TỔ NG QUAN
T Ổ NG QUAN V Ề CÂY BÁ B Ệ NH
Theo phân loại thực vật học thì bá bệnh thuộc:
Bá bệnh, scientifically known as Eurycoma longifolia Jack., belongs to the Simaroubaceae family and is commonly referred to by various names including Tongkat Ali in Malaysia, Antong sar in Cambodia, Tho nan in Laos, and Pasak Bumi or Bedara Pahit in Indonesia.
Hình 1.1 Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.)
[http://thaoduocquy.org/cay-mat-nhan-ba-benh]
Cây nhỡ có chiều cao từ 2-8 m, có thể đạt tối đa 15-18 m, thường ít phân cành và có lông ở nhiều bộ phận Lá của cây là dạng lá kép hình lông chim lẻ, mọc so le với 21-25 lá chét không cuống, có hình dạng đối, thường hình mác hoặc bầu dục Phần gốc lá thuôn, đầu lá nhọn, mặt trên lá có màu xanh sẫm bóng, trong khi mặt dưới có lông màu trắng xám và cuống lá có màu nâu đỏ Lá non có lông mịn, trong khi lá trưởng thành thì khác biệt.
V NU là một loại cây không có lông, với cụm hoa mọc ở ngọn thành chùm kép hoặc chùy rộng Cuống hoa có lông màu gỉ sắt và hoa có màu đỏ nâu Đài hoa được chia thành năm thùy hình tam giác có tuyến ở lưng, trong khi tràng hoa năm cánh hình thoi cũng có tuyến Nhị có lông dày và hai vảy ở gốc, đầu nhụy rời Chỉ nhịmàu đỏ và có lông, hoa và bao hoa phủ đầy lông Nụ hoa nhỏ, hình trứng, và quả hạch có hình trứng, nhẵn, với rạch dọc, khi chín có màu vàng đỏ và chứa một hạt Hạt có nhiều lông ngắn, trong khi quả non màu xanh có lông sét nâu Quả già chuyển màu hồng nhạt, thịt quả mềm, ngọt và ăn được, và khi chín, quả có màu đỏ tươi chuyển sang đỏ nâu, trơn nhẵn.
1.1.2 Phân bố và sinh thái
Bá bệnh là loài cây phổ biến ở các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia và Indonesia, cũng như tại Nam Trung Quốc và Ấn Độ Tại Việt Nam, cây thường mọc hoang ở miền Trung và Tây Nguyên, thường xuất hiện trong các rừng thưa dưới tán cây gỗ lớn Loài cây này có khả năng chịu đựng điều kiện khắc nghiệt, thường phát triển trong những cánh rừng nguyên sinh và rừng thú sinh Cây bá bệnh mọc ở vùng đồi thường có chiều cao khiêm tốn, trong khi những cây phát triển dưới tán rừng có thể cao hơn 5-7 mét.
Bá bệnh là một loại cây quý hiếm, mặc dù số lượng cây con tái sinh từ hạt không nhiều do quả thường bị cuốn trôi trong mùa mưa lũ Tuy nhiên, khả năng tái sinh của nó vẫn cao, vì dễ dàng bắt gặp các chồi mới sau khi cây bị chặt phá Do đó, việc bảo tồn và phát triển bá bệnh là rất cần thiết.
Cây thuốc có thể sử dụng toàn bộ, nhưng phần rễ trụ từ 5 tuổi trở lên là chủ yếu Rễ càng đắng thì giá trị càng cao Sau khi thu hoạch, rễ được rửa sạch, thái lát và phơi khô, tạo ra dạng gỗ màu vàng ngà với vị đắng đặc trưng.
- Trong vỏ và gỗ bá bệnh, người ta đã chiết được một số hợp chất sau [1]:
Các hợp chất quassinoid, có khoảng 150 loại:
Từ rễđã phân lập đƣợc 3 quassinoid:
Các hợp chất triterpen: niloticin, dihydroniloticin, piscidinol A, melianon…
Các alkaloid loại canthin-6-on đƣợc phân lập từ vỏ và gỗ:
Ngoài ra còn có alkaloid carbolin
Vỏ cây bách bệnh ở miền Đông Nam Bộ Việt Nam chứa hai thành phần chính là eurycomalacton và 2,6 dimethoxybenzoquinon, trong đó eurycomalacton chiếm tỷ lệ cao nhất Ngoài ra, vỏ cây này còn có campestrol và β-sitosterol.
- Trong rễ và lá cây bá bệnh đã xác định đƣợc một số hợp chất sau [37] ảng 1.1 Thành phần hóa học trong rễ và lá cây bá bệnh
Bộ phận Dung môi chiết
Eurycolactones A-E,eurycomalides A-B, eurycomalactone, 6α - hydroxyeurycomalactone, 7α - Hydroxyeurycomalactone, eurycomanone, 13α(21)-epoxyeurycomanone,
12,15diacetyl-13α(21)-epoxyeurycomanone, 12-acetyl-13,21dihydroeurycomanone, 15-acetyl13α(21)-epoxyeurycomanone, 3,4εdihydroeurycomanone,
- Triterpenes: eurylene, hỗn hợp β-sitosterol và stigmasterol
Lá Ethanol Quassinoids: lonilactone, 6-dehydro lonilactone,11- dehydroklaineanone…
Một số tác dụng dƣợc lý của bá bệnh đã đƣợc nghiên cứu và chứng minh nhƣ sau:
Cao chiết từ bá bệnh có tác dụng kháng kí sinh trùng sốt rét trên thí nghiệm nuôi cấy in vitro [1,2,11,21,28,32]
Nghiên cứu trên in vitro và in vivo cho thấy dịch chiết rễ bá bệnh có khả năng chống ung thƣ dòng tế bào K-562 [16]
Cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên của cây Bá bệnh có khả năng ức chế quá trình sản xuất cytokine gây viêm IL-6, được kích thích bởi LPS (1 µg/ml) trong dòng tế bào người THP-1.
Bá bệnh có tác dụng kích thích sinh dục nam và tăng cường nội tiết tố sinh dục nam trong huyết tương Nghiên cứu cho thấy, cả thân và rễ bá bệnh đều làm tăng lượng testosterone, trong đó rễ bá bệnh có hiệu quả cao hơn so với thân cây.
Bá bệnh còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus [20,22,32]
Chế phẩm thuốc bao gồm ba dược liệu: bá bệnh, trâm bầu và xấu hổ, có độc tính cao nhưng độc tính trường diễn rất thấp Thuốc này thể hiện tác dụng lợi mật rõ rệt mà không làm thay đổi thành phần mật ở chuột lang, đồng thời tăng thải trừ BSP của gan thỏ so với đối chứng Ngoài ra, chế phẩm còn làm chậm quá trình hư biến của gan chuột cống trắng do carbon tetreclorid gây ra và tăng cường tái tạo tế bào gan chuột nhắt trắng trong mô hình gây thương tổn gan thực nghiệm.
Chế phẩm từ bá bệnh, trâm bầu và xấu hổ được áp dụng cho bệnh nhân có chỉ định điều trị lợi mật đã chứng minh hiệu quả trong việc giảm bilirubin máu một cách có ý nghĩa.
Một số quassinoid nhƣ eurycomanol, eurycomalactone có tác dụng làm giảm lipopolysaccharide gây ra sốt ở chuột sau 1 giờ và có khả năng mạnh hơn aspirin.
Nghiên cứu in vitro và in vivo đều chứng minh bá bệnh có tác dụng chống ung thư tiền liệt tuyến ở người [13]
Dịch chiết nước từ rễ cây mật nhân có khả năng kháng oxi hoá nhưng hoạt lực tương đối yếu [9,12,22]
Trên cơ địa động vật, rễ bách bệnh có tác dụng làm tăng hàm lượng testosterone trong huyết, gia tăng trọng lượng cơ quan sinh dục đực, đặc biệt rõ rệt ở liều cao trên động vật bình thường Nghiên cứu trên hai mô hình chuột cho thấy hàm lượng protein toàn phần trong huyết tương tăng, có xu hướng làm tăng trọng lượng cơ nâng hậu môn mà không làm tăng thể trọng cơ thể Tác dụng tăng cường chức năng sinh dục nam giới là tác dụng chính, được nghiên cứu và sử dụng phổ biến, với hơn 200 công trình nghiên cứu về tác dụng này trong khoảng thời gian từ 1994 đến 2014.
Ở Lào, bá bệnh đƣợc dùng để chữa bệnh cao huyết áp, dùng cho phụ nữ sau sinh [23]
Shuid và cộng sự (2011) nghiên cứu trên mô hình chuột 12 tháng tuổi đã gây loãng xương Thực hiện đồng thời 2 nhóm Một nhóm cho uống
Eurycoma longifolia và testosterone đều cho thấy hiệu quả trong việc ngăn chặn mất canxi ở chuột sau 6 tuần sử dụng Do đó, loại thảo dược này có tiềm năng trong việc điều trị loãng xương ở những người bị thiếu hụt androgen.
Năm 2006, nghiên cứu của Đại học Dược Hà Nội về tác dụng dược lý của cây bá bệnh đã được thực hiện bởi Dương Thị Ly Hương, Trịnh Thị Kim Anh và Nguyễn Thị Hải Hà Nghiên cứu này tập trung vào hoạt tính androgen trên chuột cống trắng với dịch chiết nước từ rễ cây bá bệnh Kết quả cho thấy, khi sử dụng liều 10 mg/kg thể trọng, trọng lượng các cơ quan sinh dục, bao gồm tinh hoàn và túi tinh, đều có sự gia tăng đáng kể.
Theo y học cổ truyền, bá bệnh có tính mát và vị đắng, giúp thanh nhiệt, tiêu viêm, lợi thấp và lợi tiểu Nó có tác dụng lương huyết, chỉ lỵ, thường được sử dụng để chữa các triệu chứng như tiểu tiện ra máu, khó tiêu, đầy hơi và chướng bụng.
T ổ ng quan v ề nhóm quassinoid
Quassinoid là một loại triterpenoid thứ cấp, giàu oxy và có vị đắng, thuộc họ Thanh thất Simaroubaceae, được biết đến với tên gọi Quassin Nghiên cứu cho thấy quassinoid chứa nhiều tiềm năng trong điều trị các bệnh như kháng khối u, kháng virus, kháng viêm, kháng amip, sốt rét, kháng vi trùng lao và hỗ trợ điều trị chán ăn.
Nghiên cứu cho thấy nhiều quassinoid có khả năng gây độc tế bào ung thư phổi và ung thư cổ tử cung, đồng thời cũng có tác dụng bảo vệ dạ dày.
1.2.2 Cấu trúc chung và phân loại Đến nay đã có khoảng 150 chất thuộc nhóm quassinoid đƣợc chiết xuất, phân lập và mô tả cấu trúc Có thể chia thành 5 khung chính nhƣ sau 18-, C19-, C20-, C22- và C25-quassinoid Có một số tác giả còn gọi tên các khung là khung laurycolactan (C18), khung cedrolidan (C19), khung quassolidan (C20), khung quassinoid) Trong đó, thườ ấ
V NU nhóm chức chứa oxy nhƣ ceton, ester, lacton, hydroxy, methoxy Nhóm 20 thấy nhiều nhất với 76% nhóm chức chứa oxy Nhóm C19 chiếm 19%, C18 chiếm 3%, còn C22 và C25 chiếm rất ít, khoảng 1% [24]
Hình 1.2 Cấu trúc chung nhóm quasinoid
T ổ ng quan v ề eurycomanone
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của eurycomanone
Vị trí: eurycomanone thuộc C20-quassinoid
Tên khoa học: (1 β, 11 β, 12 α, 15 β) -1,11,12,14,15-pentahydroxy-11,20- epoxypicrasa-3,13 (21)-diene-2,16-dion
Eurycomanone là chất rắn, màu trắng, không mùi, điểm cháy -20 ◦ , điểm nóng chảy 251-253 o C [42] Tỉ trọng 1,6 g/cm 3
1.3.3 Tác dụng sinh học của Eurycomanone
Eurycomanone là thành phần có hoạt tính góp phần vào tác dụng sinh học của bá bệnh
Eurycomanone, một quassinoid chính trong rễ cây mật nhân, có khả năng tăng cường nội tiết tố testosterone và lượng tinh dịch ở chuột đực, đồng thời chống lại estrogen trong cơ thể chuột trưởng thành Nghiên cứu năm 2008 cho thấy eurycomanone cũng có tác dụng gây độc tế bào đối với các tế bào ung thư, bao gồm dòng tế bào ung thư phổi 54 và dòng tế bào K, cùng với hoạt tính chống sốt rét mạnh mẽ.
Một nghiên cứu trên 126 người Nhật Bản trung niên trong 4 tuần cho thấy việc sử dụng dịch chiết thân rễ bá bệnh 200 mg/ngày giúp tăng cường hệ miễn dịch ở cả nam và nữ Nghiên cứu được chia thành hai nhóm, trong đó một nhóm sử dụng dịch chiết và nhóm còn lại dùng giả dược.
Một nghiên cứu lâm sàng đã xác nhận vai trò của eurycomanone như một liệu pháp hiệu quả cho các vấn đề sức khỏe tình dục ở nam giới, bao gồm rối loạn cương dương, vô sinh, giảm ham muốn tình dục và tác động đến hormone nam Eurycomanone được xem là tiềm năng trong việc khôi phục sinh lực tình dục và tăng cường khả năng sinh dục cho nam giới.
Eurycomanone có khả năng ức chế biểu hiện dấu hiệu khối u ung thư phổi bằng cách ngăn chặn sự gia tăng của tế bào ung thư phổi và đồng thời gây độc cho các dòng tế bào ung thư vú (M F-7).
Ngoài ra, eurycomanone còn có tác dụng sinh học là chống sốt rét
1.3.4 Một số nghiên cứu định lƣợng eurycomanone bằng HPLC
Trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lƣợng eurycomanone trong dƣợc liệu bao gồm cảphương pháp truyền thống cũng như phương pháp hiện đại HPLC
V NU là một phương pháp hiện đại đang được ưa chuộng hiện nay Nghiên cứu định lượng eurycomanone trong rễ cây Tongkat Ali (Eurycoma longifolia) đã chỉ ra tầm quan trọng của hoạt chất này trong việc nâng cao sức khỏe và cải thiện sinh lý.
- Cột: Dionex C18 (5 àm x 4,6 mm x 50 mm) và Acclaim Polar C18 (5 àm x 4,6 mm x 250 mm)
- Pha động: nước tinh khiết (A), methanol (B) và acetonitrile (C)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Đường chuẩn: R 2 = 0,8923 b Định lượng eurycomanone trong rễ Eurycoma longifolia bằng RP-HPLC
- Pha động: Nước tinh khiết (A), methanol (B) và acetonitril (C)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Độ tuyến tớnh: nồng độ 5-50 àg/ml, R 2 = 0,997
- LOD = 2,7 àg/ml, LOQ = 9,1 àg/ml
- Thời gian lưu có RSD < 2,5%, diện tích pic có RSD < 5% c Sử dụng RP-HPLC để kiểm định eurycomanone trong cây bá bệnh và chế phẩm bá bệnh [38]
- Cột: Phenomenex, Luna C18 (150 mm ì 4,6 mm, 5 àm)
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
- Pha động: N ( ) và acid formic trong nước 0,1% (B)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Detector: UV (254 nm) Eurycomanone hấp thụ mạnh nhất trong khoảng 248-255 nm
- Độ tuyến tớnh: 0,1-50 àg/ml
- LOD = 0,29 ± 0,1 àg/ml, LOQ = 0,887 ± 0,30 àg/ml d Định lượng eurycomanone trong cây bá bệnh và chế phẩm bằng HPLC- DAD/ELSD [29] ộ μm)
- Pha động: 0,02% trifluoroacetic acid ( ) và acetonitrile ( )
- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl
- Độ tuyến tính: phương trình hồi quy tuyến tính y = 1827,4x + 5,928 với R 2 0,9991
- LOD = 0,04 mg/ml và LOQ = 0,11 mg/ml
- Độ lặp lại có RSD = 0,53% e Phát hiện và định lượng eurycomanone trong các chế phẩm [40]
- Cột: Xbridge (Supelcosil 5 àm, 250ì4,6 mm)
- Pha động: isocratic và acetonitrile (86:14)
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Độ tuyến tính: 0,01325-0,5 mg/ml, R 2 = 0,999
- LOD = 0,0227 mg/ml, LOQ = 0,069 mg/ml f Dùng HPLC đểđịnh lượng một số thành phần trong cây bá bệnh [41]
- Cột: Metaphase KR I00-5-C18 (5 àm, 250 x 4,6 mm)
- Pha động: isocratic trong Me N và nước (26: 74)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
- Detector: UV (238 m) g Dùng HPLC để phân tích eurycomanone [43]
- Cột: Phenomenex C18 (250 mm ì 4,6 mm ì 4 àm)
- Pha động: acetonitrile và 0,05% orthophosphoric acid (24:76, v/v)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl
- Độ tuyến tính: R 2 = 0,971 h Định lượng eurycomanone trong Tongkat Ali [44]
- Cột: Synerg 4u Fusion-RP80A (150 x 4,60 mm, 4 àm)
- Pha động: Acid phosphoric 0,05% và ACN (85:15)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
T ổ ng quan v ề s ắ c ký l ỏ ng hi ệu năng cao HPL
HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự kết hợp của các quá trình hóa học và lý học Phương pháp này hoạt động dựa trên các cân bằng động giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc ký, nơi các chất tan được vận chuyển và phân bố liên tục qua chất nhồi cột Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào nhiều yếu tố, dẫn đến việc một số chất tan bị giữ lâu hơn trong khi một số khác được lưu giữ ít hơn Đây chính là nguyên lý cơ bản của sự tách biệt các chất trong phương pháp HPLC.
Sau khi các chất rời khỏi cột, chúng sẽ được phát hiện bằng detector Nếu ghi lại quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ thu được một sắc đồ với nhiều pic.
Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt đƣợc tách ra trên sắc ký đồ
1.4.2 Một số thông sốđặc trƣng a Th ời gian lưu
Hình 1.4 Mối quan hệ giữa các đại lượng thời gian của HPLC
R là thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách khỏi cột t0, hay thời gian chết, là khoảng thời gian mà pha động di chuyển từ đầu đến cuối cột, tương ứng với thời gian mà một chất không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột Thời gian lưu thực của một cấu tử được ký hiệu là t’.
Hệ sốdung lƣợng k’ đƣợc định nghĩa theo công thức sau: k’ = = – = – 1
Nếu k’ ~ 0 thì tR ~ t0, chất ra rất nhanh, cột không có khảnăng tách chất
Nếu k’ càng lớn tức tR càng lớn thì chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích lâu
Khoảng k’ lí tưởng là 2-5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp chất thì có thể chấp nhận k’ thuộc 1-20 c H ệ s ố ch ọ n l ọ c
Hệ số chọn lọc đƣợc tính theo công thức: α =
Hệ số chọn lọc đặc trƣng cho khảnăng tách 2 chất của cột α khác 1 càng nhiều thì khảnăng tách càng rõ ràng.
Quy ước B là chất bịlưu giữlâu hơn nên α > 1 Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 α 2 d Hi ệu năng (Số đĩa lí thuyế t)
Hiệu năng của cột đặc trƣng cho khảnăng tách sắc kí của các cấu tử trên cột và đƣợc tính theo công thức sau:
Với : W là chiều rộng ởđáy pic.
N là sốđĩa lí thuyết e H ệ s ố b ất đố i (AF)
Hệ số bất đối AF cho biết mức độcân đối của pic trên sắc ký đồvà đƣợc tính nhƣ sau:
Chiều rộng W1/20 được xác định bằng cách đo ở vị trí 1/20 chiều cao của pic Khoảng cách a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lƣợng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2 Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối
1.4.3 Thẩm định phương pháp HPLC
Thẩm định phương pháp là quá trình xác nhận và cung cấp bằng chứng khách quan để chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt ra (fitness for the purpose) Kết quả của thẩm định phương pháp không chỉ giúp đánh giá chất lượng mà còn nâng cao độ tin cậy của kết quả phân tích Đây là yếu tố thiết yếu để đảm bảo tính chính xác trong các kết quả phân tích Các thông số thẩm định bao gồm độ đặc hiệu.
Tính đặc hiệu trong phân tích hóa học là khả năng phát hiện chất phân tích khi có mặt các tạp chất như tiền chất, chất chuyển hóa và chất tương tự Trong phân tích định tính, kết quả phải dương tính khi có mặt chất phân tích và âm tính khi không có mặt, đồng thời cũng phải âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc tương tự Tính đặc hiệu thường tập trung vào việc xác định một chất phân tích duy nhất.
Khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà tại đó có sự liên hệ tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Để xác định khoảng tuyến tính, cần tiến hành đo các dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó, vẽ đường cong biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ, và quan sát sự thay đổi cho đến khi không còn tính tuyến tính.
Sau khi xác định khoảng tuyến tính để xây dựng đường chuẩn và hệ số hồi quy tương quan, đường chuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích Nếu có sai số lớn trong quá trình xây dựng đường chuẩn, kết quả sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng Để kiểm soát độ chính xác của các nồng độ chuẩn, điều cần thiết là phải đảm bảo chất lượng của chất chuẩn được mua từ nhà sản xuất, bao gồm hàm lượng và độ tinh khiết.
Quy trình HPL tiêu chuẩn yêu cầu hệ số tương quan tuyến tính của đường chuẩn R² > 0,999 để đảm bảo độ chính xác Độ chính xác và độ lặp lại là hai yếu tố quan trọng; trong đó, độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn hoặc hệ số biến thiên Độ lặp lại càng cao thì độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên càng thấp, cho thấy tính ổn định của quy trình.
Độ đúng của phương pháp là chỉ số thể hiện mức độ gần gũi giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được công nhận là đúng.
Để xác định độ đúng, cần tìm giá trị đúng thông qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả từ phương pháp đối chiếu, sử dụng mẫu đã biết nồng độ như mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận, và áp dụng phương pháp xác định độ thu hồi Ngoài ra, giới hạn phát hiện (LOD) cũng là một yếu tố quan trọng trong quá trình này.
Giới hạn phát hiện là nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu mà tại đó giá trị đo được vượt qua độ không đảm bảo của phương pháp, cho phép phát hiện nhưng chưa đủ để định lượng chính xác.
Phân tích mẫu ở nồng độ thấp có thể phát hiện tín hiệu của chất phân tích, với số lần lặp lại từ 3 đến 4 lần Tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to Noise Ratio) được xác định, trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích và N là nhiễu đường nền Thông thường, S/N được lấy là 3 e, từ đó xác định giới hạn định lượng (LOQ).
LOQ, hay nồng độ tối thiểu của chất trong mẫu thử, là mức độ mà chúng ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát với kết quả đạt độ chụm mong muốn Khái niệm LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng.
Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, phương pháp này áp dụng cho các quy trình phân tích sử dụng công cụ có nhiễu đường nền Cách tính toán tương tự như trong phần tính LOD, với LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đường nền, thường lấy S/N = 10.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN Ứ U
ĐỐI TƢỢ NG NGHIÊN C Ứ U
Mẫu nghiên cứu rễ cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) được cung cấp bởi PGS.TS Phương Thiện Thương, thuộc Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Hiện tại, mẫu tiêu bản này đang được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN.
Hình 2.1 Mẫu bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.)
- Chất chuẩn Eurycomanone (Wako chemical, Nhật Bản; độ tinh khiết 97%)
- Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC
- cid formic 0,1%/ nước được pha từacid formic P (Merk, Đức)
- Methanol dùng cho HPL (Merk Đức)
- Nước cất hai lần đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV
- Hệ thống máy HPLC Agilent 1260 Technologies
- Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức
- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm
- Cân phân tích 4 chữ số
- Các dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm: ình định mức, pipet, ống đong, tủ sấy…
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN Ứ U
2.2.1 Phương pháp chiết xuất eurycomanone từ rễ bá bệnh Để chiết xuất thành phần có hoạt tính sinh học eurycomanone từ rễ cây bá bệnh, chúng tôi đã tham khảo nhiều nguồn tài liệu Có thể chiết xuất eurycomanone bằng mathanol, ethanol và nước Chiết bằng methanol cho hiệu suất cao nhất [39]
Vì thếchúng tôi đã lựa chọn quy trình chiết xuất bá bệnh đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Phương pháp chiết: siêu âm
- Thời gian chiết: 30 phút/lần
2.2.2 Phương pháp phân tích bằng HPLC a L ự a ch ọn điề u ki ệ n s ắ c ký
Chúng tôi sử dụng phương pháp HPL để tách, định tính, định lượng eurycomanone từ rễ cây bá bệnh húng tôi đã khảo sát các điều kiện sau:
- Cột sắc ký: Tiến hành trên cột sắc ký Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5 àm)
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát thành phần dung môi bằng cách tham khảo nhiều nguồn tài liệu và kết hợp với điều kiện thực tế trong phòng thí nghiệm, đồng thời thử nghiệm với các tỉ lệ và tốc độ dòng khác nhau.
- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 2 loại detector UV,
D D để đảm bảo vừa phát hiện đƣợc đƣợc chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm
- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất b Th ẩm định phương pháp
Chuẩn bị 2 mẫu: mẫu trắng là dung dịch MeOH và mẫu eurycomanone chuẩn pha trong MeOH
So sánh các pic trên các sắc ký đồthu đƣợc từ việc phân tích các mẫu trên
Độ tuyến tính và khoảng nồng độ
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn eurycomanone trong MeOH với nồng độ từ 18,75 đến 200 μg/ml Tiến hành phân tích các mẫu và xây dựng phương trình hồi quy để xác định hệ số tương quan R.
Độ lặp lại (độ chụm)
Tiến hành phân tích 6 mẫu dung dịch chuẩn eurycomanone, xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn pha trong MeOH, tiến hành trong cùng điều kiện Xác
V NU định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lƣợng
Độđúng Độđúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ eurycomanone vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát
Chuẩn bị các dung dịch sau:
1 Dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp
2 Dung dịch thử: dung dịch dịch chiết rễ cây bá bệnh pha trong MeOH
3 Dung dịch thử thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử một lƣợng chính xác chất chuẩn bằng khoảng 40% lƣợng eurycomanone có trong mẫu thử, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo quy trình đã xây dựng
Từ kết quả chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn sẽ tính đƣợc phần trăm tìm lại so với lƣợng chuẩn thêm vào mẫu thử
2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu
- Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2013
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = x 100%
KẾ T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N
K Ế T QU Ả
3.1.1 Quy trình chiết rễ cây bá bệnh
Thực hiện đồng thời 6 mẫu độc lập, mỗi mẫu chứa 100 mg rễ cây bá bệnh phơi khô Cắt nhỏ dược liệu, thêm 5 ml MeOH và siêu âm trong 30 phút Gạn dịch chiết và lặp lại quy trình hai lần Cuối cùng, gộp các dịch chiết và sấy ở 50 độ C đến khi đạt khối lượng không đổi.
3.1.2 Xây dựng quy trình định lƣợng a Điề u ki ệ n s ắ c ký
Dựa trên việc phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát về thành phần pha động, tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng, chúng tôi đã phát triển một chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPL Gilent 1260 Infinity.
- Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5àm)
- Pha động: (acid formic 0,1%/nước): B (ACN)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Dung môi pha mẫu: MeOH ảng 3.1 Chương trình chạy dung môi pha động phân tích dịch chiết rễ bá bệnh
Kết quảlà chúng tôi thu đƣợc sắc ký đồ của dung dịch chuẩn eurycomanone với điều kiện sắc ký nhƣ trên.
Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch eurycomanone chuẩn b Thẩm định phương pháp phân tích
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn eurycomanone, sau đó hòa tan và định mức trong bình định mức 10 ml bằng methanol (MeOH) để thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ 500 μg/ml (ppm).
Từ dung dịch chuẩn 1000 ppm tiến hành pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 18,75 – 25 – 37,5 – 50 – 100 – 200 ppm
+ Dung dịch thử: Cắn chiết dƣợc liệu eurycomanone đƣợc tiến hành nhƣ mục 3.1.1 pha trong MeOH
+ Dung dịch mẫu trắng: MeOH
Tiến hành sắc ký mẫu trắng và mẫu phân tích eurycomanone theo chương trình khảo sát, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic eurycomanone Kết quả cho thấy không có pic nào xuất hiện trong sắc ký đồ của dung môi pha mẫu ở thời gian lưu tương ứng với eurycomanone (tR = 10,117 phút), chứng tỏ phương pháp phân tích eurycomanone có độ đặc hiệu cao.
Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độđặc hiệu)
Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone (đánh giá độđặc hiệu)
Chuẩn bị một mẫu dung dịch eurycomanone chuẩn nồng độ200 μg/ml Tiêm sắc ký lặp lại 6 lần với điều kiện nhƣ ở mục trên
Sau mỗi lần tiêm, cần xác định các thông số như thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối và số đĩa lý thuyết của eurycomanone trên sắc ký đồ Kết quả thực nghiệm sẽ được trình bày trong bảng dưới đây.
V NU ảng 3.2 Tính thích hợp hệ thống
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic lần lượt là 0,172% và 2,628%, đều nhỏ hơn 5% Hệ số bất đối dao động từ 1,17 đến 1,2, cho thấy pic khá cân đối Số đĩa lý thuyết trung bình đạt 23612, chứng tỏ khả năng tách tốt của cột sắc ký Điều này khẳng định rằng hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là thích hợp để định tính và định lượng eurycomanone.
Độ tuy ế n tính và kho ả ng n ồng độ
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn với nồng độ từ 18,75 đến 200 μg/ml và tiến hành sắc ký cho mỗi dung dịch ba lần Ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích pic tương ứng Sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để lập phương trình hồi quy tuyến tính, xác định hệ số tương quan giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic Kết quả phương trình hồi quy tuyến tính được thể hiện trong hình 3.4.
V NU ảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của eurycomanone
Thớ nghiệm Nồng độ (àg/ml) Diện tớch pic
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ eurycomanone
Di ện tí ch p ic (m AU s)
Biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của eurycomanone y = 4 8425x + 7 4895
Kết quả từ bảng 3.3 và đồ thị hình 3.4 cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ eurycomanone trong khoảng 18,75 – 200 àg/ml, với hệ số tương quan R² đạt 0,9997 Đường chuẩn được xây dựng thể hiện độ tuyến tính cao, đảm bảo tính chính xác cho việc phân tích định lượng eurycomanone.
Gi ớ i h ạ n phát hi ệ n (LOD) và gi ớ i h ạn định lượ ng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp được xác định bằng cách pha loãng mẫu phân tích eurycomanone cho đến khi tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3 Nồng độ này phản ánh khả năng phát hiện chất phân tích trên sắc ký đồ.
Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD
Kết quả phân tích cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện với eurycomanone là 4,6875 àg/ml, tương ứng cú giới hạn định lượng là 15,46875 àg/ml
Tiến hành định lượng 6 mẫu dung dịch chuẩn eurycomanone với nồng độ 200 µg/ml và thực hiện chạy sắc ký theo điều kiện đã nêu trong mục 3.1.2 Để xác định độ lặp lại, chúng tôi tính toán độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị định lượng Kết quả về độ lặp lại của phương pháp được trình bày trong bảng 3.4.
Nồng độ eurycomanone chuẩn (àg/ml)
Nồng độ tính toán (àg/ml)
Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại chấp nhận được, với giá trị RSD (%) khi tiến hành phân tích 6 dung dịch chuẩn eurycomanone là 2,65% nhỏhơn 5%.
Xác định độđúng bằng phương pháp thêm chuẩn
Dung dịch thử chuẩn được thực hiện bằng cách thêm 17,5 µg eurycomanone vào mẫu cao dược liệu Sau đó, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo quy trình đã nêu ở mục 3.1.2 Thí nghiệm được lặp lại 6 lần để đảm bảo tính chính xác Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng, lượng eurycomanone trong các mẫu được tính toán và kết quả được trình bày trong bảng 3.5, phản ánh độ đúng của phương pháp.
Thí nghiệm Mẫu đã cú (àg)
Tổng lƣợng tỡm lại (àg)
Kết quả cho thấy phương pháp có độđúng tốt:
- Độ lệch chuẩn tương đối là 3,26% (nhỏhơn 5%)
- Tỷ lệ thu hồi mỗi lần đều nằm trong khoảng 96,00% đến 103,60%
3.1.3 Định lƣợng eurycomanone trong dƣợc liệu rễ cây bá bệnh
Chuẩn bị mẫu phân tích eurycomanone bao gồm việc hòa tan lượng cắn thu được sau khi chiết bằng methanol (MeOH) Sau đó, mẫu được siêu âm và lọc qua màng lọc kích thước 0,2 micro trước khi tiêm vào hệ thống HPLC Điều kiện sắc ký được thực hiện theo hướng dẫn trong mục 3.1.2.
- Xác định thời gian lưu, diện tích pic tương ứng với thời gian lưu của eurycomanone trên sắc ký đồthu đƣợc
Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính và phương pháp nội suy, chúng tôi đã phân tích hàm lượng eurycomanone trong mẫu dược liệu, với kết quả được trình bày trong bảng 3.6 Bảng 3.6 thể hiện kết quả định lượng eurycomanone trong rễ bá bệnh.
TN Khối lƣợng dƣợc liệu (mg)
Diện tích pic eurycomanone (mAU.s)
Khối lƣợng eurycomanone trong cao (àg)
Hàm lƣợng eurycomanone trong cao (%)
Hàm lƣợng eurycoman one trong dƣợc liệu khô (%)
Kết quả: Hàm lƣợng eurycomanone trong cao rễ bá bệnh và trong rễ cây bá bệnh lần lƣợt là 0,597% và 0,0761%
Th ả o lu ậ n
Ngày nay, nhu cầu sử dụng sản phẩm thảo dược cho chăm sóc sức khỏe ngày càng tăng, dẫn đến việc sử dụng dược liệu bá bệnh với khối lượng lớn Tuy nhiên, nhiều dược liệu chưa được kiểm soát, gây ra tình trạng giả mạo và chất lượng kém, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người bệnh và gây tổn thất kinh tế Do đó, việc kiểm tra và đánh giá chất lượng dược liệu bá bệnh là rất quan trọng.
3.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích eurycomanone bằng HPLC
Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm và trang thiết bị hiện có tại Khoa Y Dược, chúng tôi đã tham khảo tài liệu công bố và phát triển phương pháp phân tích eurycomanone trong cây bá bệnh bằng kỹ thuật HPLC.
+ Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5àm) + Pha động: (acid formic 0,1%/nước) : B (ACN) với chương trình chạy nhƣ bảng 3.1 và 3.2
+ Detector D D: bước sóng 244 nm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Thể tích tiêm mẫu: 10 μl + Nhiệt độ buồng cột: 20 ± 0,8 ◦ C + Dung môi pha mẫu: MeOH
- Đường chuẩn: y = 4,8428x + 7,4895, R 2 = 0,9997, khoảng nồng độ 18,75 –
- Giới hạn phỏt hiện: 4,6875 àg/ml
- Giới hạn định lƣợng: 15,46875 àg/ml
Kết quả phân tích eurycomanone bằng HPLC cho thấy độ tin cậy cao với điều kiện sắc ký đã thiết lập Phương pháp này có thể áp dụng hiệu quả để phân tích định tính và định lượng eurycomanone trong các bài bệnh.
3.2.3 Định lƣợng eurycomanone trong dƣợc liệu bá bệnh
Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) là một dược liệu quý đang được nghiên cứu và phát triển Việc đánh giá chất lượng và phân tích thành phần hoạt chất trong bá bệnh là rất quan trọng và cần thiết Đến nay, chưa có công bố nào tại Việt Nam phân tích cụ thể định lượng hàm lượng eurycomanone trong cây bá bệnh.
Chúng tôi đã tiến hành định lượng một số mẫu bá bệnh và thu được kết quả cho thấy hàm lượng Eurycomanone – marker chính của cây bá bệnh, trong cao và rễ lần lượt là 0,597% và 0,0761%, tương đương 5,97 mg/g cao và 761 àg/g rễ Kết quả này chứng tỏ rằng rễ bá bệnh chứa một lượng đáng kể Eurycomanone, mở ra cơ hội cho các nghiên cứu chiết xuất và phân lập hợp chất này nhằm phục vụ cho việc chăm sóc sức khỏe con người.
Theo tiêu chuẩn Malaysia, hàm lượng eurycomanone trong cao Eurycoma longifolia nằm trong khoảng 0,8% – 1,5% Kết quả khảo sát của chúng tôi cho thấy hàm lượng eurycomanone chỉ đạt 0,597%, thấp hơn tiêu chuẩn Điều này là cơ sở để chúng tôi tối ưu hóa quá trình chiết xuất nhằm gia tăng hàm lượng eurycomanone Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chiết xuất ethanol có tỷ lệ eurycomanone cao hơn giới hạn cho phép, nhưng ở dạng sáp dính Trong khi đó, chiết xuất nước cho năng suất cao hơn và ở dạng bột, dễ dàng hơn và khả thi hơn so với chiết bằng ethanol Dạng bột cũng thuận tiện hơn cho sản xuất sản phẩm thương mại, do đó, chiết xuất eurycomanone bằng nước có thể là hướng nghiên cứu tiềm năng cho chúng tôi trong tương lai.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Sau một quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã thu đƣợc một số kết quả đáp ứng mục tiêu của đề tài nghiên cứu đã đềra nhƣ sau:
1 Xây dựng được phương pháp định lượng eurycomanone và thẩm định được phương pháp HPL về các mặt: độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ chính xác, độđặc hiệu Kết quảlà phương pháp có độchính xác và độđặc hiệu cao
Trong khoảng nồng độ khảo sát eurycomanone có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic
- Phương pháp có tính chọn lọc với eurycomanone, pic của eurycomanone tách riêng ra khỏi các pic khác
- Có sựtương quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ eurycomanone trong khoảng nồng độ khảo sát với R 2 = 0,9997
- Phương pháp có độđúng cao
2 Đã định lƣợng đƣợc thành phần eurycomanone trong bá bệnh bằng phương pháp HPL –DAD Kết quả định lượng: hàm lượng eurycomanone trong cao rễ bá bệnh và trong rễ bá bệnh lần lƣợt là 0,597% và 0,0761% tương đương 5,97 mg/g cao và 761 àg/g rễ bỏ bệnh
Chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu ban đầu về eurycomanone trong bá bệnh, bao gồm cả phân tích định tính và định lượng Những kết quả này sẽ được phát triển tiếp theo thông qua các nghiên cứu bổ sung nhằm khám phá sâu hơn về tác dụng và ứng dụng của eurycomanone.
1 Khảo sát các thành phần quassinoid trong bá bệnh đƣợc trồng ở những nơi khác nhau
2 Áp dụng phương pháp này để định lượng eurycomanone có trong một số chế phẩm chứa bá bệnh
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1] Đỗ Huy ích, Đặng Quang hung, ùi Xuân hương, Nguyễn
Thƣợng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr 116-118
[2] Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội, tr.412-413
[3] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một sốphương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-
[4] Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm,
Nhà xuất bản Y học, tr 79-82, 84-110
[5] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr 8-99, 162-196, 234 -
[6] Thái Phan Quỳnh Nhƣ (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm Bộ y tế
[7] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hoá phân tích (2006), Hoá phân tích II, tr 17, 99-146, 173-222
Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia (2010) đã thực hiện thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, với nội dung được trình bày chi tiết trong tài liệu xuất bản bởi Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, trang 19-47.
Trần Ý Đoan Trang (2014) đã thực hiện nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ rễ cây mật nhân (Eurycoma longifolia) Luận văn thạc sĩ kỹ thuật này cũng đề cập đến các ứng dụng của những dịch chiết này trong công nghệ thực phẩm.
[10] Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận, Trần Mỹ Tiên, Nguyễn
Nghiên cứu của Thanh Hồng Vân (2012) đã khảo sát tác dụng hướng sinh dục nam từ dịch chiết cồn của rễ bách bệnh (Eurycoma Longifolia Jack) trên chuột nhắt trắng (Mus musculus) Kết quả nghiên cứu được công bố trên Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, cung cấp những thông tin quý giá về khả năng tác động của loại thảo dược này đối với sinh lý nam giới.
[11] Chu Hoàng Hà, Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân,
Nguyễn Đình Trọng (2012), ―Nghiên cứu khảnăng tạo rễtơ của cây
Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thông qua vi khuẩn agrobacterium rhizogenes‖, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50, tr
[12] Chu Hoàng Hà, Hoàng Thị Thu Hằng, Chu Nhật Huy, Nguyễn Trung
Nghiên cứu của Nam, Phạm Bích Ngọc và Trần Thu Trang (2017) trên cây bá bệnh (Eurycoma Longifolia Jack) đã khảo sát các hoạt tính sinh học trong cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên Kết quả được công bố trong Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, tập 33(2), trang 67-73, cung cấp thông tin quý giá về tiềm năng sinh học của cây bá bệnh.
[13] Bin Seng Low, Hai Qiu Ma, Kind Leng Tong, Kit Lam Chan,
Pooi Fong Wong, Sazaly bu akar (2015), ―The In Vitro and In Vivo Anti-Cancer Activities of a Standardized Quassinoids Composition from Eurycoma longifolia on LNCaP Human
Prostate ancer ells‖, PLOS ONE, pp 1-21
[14] Mohd Ismail Bin Mohd Tambi, M Kamarul Imran (2010),
―Eurycoma longifolia Jack in managing idiopathic male infertility‖, Asian Journal of Andrology, 12, pp 376-380
[15] Annie A George, Azreena Abas, Jay K Udani, Michael N
A randomized, double-blind, placebo-controlled study conducted by Pakdaman and Mufiza Musthapa in 2014 investigated the effects of a proprietary freeze-dried water extract of Eurycoma longifolia (Physta) and Polygonum minus on men's sexual performance and overall well-being The findings indicated significant improvements in sexual function and well-being among participants who received the extract compared to those on a placebo This research highlights the potential benefits of these natural supplements in enhancing male sexual health.
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, pp 1-
[16] Abdelhamid Zaki, Aman Shah Abdul Majid, Amin Malik Shah
In a 2014 study by Abdul Majid et al., the anti-tumor effects of Eurycoma longifolia root extracts were evaluated against the K-562 cell line through in vitro experiments The findings demonstrated significant anti-cancer activity, highlighting the potential of Eurycoma longifolia as a natural therapeutic agent in cancer treatment.
Vivo Study‖, PLOS ONE, 9(1), pp 1-13
[17] Norhaniza Aminudin, Sonal Girish, Suresh Kumar (2015),
―Tongkat li (Eurycoma longifolia): a possible therapeutic candidate against Blastocystis sp.‖, Parasites & Vectors, 8, pp
[18] Kit-Lam Chan, Nowroji Kavitha, Rahmah Noordin, Sreenivasan
Sasidharan (2012), ―In vitro nti-Toxoplasma gondii Activity of Root Extract/Fractions of Eurycoma longifolia Jack‖,
Complementary and Alternative Medicine, 12, pp 91-99
[19] Ahmad Nazrun Shuid, Mohd Azri Abd Jalil, Norliza Muhammad
(2012), ―Role of Medicinal Plants and Natural Products on Osteoporotic Fracture Healing‖, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, pp 1-7
[20] Cin Kong, Man-Wah Tan, Noorsaadah Abd Rahman, Sheila
Nathan, Wageeh A Yehye (2014), ―Discovery of potential anti- infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model‖, Complementary and Alternative Medicine, 14, pp 4-21
[21] Adlin Afzan, Mohd Isa Wasiman, Mohd Ridzuan Mohd Abd
Razak, Noor Rain Abdullah, Nur Fasihah Amir Jalaluddin, Rosnani Ali, Siti Habsah Shiekh Zahari, Zakiah Ismail (2014),
―Effect of selected local medicinal plants on the asexual blood stage of chloroquine resistant Plasmodium falciparum‖,
Complementary and Alternative Medicine, 14, pp 492-505
[22] Chantragan Srisomsap, Chutima Kaewpiboon, Jisnuson Svasti