Khóa luận nghiên cứu định lượng atractylenolide III trong thân rễ bạch truật (atractylodes macrophala koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector DAD

T Ổ NG QUAN

Gi ớ i thi ệ u chung v ề cây bạ ch tru ậ t

Bạch truật có tên khoa học là Atractylodes macrocephala Koidz thuộc họ Cúc (Compossitae) [1]

1.1.2 Mô tả thực vật, bộ phận dùng Đặc điểm : Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ to, mọc dưới đất Thân thẳng, cao

Cây có chiều cao từ 0.3-0.8m, thường mọc đơn độc hoặc phân nhánh ở phần trên, trong khi phần dưới thân đã hóa gỗ Lá cây mọc cách, dài, với lá ở phần dưới có cuống dài và phần trên có cuống ngắn Gốc lá rộng, ôm lấy thân Phiến lá được xẻ sâu thành 3 thùy, trong đó thùy giữa lớn, hình trứng tròn với hai đầu nhọn, còn hai thùy bên nhỏ hơn, hình trứng mũi mác và phần gốc không đối xứng.

Các lá gần ngọn thân có phiến nguyên, hình thuôn hoặc hình trứng mũi mác với mép răng cưa Đầu lá lớn, phần dưới có lá bắc hình lá xẻ sâu, giống lông chim Bao hoa hình chuông, có lá bắc mỏng xếp thành 7 hàng, với lá bắc dưới nhỏ hình trứng tam giác và lớn dần ở phía trên Hoa nhiều, tràng hình ống, phần dưới màu trắng và phần trên màu đỏ tím, chia thành 5 thùy hình mũi mác xoắn ra ngoài Năm nhị hàn liền nhau, trong đó có nhị bị thoái hóa, chỉ nhị hình sợi dẹp Bầu hoa thon, mặt ngoài có lông nhung màu nâu nhạt, đoạn trên có lông hình lông chim, vòi hình chỉ màu tím nhạt với đầu nhị xẻ.

2 thùy nông hình đầu, mặt ngoài có lông ngắn Quả bế, thuôn, dẹp, màu xám [2]

Bộ phận dùng làm thuốc: Dùng thân rễ cứng chắc, có dầu thơm nhẹ, ruột màu trắng ngà [2,10]

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến

Bạch truật chủ yếu được trồng ở Trung Quốc, nhưng từ những năm 1970, cây này đã được di thực và hiện nay có mặt tại các tỉnh như Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội và Lâm Đồng.

Cây trồng bạch truật được thu hái từ cuối tháng 10 đến đầu tháng 11, thường vào khoảng từ ngày 8 đến 22 tháng 11 Để đảm bảo chất lượng, nên chọn ngày nắng ráo và đất khô khi thu hoạch Quá trình thu hoạch cần nhổ từng cây nhẹ nhàng, sau đó dùng dao cắt bỏ thân cây và mang củ về để chế biến.

C opyri ght @ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU

Bạch truật được chế biến bằng cách loại bỏ tạp chất, rửa sạch, ủ mềm, thái lát dày và làm khô Sau khi sơ chế, có thể tiến hành chế biến hai loại Bạch truật khác nhau.

Thổ Bạch truật được chế biến bằng cách lấy bạch truật phiến, sau đó sử dụng bột mịn phục long cán và sao cho đến khi bề mặt có màu đất Sau đó, rây bỏ phần đất thừa Tỉ lệ sử dụng là 100 kg bạch truật phiến với 20 kg bột mịn phục long cán.

Để thực hiện quy trình bạch truật sao, cần lấy cám mật chích cho vào nồi nóng Khi thấy khói bốc lên, cho bạch truật phiến vào sao cho đến khi có màu vàng sém và tỏa ra mùi thơm cháy Sau đó, lấy ra và rây bỏ cám mật chích Tỷ lệ sử dụng là 100 kg bạch truật phiến với 40 kg cám mật chích, và cám gạo cũng có thể được sử dụng thay thế cho cám mật chích.

The chemical composition of the Atractylodes plant has been identified to include 67 primary active compounds, categorized into several groups: sesquiterpenoids, triterpenoids, polyacetylenes, coumarins, phenylpropanoids, flavonoids, and flavonoid glycosides.

Ngoài ra, hai nhóm steroid và benzoquinones gồm có 4 hoạt chất chiếm tỉ lệ thấp hơn trong cây bạch truật [7]

Hình 1: Công thức hóa học một số chất chính trong cây Bạch truật.

Cải thiện chức năng đường tiêu hóa: Một nghiên cứu lâm sàng trên chuột cho thấy việc sử dụng cao bạch truật với liều lượng 0,035 g/kg và 0,105 g/kg giúp tăng trọng lượng chuột và cải thiện khả năng tiêu hóa của vi khuẩn đường ruột.

Nghiên cứu lâm sàng cho thấy, những người mắc ung thư sử dụng cao ethanol bạch truật với nồng độ 1 – 4 mg/ml trong 24 giờ đã giảm đáng kể số lượng tế bào ung thư.

Bạch truật có tác dụng điều hòa miễn dịch, được chứng minh qua các nghiên cứu cho thấy khi sử dụng bạch truật ở liều cao (1g/kg) cho heo con trong 30 ngày, có sự gia tăng tế bào lympho ngoại biên, chỉ số tăng trọng, nồng độ immunoglobulin G (IgG) trong huyết thanh, nồng độ IL-1 và IL-2, cùng với biểu hiện mRNA PR-39 Những kết quả này cho thấy bạch truật có khả năng cải thiện sự trao đổi chất và chức năng miễn dịch ở heo con.

Cao chiết bạch truật (100mg/kg) đã cho thấy tác dụng chống viêm rõ rệt trong nghiên cứu trên chuột bị viêm đại tràng cấp tính do dextran sulfate gây ra, khi làm giảm các yếu tố viêm như COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α và NF-κB.

B Ngoài ra, những nghiên cứu sử dụng polyacetylenes (25 – 300 mg/kg) trên chuột có hiện tượng viêm gây ra bởi acetic acid hoặc dimethyl benzene thì trong 3 − 5 ngày đã được tìm thấy đểức chếđáng kể phản ứng viêm [26,7] Điều trị bệnh Alzheimer và bảo vệ hệ thần kinh: Trong một mô hình thử nghiệm có sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol (0,5 – 2 mg/kg) được xây dựng để tăng cường trí nhớ, giảm tần suất sai lệch và giảm cholinesterase (AChE) Tác dụng của cao chiết bạch truật với ethanol có thể cải thiện tình trạng suy giảm trên chuột già Ngoài ra, phương phỏp điều trị 3 ngày với atractylenolide III (30 àg/ml) được xây dựng để cải thiện hoạt động của tế bào và ức chế apoptosis Những tác dụng này cho thấy rằng atractylenolide III có hoạt tính bảo vệ thần kinh quan trọng [4,7]

Cao bạch truật đã được chứng minh có tác dụng chống lão hóa và chống oxy hóa hiệu quả thông qua các nghiên cứu trên mô hình chuột.

Nghiên cứu tại Trường Y Dược, VNU cho thấy rằng chiết xuất bạch truật và D-galactose có tác dụng tích cực trong việc tăng cường hoạt động NO synthase (NOs), sản xuất nitric oxide (NO) và giảm lipid peroxide (LPO) trong mô não của chuột Sau 6 tuần điều trị polysaccharides (100−200 mg/kg), nồng độ MDA, lipofuscin và hoạt động monoamine oxidase (MAO) giảm, trong khi glutathione peroxidase (GSH-Px), CAT, SOD và tổng năng lượng chống oxy hóa (T-AOC) tăng lên Ngoài ra, chiết xuất methanol bạch truật với liều cao (0,5−0,8 g/kg) đã cải thiện chu kỳ động dục và mức hormone FSH, đồng thời giảm testosterone toàn phần và chỉ số androgen tự do, cho thấy khả năng điều chỉnh nội tiết và giảm huyết áp Hơn nữa, chiết xuất bạch truật (100-300 mg/kg) cũng giúp giảm trọng lượng cơ thể, nồng độ lipid gan và cholesterol trong huyết thanh ở chuột béo phì, đồng thời tăng nồng độ insulin và cải thiện dung nạp glucose Chiết xuất này còn làm tăng giải phóng glucose và biểu hiện PGC1α cũng như palmitoyltransferase 1b trong tế bào C2C12, đồng thời giảm hàm lượng axit béo tự do, cho thấy tiềm năng trong việc ngăn ngừa béo phì.

T ổ ng quan v ề v ị thu ố c B ạ ch thu ậ t

Tính vị quy kinh : Khổ, cam, ôn Vào kinh Tỳ và Vị [1]

Kiện tỳ, ích khí, táo thấp, lợi thủy, cố biểu, liễm hãn, an thai.

Chủ trị: Tiêu hóa kém, bụng trướng, tiêu chảy, phù thũng, tự hãn, động thai

Cách dùng: Ngày dùng từ 6–12g, dạng thuốc sắc hoặc bột Bạch truật sao cám, tẩm mật ong tăng tác dụng kiện tỳ, sao cháy có tác dụng chỉ huyết [1]

Kiêng kỵ: Đau bụng do âm hư nhiệt trướng, đại tiện táo, háo khát không dùng [1].

Vài nét về ho ạ t ch ấ t Atractylenolide III

Hình 2: Công thức cấu tạo của Atractylenolide III

Atractylenolide III có công thức phân tửlà C 15 H 20 O 3

Danh pháp IUPAC: (4 S,8 R,9 S)-9 -hydroxy-3,8 -dimethyl-5-methylidene 4,4 ,6,7,8,9-hexahydrobenzo(1)benzofuran-2-one

- Atractylenolide III là dạng bột màu trắng hoặc tinh thểmàu trắng

- Atractylenolide III tan tốt trong nước, methanol, ethanol, và một số dung môi hữu cơ khác.

- Atractylenolide III cho phổ hấp thụ cực đại ở 220nm [27]

Atractylenolide III là một hoạt chất có nhiều tác dụng dược lý quan trọng, bao gồm bảo vệ thần kinh và dạ dày, chống ung thư, và chống viêm Ngoài ra, Atractylenolide III còn có khả năng điều chỉnh chức năng miễn dịch thông qua việc kiểm soát tế bào IL-6 trong tế bào mast.

Các nghiên cứ u định lượ ng Atractyl enolide III trong cây bạ ch tru ậ t

Nghiên cứu của nhóm tác giả Hao Cai và các đồng nghiệp vào năm 2012 đã định lượng hai hoạt chất trong Bạch truật, cụ thể là Atractynolid I và Atractynolid III, sử dụng bước sóng cực đại 220nm Phương pháp phân tích được thực hiện trên máy Agilent Zorbax Eclipse XDB với cột C-18 kích thước 250 mm x 4.6 mm và kích thước hạt 5 μm, với tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl và nhiệt độ cột được duy trì ở 25 độ C.

Hệ được sử dụng trong nghiên cứu này là ACN (A) và nước (B) với tỉ lệ 0-10 phút

Nghiên cứu lựa chọn phương pháp xửlý mẫu với Ethanol 80%, chiết siêu âm trong

30 phút , sau đó lọc để thu được dịch chiết [7,13]

Theo dược điển Hong Kong, hoạt chất Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật được định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng, với điều kiện bước sóng hấp thụ tối đa 220nm, sử dụng cột silicagen liên kết ODS (5µm, 250 x 4,6mm) và tốc độ dòng 1ml/phút Hệ dung môi gồm Methanol và Nước theo tỷ lệ 70:30, thực hiện trong 25 phút Mẫu được xử lý bằng phương pháp siêu âm với 2g bột dược liệu trong 50ml dung môi Ethanol 70%, cho phép chiết xuất nhiều lần với thời gian phù hợp với mục đích nghiên cứu.

ĐỐI TƯỢ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Đối tượng nghiên cứ u

Mẫu nghiên cứu được lấy từ thân rễ khô của Bạch truật (Atractylodes macrophala Koidz), thuộc họ Compossitae Nguồn gốc mẫu này đến từ Hà Nội, Việt Nam và Liêu Ninh, Trung Quốc, do Viện Dược Liệu cung cấp.

Trang thi ế t b ị , dung môi, hóa chấ t

Hóa chất thuốc thửđược cung cấp bởi nhà sản xuất có uy tín với độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng

Bảng 1: Hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu.

Nguyên vật liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

Atractylenolide III Trung Quốc Độ tinh khiết 98%

Thiết bịmáy móc được sử dụng đảm bảo chính xác và độ tin cậy theo thông tin như nhà sản xuất

Bảng 2: Trang thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ

1 Shimadzu LC – 20AD Nhật Bản

4 Shimadzu CTO – 10AS Nhật Bản

6 Máy siêu âm MRC Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sátđiều kiện sắc ký

Chúng tôi thực hiện sắc ký sử dụng cột Supleco C18 (5μm, 250 x 4,6mm) với tốc độ dòng 1ml/phút và thể tích tiêm mẫu 20μl để khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại và hệ dung môi pha động.

- Khảo sát bước sóng: Tiến hành sắc ký với chất chuẩn Atractylenolide III bằng phương HPLC-DAD đểtìm ra bước sóng hấp thụ cực đại của chất

- Khảo sát hệ dung môi pha động: Phương pháp khảo sát với các hệ dung môi ACN:Nước và Methanol:Nước

- Dung dịch gốc: Cân chính xác khoảng 1mg chất chuẩn Atractylennolide III trong 1ml Methanol trong bình định mức 1ml

- Tiến hành pha dãy chuẩn trong bình định mức 1ml với các nồng độ 104; 52;

32,5; 26; 19,5; 13; 6,5; 3,25; 1,675; 0,65 và 0,065àg/ml từ dung dịch mẹ

Để xử lý mẫu, cân khoảng 0.2g bột dược liệu và chiết với 5ml dung môi gồm Nước, Methanol, và Ethanol với các nồng độ 30%, 50%, 70%, 90%, và 96% bằng phương pháp siêu âm Sau đó, định mức dung dịch vào bình định mức 5ml bằng dung môi Cuối cùng, lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi tiến hành phân tích định lượng.

2.3.3 Thẩm định quy trình phân tích

Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp”

(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005, các yếu tố của

Quy trình phân tích định lượng cần được thẩm định bao gồm các yếu tố như độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.

Khả năng phát hiện chất phân tích trong sự hiện diện của các tạp chất như tiền chất, chất chuyển hóa và chất tương tự là rất quan trọng Trong phân tích định lượng, điều này đồng nghĩa với việc xác định chính xác chất phân tích trong mẫu, bất chấp ảnh hưởng của các yếu tố khác, nhằm đạt được kết quả chính xác nhất.

Phương pháp xác định bằng cách thêm chuẩn sau khi chuẩn bị mẫu thường được áp dụng trong các phương pháp sắc ký Sau khi mẫu thử được phân tích trên thiết bị sắc ký và thu được các pic sắc ký, chuẩn sẽ được thêm vào mẫu đã chiết xuất để tiến hành phân tích Việc so sánh sắc ký đồ giữa hai mẫu giúp đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp.

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, pic mẫu thử phải trùng với vịtrí của pic chất chuẩn và sắc ký đồ của chất nền không có pic nào

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD) trong quy trình phân tích là lượng tối thiểu của chất phân tích có thể được phát hiện trong mẫu thử mà không cần xác định chính xác hàm lượng của nó.

Giới hạn định lượng (LOQ) trong quy trình phân tích là lượng tối thiểu của chất phân tích có thể được định lượng trong mẫu thử với độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu.

Phương pháp xác định nồng độ dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) cho thấy LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị từ 2 đến 3, trong khi LOQ là nồng độ mà tỷ lệ S/N gần bằng 10 Độ tuyến tính cũng là một yếu tố quan trọng trong quá trình xác định này.

Tính tuyến tính của quy trình phân tích đề cập đến khả năng suy luận kết quả từ phương pháp dựa vào mối quan hệ giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được, chẳng hạn như chiều cao hoặc diện tích pic (y), và nồng độ (x).

Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương quan tuyến tính R 2

- Khảo sát ởít nhất 5 hoặc 6 mức nồng độkhác nhau

- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp

- Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu

Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ R 2 ≤ 1 Độthích hợp hệ thống

Đánh giá độ thích hợp của hệ thống là quá trình xác định xem hệ thống có đủ điều kiện để thực hiện phân tích hay không Điều này bao gồm việc thực hiện các phép thử nhằm chứng minh rằng hệ thống hoạt động đúng với mục đích sử dụng đã đề ra.

Phương pháp xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong hệ thống sắc ký bao gồm việc tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần Cần thực hiện ít nhất 5 lần bơm để đảm bảo RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD vượt quá 2%, cần tăng số điểm tiêm lên 6 để đạt độ chính xác cao hơn.

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu ≤ 2% Độ lặp lại

Khái niệm: Độ lặp lại là sự ổn định trong phương pháp phân tích định lượng mẫu trong quá trình thực hiện

Trong phân tích hàng ngày, cần thực hiện ít nhất hai lần để giảm thiểu sai số ngẫu nhiên Đánh giá sự chênh lệch giữa hai lần thực hiện với giá trị trung bình, và sự chênh lệch này phải đáp ứng yêu cầu của từng phương pháp.

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2% Độđúng

Độ đúng của phương pháp đề cập đến mức độ gần gũi giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được công nhận là chính xác.

Phương pháp xác định bao gồm việc thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, sau đó phân tích các mẫu đã thêm chất chuẩn Quá trình này cần được lặp lại ít nhất bốn lần bằng phương pháp khảo sát, và độ thu hồi được tính toán theo công thức đã quy định.

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại

Yêu cầu: Độ thu hồi đạt 98 - 102% và RSD ≤ 2%

2.3.4 Phương pháp xửlý và đánh giá kết quả

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê với chương trình

Excel sử dụng diện tích và thời gian lưu trên đỉnh để xác định giá trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Công thức được áp dụng để xử lý kết quả này.

- là giá trịtrung bình của các phép thử, được tính bằng công thức:

- SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng Trong đó SD được tính theo công thức:

K Ế T QU Ả

Xây dựng phương pháp định lượ ng Atractylenolide III

Khảo sát được thực hiện với mẫu chuẩn Atractylenolide III ở nồng độ 6.5 µg/ml, sử dụng cột Supleco C18 với tốc độ dòng 1 ml/phút Phương pháp sắc ký gradient với dung môi ACN từ 20% đến 80% trong 60 phút đã cho kết quả như hình 3.

Hình 3: Sắc ký đồ HPLC và bước sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III trong đó: A – sắc ký đồ chất chuẩn ởbước sóng 1- 254nm và 2- bước sóng 220nm;

B –Bước sóng hấp thụ cực đại

Kết quả cho thấy mẫu hấp thụ cực đại tại bước sóng 220nm Qua phân tích sắc ký, chất chuẩn Atractylenolide III được sử dụng đạt tiêu chuẩn của nhà sản xuất với độ tinh khiết 98%.

3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD

Chuẩn bị một mẫu thử bằng phương pháp xử lý mẫu với dung môi Ethanol 96% Tiến hành sắc ký khảo sát pha động với cột pha đảo Supleco C18, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl, nhiệt độ phòng 25°C và chế độ chạy đẳng dòng Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.

Bảng 3: Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động với các chương trình chạy đẳng dòng bằng HPLC-DAD, bước sóng phát hiện là 220nm.

Hệdung môi Sắc ký đồ

0-30 43 tR= 23,356 t R (phút): Thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích Atractylenolide III

Dataf ile Name:Et-AMTQ.2.lcd

Dataf ile Name:EtOH-AM-ACN-20-80.lcd

Datafi l e Name:n-hexan-AM-ACN gradi ent 45-50.lcd

Dataf ile Name:Et-AM-43ACN.5.lcd

Kết quả nghiên cứu cho thấy hệ dung môi tối ưu là ACN và nước với tỷ lệ 43:57, mang lại sắc ký đồ tốt nhất Hệ này cho phép phân tách rõ ràng các pic mà không gặp hiện tượng kéo đuôi, đồng thời thời gian lưu đủ dài để rửa giải mà không làm pic bị chồng lên nhau.

3.1.3 Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu

Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung môi Nước, Ethanol 30%, 50%,

Kết quả từ phương pháp siêu âm cho thấy việc xử lý mẫu bằng dung môi Ethanol 96% mang lại hiệu quả tốt nhất, so với các dung môi khác như Methanol và n-hexane.

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung dịch Ethanol 96% chiết bằng phương pháp siêu âm 3 lần trong 3 giờ Kết quảthu được dưới bảng 4

Bảng 4: Kết quả diện tích pic của các lần chiết mẫu bạch với Ethanol 96% khi phân tích bằng HPLC-DAD

Kết quả: Sau 2 lần chiết, hàm lượng dược chất trong dược liệu đã hết hoàn toàn.

Lần chiết thứ 2, diện tich pic bằng 1/10 diện tích pic chiết lần 1

Nhận xét: Từ kết quảtrên, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết sau âm mẫu Bạch truật 1 lần trong 1 giờ

3.1.4 Điều kiện chạy sắc ký HPLC

Dựa vào các nghiên cứu trên, chúng tôi đã xác định được điều kiện chạy sắc ký như sau:

- Cột pha đảo Supleco C18 (5àm, 250 x 46mm)

- Pha động là đẳng dòng với hệ dung môi ACN và Nước (43:57) trong 30 phút

Các thông số của peak được trình bày trong bảng 5

Bảng 5: Các thông số HPLC đánh giá đối với Atractylenolide III

STT Thông sốđánh giá Giá trị

2 Diện tích pic (ứng với dung dịch chuẩn có nồng độ 26àg/ml)

Th ẩm định phương pháp phân tích

Phân tích bốn mẫu bao gồm dung dịch Atractylenolid III chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn và dung dịch mẫu trắng đã được thực hiện theo điều kiện phân tích HPLC đã nêu Kết quả đánh giá được thể hiện qua sắc ký đồ tương ứng như trong hình 4.

Hình 4: Sắc ký đồ HPLC đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trong đó: 1-

Mẫu trắng; 2- Mẫu thử; 3-Mẫu thửthêm chuẩn; 4- Mẫu chuẩn

Kết quả và nhận xét: Trên sắc ký đồ thu được cho thấy, thời gian lưu của 3 mẫu

Atractylenolid III ở mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn là tương ứng với nhau và trên mẫu trắng không có Pic Atractylenolid III không bị trùng với các pic khác.Phương pháp đã được xây dựng phù hợp với chất Atractylenolide III cần phân tích.

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Chúng tôi thực hiện chạy nền theo các điều kiện đã thiết lập Dựa vào diện tích pic của chất nền, chúng tôi pha loãng dung dịch chuẩn cho đến khi tỉ số S/N đạt 2-3 Nếu S/N không nằm trong khoảng này, chúng tôi sẽ tiếp tục pha loãng thêm một lần nữa Giá trị S/N cuối cùng sẽ được xác định là giới hạn phát hiện LOD, từ đó suy ra giới hạn định lượng LOQ.

Tại nồng độ 0,065 àg/ml, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) đạt 5, cho thấy khả năng phát hiện tốt Dựa vào tỷ lệ S/N = 3, chúng tôi xác định giá trị giới hạn phát hiện (LOD) là 0,039 àg/ml Kết quả thu được cho thấy độ nhạy cao trong phân tích.

- Giới hạn phỏt hiện (LOD): 0,039 (àg/ml)

- Giới hạn định lượng (LOQ): 0,117 (àg/ml)

Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn Atractylenolide III có nồng độ từ

Nồng độ Atractylenolide dao động từ 104 àg/ml đến 1,625 àg/ml, phù hợp với các điều kiện đã được thiết lập Kết quả khảo sát cho thấy mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của dung dịch Atractylenolide được trình bày trong bảng 6.

Hình 5: Sắc ký đồ HPLC của Atractylenolide III với nồng độ lần lượt là

0,065àg/ml và 0,65àg/ml.

Bảng 6: Kết quả độ tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng Atractylenolide

III với dãy nồng độ chuẩn

Nồng độ ( à g/ml) Diện tớch pic (mAU.s) Nồng độtớnh lại từđường chuẩn ( à g/ml)

Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu chuẩn Atractylenolide III

Kết quả cho thấy hệ số tương quan R² đạt 0,9987, chứng tỏ đường chuẩn có độ tuyến tính cao, đảm bảo tính chính xác trong phân tích định lượng Atractylenolide III.

3.2.4 Tính thích hợp của hệ thống

Hệ thống sắc ký tiêm được kiểm tra tính thích hợp thông qua 5 lần phân tích mẫu chuẩn Atractylenolide III với nồng độ 26 àg/ml Kết quả đánh giá dựa trên giá trị độ lệch tương đối RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 5 lần lặp lại Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 7.

Bảng 7: Kết quảđánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng

Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26àg/ml

STT Diện tích pic ( mAU.s) Thời gian lưu ( phút )

Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2%, chứng tỏ tính thích hợp của phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu.

3.2.5 Độ lặp lại Độ lặp lại được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên Độ lặp lại được đánh giá thông qua chỉ sô độ chệch tương đối (RSD) của hàm lượng dược chất trong dược liệu 2% Kết quảthu được trình bày trong bảng 8

Bảng 8: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng Atractylenolide

III với mẫu bạch truật chiết với Ethanol 96%

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5

Kết quả và nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 2% cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại cao

3.2.6 Độđúng Độ đúng được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên Độ đúng được đánh giá qua độ thu đồ dược chất cần phân tích Atractylenolide III là 98-102% theo quy định của ICH và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 3 lần lặp lại mẫu đánh giá độ thu hồi  2% Kết quả được trình bày dưới bảng 9

Bảng 9: Kết quảđánh giá độ thu hồi của phương phápđịnh lượng trong mẫu thử thêm chuẩn Atractylenolide III

N ồng độ dượ c ch ấ t thu h ồ i Độ thu h ồ i RSD

Kết quả và nhận xét: Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng

Atractylenolide III trong dược liệu bạch truật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đạt trong khoảng 98-102%, chứng tỏ phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao.

Ứ ng d ụng phương pháp xác định hàm lượng dượ c ch ấ t trong c ủ B ạ ch tru ậ t

Phân tích hàm lượng Atractylenolide III trên 3 mẫu dược liệu Việt Nam và Trung

Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 10, cho thấy sự so sánh sắc ký đồ giữa hai mẫu bạch truật Việt Nam và Trung Quốc như thể hiện trong hình 8.

Bảng 10: Kết quảxác định hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu bạch truật Việt

Mẫu Tên Mẫu Hàm lượng Atractylenolide III(%)

Hình 7: Sắc ký đồphân tích Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật bằng HPLC-

DAD trong đó A- Bạch truật Việt Nam, B- Bạch truật Trung Quốc

Hình 8: Phổ hấp thụ UV của thành phần khác trong mẫu bạch truật Việt Nam

Nhận xét: Dựa vào kết quả cho thấy trong bạch truật trồng tại Việt Nam và Trung

Hàm lượng Atractynolide III trong Quốc lần lượt là 0,06% và 0,08% So sánh phổ đồ cho thấy bạch truật Việt Nam có một số pic khác, điều này chỉ ra rằng cần có thêm nghiên cứu về thành phần hóa học của bạch truật Việt Nam Sự khác biệt này cũng giải thích lý do tại sao việc áp dụng điều kiện chạy dược điển Hồng Kông không thành công trên mẫu dược liệu Việt Nam.

BÀN LUẬ N

Nghiên cứu này xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Atractylenolide III trong thân rễ cây bạch truật Điều kiện pha động HPLC-DAD được thiết lập với tỷ lệ MeOH : H2O là 43:57 Độ chính xác của phương pháp đạt yêu cầu theo hướng dẫn của ICH.

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng Atractynolide III trong mẫu bạch truật trồng tại Việt Nam thấp hơn so với mẫu từ Trung Quốc Tuy nhiên, do kích thước mẫu thu thập còn hạn chế, cần thực hiện nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để xác định chắc chắn sự khác biệt này Dù vậy, giá trị thu được vẫn cao hơn nhiều lần so với tiêu chuẩn của dược điển Hồng Kông, là 0,019%, cho thấy bạch truật Việt Nam đủ điều kiện để thâm nhập vào thị trường dược liệu Hồng Kông, mở ra cơ hội giao thương với Trung Quốc và nhiều quốc gia khác trên thế giới.

Hai phổ đồ thu được cho thấy sự khác biệt rõ rệt về peak phụ, điều này phản ánh tiềm năng sinh học và thành phần hóa học của cây trồng tại Việt Nam vẫn chưa được khám phá đầy đủ Sự khác biệt này cũng gây khó khăn trong việc áp dụng dược điển Hồng Kông cho phân tích mẫu Bạch truật tại Việt Nam Phương pháp phân tích mới được xây dựng có thể áp dụng hiệu quả cho các dược liệu có nguồn gốc từ Trung Quốc.

Chúng tôi khuyến nghị tiếp tục nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của bạch truật tại Việt Nam Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tăng cường số lượng mẫu để xác định giới hạn hàm lượng Atractynolide III trong tiêu chuẩn cơ sở của bạch truật trồng tại Việt Nam.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Điều kiện phân tích HPLC của Atractynolide III trên mẫu bạch truật như sau:

- Cột sắc ký pha đảo: Supleco C-18(5àm, 250 x 4,6mm)

- Bước sóng cực đại: 220 nm

- Thời gian sắc ký: 30 phút

Bạch truật thu hái tại Việt Nam chứa hàm lượng Atractynolide III là 0,06%, trong khi đó ở Trung Quốc là 0,08% Phổ đồ của Bạch truật Việt Nam cho thấy sự khác biệt với Trung Quốc, đặc biệt là ở peak phụ.

[1] Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam Bạch truật IV, Nhà xuất bản Y học, pp

[2] Bộ Khoa học và công nghệ (2007), Thực vật chí Việt Nam họ Cúc tập 7, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, pp 523 – 524

[3] Trường Thụ Sinh (2012) , Trung Dươc Lâm Sàng, Nhà xuất bản Y học, pp 314 – 316

[4] Viện Dược Liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam Bạch truật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật liệu, pp 360 – 382

[5] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, pp.10-59

[6] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4)

[7] Bo Zhu (2018), “The traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of

Atractylodes macrocephala Koidz”, Journal of ethnopharmacology

[8] Brian A Bidlingmeyer (1992), Practical HPLC Methodology and Applications, Wiley Series in Engineering and Technology Management, pp 67 – 103

[9] Danilo Corradini (2016), Handbook of HPLC second edition, Chromatographic science series, pp 207 – 232

[10] Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), Pharmacopoeia of the peoples republic of China – English Edition(2015), Chemical Industry Press, pp 524 –

[11] Elsevier Science (2017), “Application of Atractylodes Macrocephala Koidz Extract in Methicillin - Resistant Staphylococcus Aureus”, Procedia engineering, 174, pp 410 -415

[12] George Lunn, Norman R Schmuff (2000) - HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis, Wiley-Blackwell, pp 232 – 250

A study by Hao Kai in 2012 examined the chemical fingerprinting of both crude and processed Atractylodes macrocephala sourced from various locations in Zhejiang province Utilizing reversed-phase high-performance liquid chromatography in conjunction with hierarchical cluster analysis, the research aimed to identify distinct chemical profiles of the plant The findings contribute to the understanding of the phytochemical diversity of Atractylodes macrocephala, offering insights for its application in pharmacognosy.

[14] Hildebert Wagner, Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal

Medicines: Thin-layer and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs, Springer Science & Business Media, pp 113 - 123

[15] Hson-Mou Chang(1986), Pharmacology and Applications of Chinese Materia

[16] Kokane Vikrant (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and

[17] Jiaju Zhou (2003), Traditional Chinese Medicines: Molecular Structures,

Natural Sources and Applications, Wiley, pp 235 - 242

[18] Joel K Swadesh (2000), HPLC: Practical and Industrial Applications, Second

[19] Lena Ohannesian (2001), Handbook of Pharmaceutical Analysis, CRC Press, pp 9 – 12

[20] Monika Waksmundzka-Ha nos, Joseph Sherma (2010), High Performance Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis, CRC Express, pp 3 – 12

[21] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7), pp 1515-1609.

Định dạng
Số trang	37
Dung lượng	574,36 KB