạp chất Kết quả là tín hiệu pic sắc ký cân đối, đạt độ tinh khiết cao và thời gian phân tích phù hợp.

3.1.1 Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện

Quá trình quét phổ hấp thu được thực hiện trên máy UV 1800 (Shimadzu) trong khoảng bước sóng từ 190 - 400 nm đối với các dung dịch OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong MeOH với nồng độ mỗi chất khoảng 5 µg/ml Kết quả thu được cho thấy OPZ có cực đại ở 301 nm, LPZ và RPZ đều có cực đại ở 283,5 nm, trong khi PPZ có cực đại ở 289 nm Bước sóng 285 nm đã được lựa chọn để ghi nhận tín hiệu cho cả bốn PPIs trong các nghiên cứu tiếp theo.

Spectrum_Omeprazol_20180513_110258 - Raw Data nm.

Spectrum_Lansoprazol_20180513_104314 - Raw Data nm.

Hình 3.1 Phổ UV của OPZ, LPZ, PPZ, PPZ 3.1.2 Kết quả khảo sát pha động

Dựa trên tài liệu tham khảo [10], [12], [18], [19], [24], nghiên cứu lựa chọn tốc độ dòng cố định là 1,0 ml/phút, bước sóng 285 nm và thể tích tiêm 10 µl cho mẫu chuẩn pha trong MeOH Nghiên cứu tiến hành khảo sát thăm dò một số pha động bằng cách sử dụng hỗn hợp pha động gồm MeOH, ACN và nước, điều chỉnh với các tỷ lệ khác nhau.

 ACN/MeOH và dung dịch đệm phosphat 5 mM pH 8 (KH2PO4 được điều chỉnh bằng dung dịch KOH)

 ACN/MeOH và dung dịch đệm nati acetat 5 mM pH 7,6 (được điều chỉnh bằng dung dịch TEA 1%)

 ACN/MeOH và nước 0,3% TEA, pH 7,2 (được điều chỉnh bằng dung dịch acid acetic)

3.1.2.1 Khảo sát hệ pha động 1

Pha động được sử dụng trong nghiên cứu là hỗn hợp MeOH và KH2PO4 5 mM, với pH điều chỉnh đến 8,0 bằng KOH 1 M và tỷ lệ 40:60 Sắc ký đồ thu được cho thấy các pic PPIs đã được tách nhưng vẫn còn nhiều sự chồng lấp và pic bị giãn, dẫn đến độ tinh khiết không cao.

Spectrum_Rabeprazol_20180513_105240 - Raw Data nm.

Spectrum_Pantoprazol_20180513_103351 - Raw Data nm.

Hình 3.2 SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 3.1.2.2 Khảo sát hệ pha động 2

Dựa trên khảo sát hệ pha động 1, các tỷ lệ pha động được điều chỉnh bằng hỗn hợp MeOH và KH2PO4 5 mM (điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1M) với tỷ lệ 75:25 (tt/tt) đã cho kết quả sắc ký đồ như thể hiện trong Hình 3.3.

Hình 3.3 trình bày SKĐ khảo sát pha động MeOH với đệm phosphat 5 mM, pH 8 theo tỷ lệ 75:25 Nhận xét cho thấy, các tín hiệu PPIs đã tách biệt gần như hoàn toàn; tuy nhiên, thông số độ phân giải Rs < 1,5 vẫn chưa đáp ứng yêu cầu cho phương pháp định lượng.

3.1.2.3 Khảo sát hệ pha động 3

Sắc ký đồ được thu nhận với pha động là hỗn hợp ACN và dung dịch KH2PO4 5 mM, điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1M, theo tỷ lệ 40:60 Hình 3.4 minh họa kết quả này.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\KHAO_SAT000020.D)

DAD1 A, Sig(0,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\SAMPLE_1000109.D)

31 thấy, trên sắc ký đồ Hình 3.4 đường nền ổn định, nhưng các pic PPIs không tách nhau

Hình 3.4 SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 3.1.2.4 Khảo sát hệ pha động 4

Dựa trên khảo sát hệ pha động 3, tỷ lệ dung môi ACN được điều chỉnh thành 25% và đệm phosphat KH2PO4 5 mM (điều chỉnh pH đến 8,0 bằng KOH 1M) là 75% Kết quả phân tích sắc ký đồ thu được như Hình 3.5.

Hình 3.5 trình bày kết quả khảo sát pha động ACN với đệm phosphat 5 mM, pH 8 (25:75) Kết quả cho thấy việc thay thế MeOH bằng ACN trong hệ pha động 2 cải thiện khả năng tách, với các thông số sắc ký đạt tiêu chuẩn cho phương pháp định lượng Cụ thể, các pic có độ cân đối (T ≈ 1), độ phân giải Rs > 2, và số đĩa lý thuyết N > 3000 cho mỗi chất Thời gian phân tích cho 4 chất là một khoảng thời gian tối ưu.

30 DAD1 A, Sig(0,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PPI000016.D)

Hệ pha động 4 được chọn làm cơ sở cho khảo sát tiếp theo do tính phù hợp cao (< 15 phút), ít tốn thời gian và dung môi.

Hỗn hợp pha động ACN và đệm natri acetat 5 mM (điều chỉnh pH đến 7,6 bằng TEA 1 %), với tỷ lệ 25 : 75 (tt/tt) thu được sắc ký đồ ở Hình 3.6

Hình 3.6 trình bày hệ pha động ACN với đệm natri acetat 5 mM, pH 7,6 (tỷ lệ 25:75), cho thấy khả năng phân tách tương đương với hệ số 4 Các thông số sắc ký như hệ số T (0,8 – 1,5), độ phân giải Rs > 2, số đĩa lý thuyết N > 3000 và hệ số phân bố k’ (< 5) đều đáp ứng yêu cầu cho một phép định lượng hiệu quả.

Hỗn hợp pha động gồm ACN và nước kiềm 0,3% TEA (điều chỉnh pH 7,2 bằng acid acetic) với tỷ lệ 55:45 (tt/tt) đã được sử dụng để thu được sắc ký đồ như thể hiện trong Hình 3.7 Trên sắc ký đồ này, các pic tách nhau chưa hoàn toàn.

Hình 3.7 SKĐ khảo sát pha động ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (55 : 45) 3.1.2.7 Khảo sát pha động 7

Hỗn hợp pha động được sử dụng trong sắc ký đồ bao gồm MeOH, ACN và nước kiềm 0,3% TEA, đã được điều chỉnh pH đến 7,2 bằng acid acetic, với tỷ lệ 32:15:53 Kết quả sắc ký đồ được trình bày trong Hình 3.8.

Hình 3.8 SKĐ khảo sát pha động MeOH – ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (32 : 15 : 53)

Trên sắc ký đồ Hình 3.8, pic của các PPIs được tách hoàn toàn với tín hiệu sắc nét và cân đối Các thông số sắc ký cho thấy hệ số T nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, số đĩa lý thuyết N lớn hơn 3000, độ phân giải Rs lớn hơn 2, hệ số phân bố k’ nhỏ hơn 5, và thời gian phân tích cho một quy trình không quá 15 phút Thêm vào đó, việc lựa chọn pha động mang lại nhiều ưu điểm.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PANTOPRAZOLE002.D)

PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU

Tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu huyết tương khác nhau, đánh giá và lựa chọn phương pháp phù hợp để thực hiện xử lý mẫu

Để xử lý mẫu huyết tương bằng phương pháp gây tủa protein, thêm 400 µl huyết tương trắng, 50 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp các PPIs với nồng độ khoảng 18 µg/ml và 50 µl dung dịch chuẩn IS, sau đó lắc xoáy trong 30 giây Tiếp theo, bổ sung 1,2 ml MeOH, lắc xoáy trong 2 phút và ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 15 phút Lấy dịch nổi và lọc qua màng lọc 0,22 µm, tiêm 10 µl vào hệ thống phân tích sắc ký, thu được SKĐ Hình 3.10b Lặp lại quy trình trên nhưng thêm 100 µl dung dịch KOH 0,25M, thu được SKĐ Hình 3.10c.

Xử lý mẫu huyết tương bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng bắt đầu bằng cách thêm 400 µl huyết tương trắng và 50 µl dung dịch chuẩn chứa các PPIs với nồng độ khoảng 18 µg/ml cùng 50 µl dung dịch chuẩn IS, sau đó lắc xoáy trong 30 giây Tiếp theo, thêm 4,5 ml hỗn hợp dung môi diethyl ether - triethylamin (tỷ lệ 99:1) và lắc xoáy trong 5 phút, sau đó ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 10 phút Lấy 3 ml dịch nổi và bốc hơi ở 40 °C bằng máy ủ nhiệt khô, sau đó hòa tan cặn thu được vào 1 ml dung dịch pha động và lọc qua màng PTFE kích thước lỗ 0,45 µm Cuối cùng, dịch lọc được tiêm 10 µl vào hệ thống phân tích sắc ký, trong khi mẫu chứa hỗn hợp các chất chuẩn PPIs và IS cũng được chuẩn bị và lọc tương tự để tạo ra dịch tiêm sắc ký.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PPI_08092018_09-09 15-55-52\072-0101.D)

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\MET HO D\DS.HÀ\KHAO _SAT 000089.D)

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\MET HO D\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\023-2301.D)

Hình 3.10 mô tả các mẫu huyết tương khác nhau: a huyết tương trắng; b mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH; c mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH và dung dịch kiềm hóa KOH; d mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng; e mẫu chuẩn và nội chuẩn pha trong pha động (hệ pha động số 7).

Nhận xét: Hình 3.10a, mẫu huyết tương trắng hoàn toàn không xuất hiện pic

Sắc ký đồ trong Hình 3.10b cho thấy các pic chưa tách biệt và còn bị giãn, xen phủ lẫn nhau, điều này cho thấy điều kiện chưa phù hợp để xử lý mẫu Ngược lại, sắc ký đồ trong Hình 3.10c và Hình 3.10d cho thấy các pic IS và PPIs đã được tách biệt rõ ràng hơn.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\MET HO D\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-12 14-39-56\SAMPLE000001.D)

Phương pháp gây tủa protein có kiềm hóa và phương pháp chiết tách phân bố lỏng – lỏng là hai lựa chọn phù hợp để xử lý mẫu, giúp tách biệt các thành phần một cách rõ ràng và cân đối, tương tự như mẫu chuẩn trong pha động.

Kết quả phân tích ANOVA cho thấy hai phương pháp chiết có tỷ lệ phục hồi cao trên 80%, RSD dưới 15% và p lớn hơn 0,05, chứng tỏ không có sự khác biệt thống kê giữa hai phương pháp Phương pháp gây tủa protein có kiềm hóa được ưu tiên do tính nhanh chóng, dễ thực hiện và đạt yêu cầu cho phân tích mẫu trong dịch sinh học, nên được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.1 Kết quả phân tích ANOVA các phương pháp xử lý mẫu

Value TB ± SD % sai khac P -Value

Ghi chú: MQC 3000 ng/ml Phương pháp 1: gây tủa protein có kiềm hóa mẫu Phương pháp 2: chiết tách phân bố lỏng – lỏng

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐÃ CHỌN

3.3.1 Tính tương thích hệ thống

Việc thẩm định tính tương thích của hệ thống là rất quan trọng trong các phương pháp phân tích bằng sắc ký, nhằm xác định độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống phân tích Trong nghiên cứu này, khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch mẫu huyết tương giả lập với nồng độ các PPIs khoảng 1000 ng/ml và IS khoảng 8000 ng/ml, các kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.2.

Kết quả phân tích từ Bảng 3.2 cho thấy các thông số sắc ký như thời gian lưu (tR), hệ số phân bố (k’), và tỷ lệ diện tích pic của chất chuẩn/chất nội chuẩn (RS/IS) đều có RSD < 2% Số đĩa lý thuyết (N) lớn hơn 3000, hệ số bất đối (T) nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, và độ phân giải (Rs) lớn hơn 1,5 Điều này chứng tỏ phương pháp đã được xây dựng đạt tính tương thích hệ thống cao.

Bảng 3.2 Bảng kết quả phân tích tính tương thích hệ thống

STT t R k' R S/IS T N Rs t R k' R S/IS T N Rs t R k' R S/IS T N Rs t R k' R S/IS T N Rs

Ghi chú: t R (thời gian lưu); k’(hệ số phân bố); R S/IS (tỷ lệ diện tích chất chuẩn/chất nội chuẩn); T (USB Tailling); N (Số đĩa lý thuyết); Rs (Độ phân giải)

3.3.2 Thẩm định tính đặc hiệu

Bài viết phân tích các mẫu pha động, mẫu chuẩn và nội chuẩn trong pha động, bao gồm mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa mẫu thử, và mẫu huyết tương chứa mẫu thử thêm chuẩn (giả lập) với nồng độ 2000 ng/ml có chất nội chuẩn indomethacin theo phương pháp đã xây dựng Kết quả sắc ký đồ của các mẫu được trình bày trong Hình 3.11.

DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\PPI_08092018_09-09 15-55-52\072-0101.D)

Hình 3.11 SKĐ: a mẫu huyết tương trắng; b mẫu thử giả lập; c mẫu huyết tương chứa mẫu thử thêm chuẩn; d mẫu pha động

Nhận xét: Trên sắc ký đồ các pic tách rời nhau, tại thời gian lưu 5,7; 7,0; 8,4;

Tín hiệu của IDM, PPZ, OMZ, RPZ và LPZ lần lượt xuất hiện tại 9,5 và 13,3 phút (Hình 3.11b, c), trong khi sắc ký đồ của mẫu pha động và mẫu huyết tương trắng không ghi nhận pic của các chất này tại thời gian lưu tương ứng (Hình 3.11a, d) Phổ hấp thu UV cho mỗi tín hiệu được ghi nhận (Hình 3.12a, b, c, d, e) và độ tinh khiết pic của mẫu thử đạt trên 99,99% theo phần mềm Chemstation - Agilent với đầu dò DAD (Hình 3.12f, g, h, i, j) Phương pháp phân tích đảm bảo nhận diện và phân biệt rõ ràng các PPIs và IS, không bị ảnh hưởng bởi tạp chất trong huyết tương, cho thấy tính chọn lọc và độ đặc hiệu cao của phương pháp.

9 DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\MET HO D\DS.HÀ\DEF_LC 2018-09-08 08-39-09\023-2301.D)

-0.75 -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 DAD1 A, Sig(5,4 Ref=off (D:\METHOD\DS.HÀ\khao sat\Mau pha dong.D)

Hình 3.12 Phổ hấp thu UV: a IS; b PPZ; c OPZ; d RPZ ; e LPZ; Độ tinh khiết pic: f IS; g PPZ; h OPZ; i RPZ ; j LPZ

3.3.3 Thẩm định độ tuyến tính

Chuẩn bị các mẫu huyết tương theo hướng dẫn trong mục 2.2.1 và xử lý chúng theo quy trình đã chọn tại mục 3.2 Tiến hành phân tích sắc ký để khảo sát mối tương quan tuyến tính giữa tỷ lệ nồng độ và tỷ lệ diện tích pic của chất chuẩn và chất nội chuẩn trong mẫu huyết tương.

Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của PPZ

Diện tích pic PPZ (mAU.s) 24,668 30,765 67 120,85 254,07 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46

Tỷ lệ diện tích pic 0,07937 0,09753 0,21719 0,39024 0,81053 Phương trình hồi quy (y = a.x +b) y = 0,7957.x ; r 2 = 0,999 y là tỷ lệ diện tích S/IS; x là tỷ lệ nồng độ S/IS

Hình 3.13 Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của PPZ

Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình cho thấy tính tương thích với hệ số F = 1198,07, lớn hơn F0,05 = 7,77 Đồng thời, trắc nghiệm Student cho thấy hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê với t = 34,61, vượt qua t0,05 = 2,77 (p < 0,05) Ngược lại, hệ số b (Intercept) không có ý nghĩa thống kê, với t = 1,09, nhỏ hơn t0,05 = 2,77 (p > 0,05).

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của OPZ

Diện tích pic OPZ (mAU.s) 23,765 42,695 94,813 164,26 353,66 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46

Hình 3.14 Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của OPZ

Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình cho thấy sự tương thích với hệ số F = 1254,56, lớn hơn F0,05 = 7,77 Đồng thời, trắc nghiệm Student cho thấy hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê với t = 35,41978, lớn hơn t0,05 = 2,77 và p < 0,05 Ngược lại, hệ số b (Intercept) không có ý nghĩa thống kê với t = 0,216169, nhỏ hơn t0,05 = 2,77 và p > 0,05.

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của RPZ

Diện tích pic RPZ (mAU.s) 21,98 34,79 75,67 133,27 274,27 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46

Hình 3.15 Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của RPZ

Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình thể hiện sự tương thích với hệ số F = 2210,779, lớn hơn F0,05 = 7,77 Đồng thời, trắc nghiệm Student cho thấy hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê với t = 47,0189, vượt qua t0,05 = 2,77 và p < 0,05 Ngược lại, hệ số b (Intercept) không có ý nghĩa thống kê với t = 1,47356, nhỏ hơn t0,05 = 2,77 và p > 0,05.

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của LPZ

Diện tích pic LPZ (mAU.s) 21,15 36,09 80,61 159,91 310,46 Diện tích pic IS (mAU.s) 310,79 315,45 308,48 309,68 313,46

Hình 3.16 Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của LPZ

Kết quả trắc nghiệm Fischer cho thấy phương trình có hệ số F = 3063,9404, lớn hơn F0,05 = 7,77, chứng minh tính tương thích Đồng thời, trắc nghiệm Student chỉ ra rằng hệ số a (Slope) có ý nghĩa thống kê với t = 55,3528, vượt qua t0,05 = 2,77 (p < 0,05), trong khi hệ số b (Intercept) không có ý nghĩa thống kê với t = 0,61423, nhỏ hơn t0,05 = 2,77 (p > 0,05).

3.3.4 Giới hạn định lượng dưới

Dựa vào kết quả thẩm định tính tuyến tính, xác định giá trị nồng độ thấp nhất (độ nhạy) mà phương pháp vẫn duy trì tính đúng và chính xác, dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc đường tuyến tính.

LLOQ của PPZ, OPZ, RPZ và LPZ được xác định lần lượt là 480,0698 ng/ml; 507,2739 ng/ml; 484,8794 ng/ml và 505,3141 ng/ml

3.3.5 Thẩm định độ đúng, độ lặp lại

Tiến hành thẩm định độ đúng, độ lặp lại trên 3 lô mẫu LQC 1000 ng/ml, MQC

Kết quả thẩm định độ đúng và độ lặp của phương pháp được thực hiện với nồng độ 3000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml, đã được trình bày chi tiết trong Bảng 3.7 và Bảng 3.8.

Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày (3 ngày)

LQC (1000 ng/ml) MQC (3000 ng/ml) HQC (5000 ng/ml) Nồng độ

(ng/ml) Độ đúng (%) Nồng độ

(ng/ml) Độ đúng (%) PPZ

Nhận xét: Kết quả từ Bảng 3.7, Bảng 3.8 và kết quả phân tích thống kê Bảng

3.9 cho thấy tất cả các lô mẫu phân tích ở 3 nồng độ thấp, trung bình và cao có độ đúng trong ngày và giữa các ngày nằm trong giới hạn cho phép (85 – 115 %) Độ lặp lại (độ chính xác) trong ngày và giữa các ngày đều đạt yêu cầu RSD < 15 % với giá trị cao nhất là 10,87 % Do đó, phương pháp có độ đúng, độ chính xác cao, đáp ứng được yêu cầu của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học

Bảng 3.8 Kết quả thẩm định độ chính xác (độ lặp lại) trong ngày và khác ngày

Nồng độ tìm thấy (LQC

Nồng độ tìm thấy (MQC

Nồng độ tìm thấy (HQC

Bảng 3.9 Số liệu của Summary Statistics (Độ đúng)

Standard Deviation 7,3754 5,5337 5,0450 7,6938 5,7434 5,7906 9,5362 7,0570 5,3894 7,9744 5,9140 4,4294 Sample Variance 54,3967 30,6215 25,4516 59,1944 32,9861 33,5306 90,9394 49,8018 29,0459 63,5903 34,9755 19,6194 Kurtosis 1,10536 -0,62160 1,88544 -0,57795 2,70443 0,73201 0,64044 -0,76552 -0,82529 -0,79734 0,02974 -0,59023 Skewness -0,86578 -0,20133 0,63237 0,18300 -1,35487 0,49241 -0,43191 -0,03878 -0,18885 -0,35983 -0,47486 -0,12846

Bảng 3.10 Kết quả hiệu suất chiết của PPZ và OPZ

Mẫu LQC/MP % tìm lại

Mẫu HQC/MP % tìm lại

R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP

Ghi chú: R (S/IS) tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/chất nội chuẩn, LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml)

Bảng 3.11 Kết quả hiệu suất chiết của RPZ và LPZ

R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP R (S/IS) /HT R (S/IS) /MP

Ghi chú: R (S/IS) tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/chất nội chuẩn, LQC (1000 ng/ml), HQC (5000 ng/ml)

Chúng tôi đã tiến hành phân tích các lô mẫu LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml trong huyết tương, xử lý mẫu theo quy trình đã được thiết lập Đồng thời, mẫu được thực hiện song song với nồng độ tương ứng trong pha động Kết quả so sánh tỷ lệ S/IS của các mẫu được trình bày trong Bảng 3.10 và Bảng 3.11.

Kết quả khảo sát cho thấy hiệu suất chiết trung bình ở các nồng độ LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml lần lượt đạt 83,11 % và 89,36 % cho PPZ; 86,21 % và 92,34 % cho OPZ; 89,48 % và 97,15 % cho RPZ; cùng 91,48 % và 97,15 % cho LPZ RSD của tất cả các lô mẫu không vượt quá 15 %, dao động từ 4,77 % đến 13,02 % Như vậy, quy trình xử lý mẫu đáp ứng yêu cầu theo quy định của phương pháp phân mẫu trong dịch sinh học.

3.3.7.1 Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc

Sau khi phân tích và so sánh tỷ lệ S/IS của dung dịch chuẩn gốc trong MeOH sau 1, 3 và 5 ngày bảo quản ở 2 – 8 oC, kết quả cho thấy dung dịch sau 5 ngày chỉ sai khác không quá 2% so với thời điểm ban đầu, với mức sai lệch lớn nhất là 1,67% Độ lệch chuẩn tương đối của các lô mẫu phân tích đều dưới 2%, cho thấy dung dịch gốc ổn định trong 5 ngày ở điều kiện bảo quản này.

Bảng 3.12 Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc PPIs và IS

3.3.7.2 Độ ổn định của hoạt chất trong huyết tương

BÀN LUẬN

Phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học rất quan trọng cho việc đánh giá chính xác dữ liệu dược động học và phân tích số liệu trong nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và thẩm định sinh học (TĐSH) Để đảm bảo kết quả phân tích là chính xác, ổn định và đáng tin cậy, các phương pháp này cần được đánh giá và thẩm định kỹ lưỡng.

Trong việc định lượng các PPIs, nhiều phương pháp như quang phổ hấp thu phân tử (UV-VIS), cực phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có thể được áp dụng Tuy nhiên, với mẫu phức tạp như dịch sinh học và nồng độ thấp, sắc ký lỏng được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định OPZ, LPZ, PPZ và RPZ Sau khi qua hệ thống sắc ký, mẫu có thể được phân tích bằng đầu dò khối phổ, quang phổ tử ngoại hoặc đầu dò dãy diod quang Mặc dù đầu dò khối phổ có độ nhạy cao, nhưng chưa phổ biến trong nước do chi phí đầu tư lớn và yêu cầu kỹ thuật phức tạp Nghiên cứu này đã sử dụng đầu dò DAD trong hệ thống HPLC, một giải pháp phổ biến hiện nay cho các phòng thí nghiệm.

Phương pháp đã được phát triển và xác nhận thành công các tiêu chí như tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ lặp lại, giới hạn định lượng, tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết) và độ ổn định của mẫu thử theo yêu cầu của FDA.

Chuẩn nội là yếu tố quan trọng trong phương pháp phân tích sinh học, có tính chất lý hóa tương tự như chất phân tích, giúp giảm sai số trong quá trình phân tích Các PPIs và IDM có đặc điểm lý hóa gần giống nhau, cho phép sử dụng IDM làm chuẩn nội để định lượng PPIs IDM là chất chuẩn dễ kiếm và có cực đại hấp thụ gần với cực đại hấp thụ của các PPIs So với nghiên cứu của Noubarani và cộng sự, việc sử dụng một chất không phải là PPIs làm chuẩn nội cho phép định lượng chính xác hơn các chất còn lại.

63 lượng được cả bốn PPIs trên cùng một sắc ký đồ và trên cùng một lần phân tích

IDM giúp tiết kiệm thời gian, hóa chất và chi phí trong quá trình thực nghiệm, đồng thời đáp ứng các yêu cầu của một chuẩn nội phổ biến và dễ tìm kiếm.

Các điều kiện sắc ký và tính đặc hiệu được xác định thông qua việc khảo sát các pha động với tỷ lệ khác nhau, nhằm tìm ra điều kiện sắc ký tối ưu dựa trên các thông số của pic sắc ký và độ ổn định của chất phân tích Do các PPIs có tính kém bền, đặc biệt trong môi trường pH thấp, nên cần lựa chọn pha động với pH phù hợp để giảm thiểu sự phân hủy của PPIs, đồng thời đảm bảo các thông số sắc ký đạt yêu cầu Trong các nghiên cứu trước đây, việc sử dụng pH đệm là 4,5 được cho là chưa hợp lý.

[12], nhưng chủ yếu các tác giả sử dụng pH của đệm là khoảng 7,0 [10], [16],

Nghiên cứu ban đầu cho thấy việc sử dụng dung dịch đệm như đệm phosphat và đệm acetat với pH 8,0 có khả năng phân tách tốt các PPIs, tuy nhiên, thời gian rửa cột kéo dài từ 2 đến 3 giờ gây khó khăn cho quy trình phân tích Để khắc phục nhược điểm này, chúng tôi đã khảo sát dung dịch nước kiềm với pH 7,2, một lựa chọn đơn giản và dễ pha chế Kết quả cho thấy pH 7,2 đảm bảo sự ổn định của các PPIs trong quá trình phân tích, đồng thời các thông số sắc ký như số đĩa lý thuyết, hệ số phân giải và hệ số bất đối xứng đều đạt yêu cầu Quan trọng hơn, thời gian rửa cột được rút ngắn còn khoảng 1 giờ, giúp quy trình phân tích trở nên nhanh chóng, đơn giản và tiện lợi hơn.

Phương pháp sắc ký lựa chọn đảm bảo sự tách biệt hiệu quả, mang lại các tín hiệu sắc ký sắc nét và rõ ràng Độ đặc hiệu của phương pháp này đã được chứng minh có khả năng phát hiện chính xác các thành phần cần thiết.

Nghiên cứu đã tiến hành định lượng 64 ra đồng thời các PPIs trong mẫu huyết tương phức tạp Phương pháp này dựa trên việc so sánh các pic tương ứng cần định lượng trên sắc ký đồ giữa các mẫu đối chiếu/mẫu thử và mẫu trắng.

Đề tài đã thiết lập khoảng tuyến tính với 5 điểm, bao gồm cả giới hạn định lượng dưới (LLOQ), trong đó khoảng nồng độ tuyến tính được xác định từ 500 đến một giá trị tối đa.

Phương pháp phân tích với nồng độ 8000 ng/ml cho phép xác định nồng độ các mẫu thử trong khoảng thời gian 3 – 5 lần thời gian bán thải hoặc 1/10 – 1/20 giá trị Cmax của các PPIs, phù hợp với khuyến cáo của FDA Hệ số tương quan hồi quy giữa đáp ứng phân tích và nồng độ các PPIs trong huyết tương đạt r² > 0,999 Kết quả từ trắc nghiệm Fischer cho thấy tất cả các phương trình xây dựng trong nhóm PPIs đều tương thích, trong khi trắc nghiệm Student đã đánh giá ý nghĩa thống kê của hệ số gốc và tung độ gốc của từng phương trình (y = a.x + b).

Phương pháp xác định nồng độ các PPIs trong huyết tương đã được kiểm tra độ đúng và độ lặp lại bằng cách thêm chuẩn vào các mẫu huyết tương trắng, với ba lô mẫu có nồng độ khác nhau là 1000 ng/ml, 3000 ng/ml và 5000 ng/ml Kết quả cho thấy độ đúng trong ngày và giữa các ngày nằm trong giới hạn cho phép (85 – 115 %), trong khi độ lặp lại đạt yêu cầu RSD < 15 % (giá trị cao nhất là 10,87 %) Điều này chứng tỏ phương pháp có khả năng xác định chính xác và đáng tin cậy nồng độ các PPIs trong huyết tương, phù hợp với hướng dẫn của FDA và DĐVN V.

Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) cho bốn chất trong nhóm PPIs được xác định là nồng độ 500 ng/ml, đảm bảo độ đúng và độ chính xác theo quy định của FDA, dựa trên kết quả phân tích độ lệch chuẩn và độ dốc của đường tuyến tính.

Đề tài nghiên cứu đã khảo sát các phương pháp xử lý mẫu huyết tương, bao gồm tủa protein có kiềm hóa và chiết lỏng - lỏng Kết quả cho thấy cả hai phương pháp này đều đạt tỷ lệ thu hồi tương đương.

So sánh giá trị hiệu suất chiết của hai phương pháp chiết khác nhau cho thấy không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Phương pháp chiết lỏng - lỏng mặc dù hiệu quả nhưng phức tạp và sử dụng hóa chất độc hại, không thân thiện với môi trường Ngược lại, phương pháp tủa protein đơn giản và tiết kiệm, sử dụng methanol - huyết tương với tỷ lệ 1:4 Lượng mẫu cần thiết chỉ 400 µl huyết tương cho mỗi lần phân tích, giúp thuận lợi trong việc lấy mẫu và bảo quản Sau khi tủa protein, mẫu huyết tương được ly tâm, giảm thiểu ảnh hưởng đến chất phân tích, và cho phép ly tâm nhiều mẫu cùng lúc trong thời gian ngắn (15 phút) Do đó, phương pháp tủa protein bằng methanol có kiềm hóa được chọn để xử lý mẫu huyết tương.

Tiêu đề	Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời omeprazole, pantoprazole, rabeprazole và lansoprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – DAD)
Tác giả	Nguyễn Lê Vân Hà
Người hướng dẫn	DS. Dương Đình Chung
Trường học	Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành
Chuyên ngành	Quản lý và cung ứng thuốc
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học
Năm xuất bản	2018
Thành phố	TPHCM

Định dạng
Số trang	152
Dung lượng	7,23 MB