T ổ ng quan
T ổ ng quan chung v ề sâm vũ diệ p
1.1.1 Tên khoa học, tên đồng danh
Sâm vũ diệp, hay còn gọi là vũ diệp tam thất, hoa diệp tam thất, và nhiều tên khác như trúc tiết nhân sâm, tam thất lá xẻ, và phan xiết, có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem Loại thảo dược này được biết đến với nhiều công dụng trong y học cổ truyền và ngày càng được ưa chuộng trong việc chăm sóc sức khỏe.
Một sốtên đồng danh của SVD:
Aralia bipinnatifida (Seem.) C B Clarke; Aralia quinquefolia (L.) Dec et
Plan.var.major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec.et Plan.var.elegantior Burk;
Panax pseudoginseng Wall.var.bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax pseudoginseng
Wall var major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall spp Himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall.var.elegantior (Burk) Hoo et
Tseng; Panax Japonicus Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng [12]
Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), SVD thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
1.1.3 Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng
Cây thân thảo sống nhiều năm với thân rễ dài và có nhiều đốt, để lại vết sẹo do thân rụng hàng năm Thân khí sinh cao từ 20-30 cm, thường mọc thẳng, rỗng giữa và có vạch dọc, lụi tàn vào mùa đông, nhưng sẽ mọc chồi mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 Lá kép chân vịt gồm 2-3 cái mọc vòng, với lá chét 5-7 (hiếm khi 3) thuôn dài từ 2,5-14 cm và rộng từ 1,5-4 cm, có gốc tròn, đầu nhọn, xẻ thuỳ không đều, mép có răng cưa và có lông.
Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5-10 cm; cụm hoa có từ 20-
Cây hoa có cuống hoa mảnh dài từ 1 đến 1,5 cm, với hoa màu trắng đục mọc thành tán đơn ở ngọn thân Hoa có 5 cánh và bầu 2-3 ô Quả của cây là quả mọng, hình cầu hơi dẹt, có đường kính từ 0,6 đến 1,2 cm, khi chín có màu đỏ ấm và đen ở đầu.
V NU cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [1; 5; 12; 13] Bộ phận dùng: dƣợc liệu là thân rễ SVD [1]
1.1.4 Phân bố và sinh thái
Sâm vũ diệp (SVD) phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal và dãy núi Hoàng Liên Sơn tại Tây Bắc Việt Nam, với Sapa là điểm phân bố cuối cùng ở phía nam Cây được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại núi Hàm Rồng, gần thị trấn Sapa, ở độ cao 1600 m Tuy nhiên, hiện nay, vùng phân bố của SVD đã bị thu hẹp, và cây được coi là cực hiếm ở độ cao khoảng 1800 m trở lên Gần đây, SVD đã được thuần hoá và thử nghiệm trồng tại một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai Đây là một loài quý hiếm đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng cao tại Việt Nam.
SVD là loài thân thảo ưa bóng và ẩm, thường mọc dưới tán rừng ẩm có sương mù quanh năm Vào cuối tháng 2 và đầu tháng 3, chồi thân sẽ mọc lên từ mầm rễ nằm sát mặt đất, phát triển nhanh chóng trong một tháng và ra lá gần đạt chiều cao tối đa Đến tháng 4, mỗi thân có thể cho ra một cụm hoa, trong khi quả xanh xuất hiện từ cuối tháng 4 đến tháng 6 Quả chín vào tháng 7 và rụng quanh gốc cây mẹ, nhưng hạt giống thường bị cuốn trôi do mưa lớn, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên Sau khi quả chín, từ tháng 9-10, phần thân trên mặt đất tàn lụi, để lại dấu vết trên thân rễ, giúp xác định tuổi của cây.
SVD có tác dụng kích thích động dục và hướng sinh dục, với liều thấp giúp giảm thời gian ngủ do phenobarbital, đồng thời tăng cường sức dẻo dai cho cơ thể và hỗ trợ quá trình tán huyết.
Năm 2016, một nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư từ 57 loài cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc Trong số đó, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) nổi bật với khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư.
Sâm vũ diệp có khả năng ức chế sự tập trung tiểu cầu in vitro với các phân đoạn khác nhau và các mức liều cụ thể Cụ thể, phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol và phân đoạn ethylacetat cho thấy tác dụng ức chế ở các mức liều 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL và 5 mg/mL, trong khi phân đoạn ether có hiệu quả ở các mức liều 1, 2 và 5 mg/mL.
1.1.6 Tính vị và công dụng
Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dƣỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ
Theo đông y, SVD có tác dụng bổ dưỡng, chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, đặc biệt là cho phụ nữ sau sinh Ngoài ra, SVD còn được sử dụng để cầm máu, tán ứ và tiêu sưng Khi dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn có thể rắc lên vết thương để chữa chảy máu và giúp vết thương mau lành Rễ SVD còn có thể ngâm rượu và chiết xuất thành tinh sâm, có tác dụng kích thích sinh dục Thêm vào đó, người dân ở vùng trồng SVD còn tận dụng thân và lá để nấu cao, pha với nước hoặc rượu để uống, mang lại hiệu quả tương tự như rễ Tại Trung Quốc, SVD được sử dụng để chữa hư lao, thổ huyết, chảy máu cam và tổn thương do đòn ngã.
Rễ SVD chứa saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất nhƣ: chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginseninosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1, và Rg2
Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố 13 saponin từ lá của loài sâm vũ diệp Panax japonicus var bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng thu hái ở dãy núi
In Tần Lĩnh, Shaanxi, China, researchers have identified two new saponins, bipinnatifidusoside F1 and F2, alongside 11 previously known saponins, including ginsenoside F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd, Rb1, Rb3, 24S-pseudoginsenoside F11, panasenoside, and majoroside F1 The structures of the new saponins have been characterized as dammar-25(26)-ene-3-beta, 12 beta, 20(S), 24 zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-beta-D-glucopyranoside for bipinnatifidusoside F1, and dammar-22(23)-ene-3-beta, 12 beta, 20(S), 24-zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-beta-D-glucopyranoside for bipinnatifidusoside F2.
Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã phát hiện rằng thân rễ của SVD chứa hai nhóm chất chính: polyacetylen và saponin, cùng với acid béo và acid amin Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng cho thấy rằng việc thuỷ phân saponin và kết tinh sapogenin toàn phần có thể thu được acid oleanolic.
Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc đã phân lập thành công 10 saponin khung oleanan từ dịch chiết MeOH của rễ cây SVD, trong đó có 3 hợp chất mới là bifinoside A-C (1-3) và 7 hợp chất đã biết, bao gồm nacrissiflorine methyl ester.
(4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl este (6), stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl este (8), mormordin IIe (9) và stipuleanoside R2 methyl este (10) [25]
Hình 1 C ấ u trúc hoá h ọ c c ủa 10 saponin tách đượ c t ừ r ễ SVD
In 2017, Đỗ Văn Hào and collaborators successfully isolated three compounds from the ethyl acetate extract of the rhizome of SVD, which include β-sitosterol, oleanolic acid, and daucosterol.
B ả ng 1 Các h ợ p ch ất saponin đã phân lậ p t ừ SVD
Nhƣ vậy cho tới hiện tại đã có 26 hợp chất saponin đƣợc phân lập từ SVD
Nhận xét chung cho thấy saponin là thành phần chủ yếu trong thân rễ SVD qua các nghiên cứu về thành phần hoá học Vì vậy, chúng tôi đã quyết định nghiên cứu thành phần saponin, đặc biệt là trong phân đoạn n-butanol, phân đoạn chứa nhiều saponin nhất.
T ổng quan các phương pháp sắ c ký
Sắc ký cột là phương pháp tách chất bằng cách sử dụng pha tĩnh là những hạt có kích thước lớn (50-150 µm) được nạp trong cột thủy tinh Mẫu cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh, với lớp thủy tinh bảo vệ để tránh xáo trộn Dung môi giải ly được chứa trong bình ở vị trí cao và chảy xuống cột, được thu thập vào các lọ nhỏ ở phần dưới Mặc dù quá trình tách bằng sắc ký cột thường chậm và hiệu quả thấp hơn so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC), nhưng phương pháp này có ưu điểm là dễ tìm kiếm vật liệu và có thể xử lý với lượng mẫu lớn Các bước thực hiện sắc ký cột bao gồm
Khi lựa chọn chất hấp phụ cho quá trình sắc ký, pha tĩnh thường được sử dụng là silicagel Các hợp chất không phân cực sẽ được giải ly khỏi cột trước, trong khi đó, các hợp chất phân cực sẽ được giải ly sau Đối với hai phân tử không phân cực, phân tử có trọng lượng phân tử lớn hơn sẽ có tính phân cực mạnh hơn, dẫn đến việc nó bị pha tĩnh giữ lại lâu hơn trong cột Do đó, phân tử này di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử nhỏ hơn, và đôi khi nó có thể ở lại lâu hơn trong cột so với các phân tử có tính phân cực.
Để chọn dung môi cho sắc ký, mẫu cần được hòa tan hoàn toàn trong dung môi với nồng độ 10 mg/ml, tạo thành dung dịch mẫu (A) Chuẩn bị từ 4-6 tấm bản mỏng kích thước 2,5x10 cm và chấm lên mỗi tấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A) Mỗi tấm bản mỏng sẽ được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau và sau đó phát hiện bằng đèn UV hoặc thuốc thử Việc sử dụng đơn dung môi giúp xác định dung môi phù hợp, từ đó tìm kiếm một hỗn hợp dung môi bao gồm một dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực.
Để nạp chất hấp phụ dạng khô vào cột, trước tiên cần sử dụng kẹp để giữ cột thẳng đứng trên giá Sau đó, cho dung môi kém phân cực vào khoảng 2/3 chiều cao cột Tiếp theo, cho chất hấp phụ khô vào cột một cách đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, đồng thời gõ nhẹ vào thành cột Khi lớp chất hấp phụ đạt khoảng 2 cm, mở khóa bên dưới để dung môi chảy ra và hứng vào bình trống Dung môi này sẽ được rót lại lên đầu cột Cuối cùng, cho dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần cho đến khi chất hấp phụ trong cột đồng nhất.
Để nạp mẫu cho sắc ký, nếu mẫu ở dạng lỏng, bạn có thể trực tiếp cho vào đầu cột sắc ký Đối với mẫu dạng rắn, cần hòa tan chất vào một lượng nhỏ dung môi, và loại dung môi này sẽ được sử dụng để khởi đầu quá trình sắc ký.
Quá trình hứng và gom dịch rửa giải bao gồm việc thu thập dịch rửa bằng ống thủy tinh, sau đó gom lại dựa trên kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng.
1.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Hệ số phân tách giữa hai pha, pha động và pha tĩnh, quyết định quá trình phân tích chất Chất cần phân tích sẽ được hấp phụ, phân bố hoặc trao đổi ion trên pha tĩnh, trong khi pha động di chuyển qua pha tĩnh, kéo theo chất cần phân tích.
Các thành phần sau khi được phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh
Có thể nhận diện chất cần phân tích bằng ánh sáng thường nếu các chất này có màu sắc, hoặc sử dụng phương pháp soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm và 366 nm.
Để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích, có thể sử dụng phương pháp phun thuốc thử hiện màu hoặc quét lên bề mặt bản mỏng của thiết bị densitometer, một công cụ đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích Tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, chúng ta sẽ lựa chọn phương pháp phù hợp.
Hệ số lưu giữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích trong quá trình sắc ký Giá trị của Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động.
Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) và khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm) được đo trên cùng một đường đi của vết, với giá trị dao động giữa 0 và 1 Hệ số lưu giữ tương đối cũng được xác định trong quá trình này.
Đường đi của chất phân tích và chất chuẩn được tính bằng cm, với giá trị gần 1 cho thấy sự đồng nhất cao giữa chúng.
1.2.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) a Nguyên tắc của HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự phân tách các chất trong cột chứa pha tĩnh, nhờ vào dòng pha động chất lỏng được bơm dưới áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn dưới dạng tiểu phân, chất lỏng phủ trên chất mang rắn, hoặc chất mang đã được liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.
Quá trình sắc ký lỏng hoạt động dựa trên các cơ chế như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và phân loại theo kích cỡ Tốc độ di chuyển của các chất trong quá trình này phụ thuộc vào hệ số phân bố giữa hai pha, tức là ái lực tương đối của chất với pha tĩnh và pha động Do đó, thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố này.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bằng detector Nếu ghi quá
Quá trình sắc ký hiệu quả giúp tách biệt các thành phần trong hỗn hợp, tạo ra nhiều đỉnh (pic) riêng biệt trên sắc ký đồ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được ứng dụng rộng rãi trong phân tích và định lượng các chất trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
- Định tính: dựa vào thời gian lưu, hình dạng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng phổ của pic thử và pic chuẩn đểđịnh tính chất thử
T ổ ng quan v ề các phương pháp xác đị nh c ấ u trúc
1.3.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) a Nguyên tắc
Khi hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong từ trường, sự thay đổi của từ trường sẽ gây ra hiện tượng hấp thụ năng lượng từ sóng vô tuyến, dẫn đến sự xuất hiện của phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
Các hạt nhân nguyên tử với khối lượng là số lẻ và số thứ tự nguyên tử là số chẵn sẽ có momen từ và phát tín hiệu NMR, trong khi các hạt nhân có khối lượng và số thứ tự nguyên tử đều là số chẵn thì không có momen từ và không phát tín hiệu NMR Vị trí tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR chịu ảnh hưởng bởi mật độ điện tử xung quanh proton đó.
Độ chuyển dịch hoá học (δ) là sự khác biệt về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và chất chuẩn.
(3) Trong đó: δ: độ chuyển dịch hoá học νmau: tần số của mẫu phân tích νTMS: tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane νmay: tần số làm việc của máy
Khoảng cách giữa các vạch tín hiệu bội được đo bằng Hz và đặc trưng cho hằng số tương tác spin (J) Giá trị của J phụ thuộc vào tương quan không gian và mật độ điện tử xung quanh hai proton đang tương tác.
-Diện tích dưới tín hiệu
Diện tích dưới tín hiệu trong phổ NMR tỷ lệ thuận với số lượng proton tương ứng Đường cong tích phân diện tích cung cấp thông tin về số lượng tương đối của proton cho tín hiệu đó, cho thấy ứng dụng quan trọng của phổ NMR trong việc phân tích cấu trúc hóa học.
Bằng cách xác định độ chuyển dịch hoá học δ, hằng số tương tác J và diện tích dưới tín hiệu, chúng ta có thể biện giải phổ và kết hợp với thông tin từ các loại phổ khác như IR và MS để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ.
1.3.2 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) a Nguyên tắc
Sử dụng chùm điện tử có năng lượng trung bình từ 50 đến 100 eV để bắn phá phân tử hữu cơ trong môi trường chân không cao (10 -3 - 10 -6 mmHg) sẽ dẫn đến ion hóa và phân hủy các chất hữu cơ thành các mảnh Các ion được tạo ra trong buồng ion hóa sẽ được gia tốc và phân tách nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion này sẽ được hiển thị dưới dạng các vạch (pic) có cường độ khác nhau, tạo thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.
Các đồng vị của một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân nhưng khác nhau về số neutron, dẫn đến khối lượng nguyên tử khác nhau Phương pháp khối phổ (MS) có thể được sử dụng để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố trong mẫu.
Phân tích khối phổ cung cấp thông tin chính xác về khối lượng các ion phân tử M+, (M+1)+, và (M+2)+, là những đặc trưng quan trọng của hợp chất hóa học Ngoài ra, việc xem xét các pic đồng vị và tỷ số cường độ của chúng, kết hợp với khối lượng của các mảnh ion, giúp xác định công thức nguyên của chất phân tích.
Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có sẵn trên máy hoặc với phổ chất đối chiếu để xác định thành phần định tính của mẫu một cách chính xác.
Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu, cần sử dụng kỹ thuật ion hóa phù hợp nhằm phân tách chất nghiên cứu thành nhiều thành phần.
V NU mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng Việc biện giải phổ nên kết hợp với phổ NMR và phổ IR
Định lượng khối phổ được thực hiện thông qua việc phân tích định lượng, tương tự như các kỹ thuật khác, bằng cách thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn kèm theo độ cường độ vạch phổ nhằm xác định nồng độ.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứ u
Đối tƣợ ng nghiên c ứ u
Mẫu nghiên cứu là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) đƣợc thu hái ở Sa a, Lào Cai vào tháng 15-07-2016 và đƣợc giám định tên khoa học bởi
TS Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu Mẫu dƣợc liệu (DL-150716) được lưu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu-
Hình 2 Sâm vũ diệ p (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái t ạ i Sa Pa, Lào Cai 15/07/2016
Phương tiệ n nghiên c ứ u
Dung môi được sử dụng trong quá trình chiết xuất phân lập như ethanol (EtOH), methanol (MeOH), dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc) và n-butanol (BuOH) đều phải đạt tiêu chuẩn công nghiệp và cần được cất lại trước khi sử dụng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả trong quá trình chiết xuất.
Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel (0,040 – 0,063 mm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 àm, YMC Co Ltd., Nhật Bản)
Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kiesel 60 F254 và pha đảo TLC silica gel 60 RP-18 F254 S (Merk, Damstadt, Đức)
Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO410 % trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất
Dung môi chạy sắc ký HPLC (methanol, acetonitrile, acid acetic) của Merk, Đức, nước cất dùng cho phân tích
- Máy Jasco DIP-360 digital polarimeter (Jasco, Nhật Bản): đo năng suất quay cực
- Máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản): đo điểm nóng chảy
- Máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ): đo phổ khối ion hoá phun mù điện tử (ESI-MS)
Máy JEOL ECX 400, sản xuất bởi Jeol Nhật Bản, là thiết bị chuyên dụng cho việc đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều Máy này sử dụng dung môi CDCl3/CD3OD và chất nội chuẩn tetramethylsilan (TMS) để đảm bảo độ chính xác trong các phân tích.
- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tựđộng
Phương pháp nghiên cứ u
2.3.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu
- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70
Phương pháp chiết phân đoạn bằng cách chiết lỏng lỏng được thực hiện với thân rễ sâm vũ diệp Quy trình bắt đầu bằng việc chiết hồi lưu 3 lần với ethanol 70% ở nhiệt độ 70ºC Sau khi lọc để loại bỏ bã dược liệu, dịch lọc được gộp lại và sử dụng máy cô quay chân không dưới áp suất giảm tại 50ºC để thu được cao khô Cao khô này sau đó được phân tán trong nước và lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực khác nhau như ete, ethyl acetat và butanol, từ đó thu được các phân đoạn tương ứng.
2.3.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học
Sử dụng các kỹ thuật sắc ký bao gồm:
- Sắc ký cột: cột nhồi silica gel pha thường và pha đảo
Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp hiệu quả để theo dõi quá trình phân lập và kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập Ngoài ra, phương pháp này cũng được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất, giúp nâng cao độ chính xác trong nghiên cứu và phát triển sản phẩm.
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được thực hiện thông qua các phương pháp phổ như phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Việc so sánh dữ liệu phổ thu được với các tài liệu tham khảo đã công bố là cần thiết để đảm bảo tính chính xác trong phân tích.
2.3.4 Phương pháp phân tích định tính các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phân tích định tính dấu vân tay của một thành phần trong mẫu hỗn hợp như cao chiết dược liệu hoặc phân đoạn dịch chiết dựa vào thông số thời gian lưu cố định, giúp xác định đặc trưng của thành phần đó trong điều kiện sắc ký.
K ế t qu ả th ự c nghi ệ m và bàn lu ậ n
Chi ế t xu ấ t và tinh ch ế các h ợ p ch ấ t saponin t ừ thân r ễ SVD
3.1.1 Chiết xuất và phân lập
Mẫu thân rễ sâm vũ diệp (500 g) có hàm ẩm 7,81% được rửa sạch, phơi khô và thái nhỏ, sau đó ngâm chiết bằng dung môi ethanol 70% trong 3 lần, mỗi lần 1500 ml, sử dụng thiết bị chiết hồi lưu trong 3 giờ Dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, cho ra 95,9 g cao chiết tổng ethanol Cao chiết được hòa tan trong 500 ml nước cất và chiết phân bố lần lượt bằng ether, ethyl acetate và n-BuOH, mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 ml Các dịch chiết phân đoạn sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được phân đoạn tương ứng là Ê-te (5,82 g), EtOAc (2,70 g) và n-BuOH (21,7 g).
Hình 3 Sơ đồ chi ết phân đoạ n l ỏ ng-l ỏ ng
Sau khi tiến hành phân đoạn BuOH, quá trình phân lập được thực hiện bằng phương pháp sắc ký với cột nhồi silica gel (Φ 85 mm x 80 mm) Hệ dung môi rửa giải sử dụng là gradient CH2Cl2-MeOH (5:1 → 0:1, v/v), mỗi phân đoạn có thể tích 600 ml, và kết quả thu được 4 phân đoạn được ký hiệu là B1-B4.
Phân đoạn B2 (4,3 g) được phân lập bằng sắc ký cột pha thuận silica gel (Φ 45 mm x 350 mm) với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (3:1:0,1), thu được 4 phân đoạn nhỏ (B2.1-B2.4) Từ phân đoạn B2.2 (920 mg), tiếp tục sử dụng sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 50 mm x 350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:1), thu được hợp chất số 2 (bột màu trắng, 100 mg) Cuối cùng, từ phân đoạn B4 (5,1 g) cũng được phân lập bằng sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 50 nm x).
350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:1, v/v, 1600 ml) thu đƣợc hợp chất số 1 (bột màu trắng ngà, 180 mg) Tóm tắt quá trình phân lập nhƣ hình 5
Hình 4 Sơ đồ phân lập sắc ký 2 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn BuOH
3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập đƣợc bằng SKLM
Sau khi phân lập, chất số 1 và số 2 được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM trên bản mỏng Silicagel RP-18 F254S Hệ dung môi sử dụng là methanol và nước với tỷ lệ 2:1, cho kết quả sắc ký đồ bản mỏng như hình 6.
Hình 5 Sắc ký đồ của chất số 1 và số 2 phâ n lập được sau khi phun thuốc thử H 2 SO 4 10% /EtOH
Sau khi tiến hành phun thuốc thử, cả hai hợp chất đều xuất hiện vết màu hồng đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng.
Sắc ký cột Silica gel (Φ85 mm × 80 mm)
CH 2 Cl 2 -MeOH (5:1 0:1, v/v, 600 mL/PĐ)
SKC pha đảo C18 (Φ50 mm × 350 mm) MeOH-H 2 O
Bột màu trắng, 100 mg Chất số 1
V NU các dẫn xuất triterpen có hệ số Rf lần lƣợt là 0,30 và 0,34 Vì vậy sơ bộ kết luận hai hợp chất phân lập đƣợclà những chất tinh khiết.
Xác đị nh c ấ u trúc c ủ a 2 saponin phân l ập đƣợ c
Chất số 1 (Stipuleanoside R2): chất bột màu trắng Góc quay cực: [α]D 25
Phổ ESI-MS: m/z 1087 [M-H] - tương ứng với khối lượng phân tử là M1088
Phổ 1 H-NMR (MeOD; 500 MHz) và 13 C-NMR (MeOD; 125 MHz), DEPT: xem bảng 2
B ả ng 2 S ố li ệ u ph ổ 1 H và 13 C-NMR, DEPT c ủ a h ợ p ch ấ t s ố 1
Vị trí C * δ C δ C a,b DEPT δ H a,c (độ bội, J= Hz)
* c của chất stipuleanosid R 2 đo trong CD3OD [27]; a Đo trong MeOD, b 125 MHz, c500 MHz
Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng bột màu trắng với năng suất quay cực riêng [α] 25 D=+7,5 (c=0,2; MeOH) Khi phản ứng với H2SO4 10% dưới điều kiện hơ nóng, hợp chất này tạo ra màu hồng đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpene Phân tích phổ 13C NMR và DEPT cho thấy hợp chất có 7 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 6 nhóm CH, 6 nguyên tử C bậc 4 và 1 nhóm COOR.
Phổ 13 C-NMR của 1 mang các đặc điểm của một saponin có phần aglycon là một triterpene khung oleanan đặc trƣng của các saponin chính đã đƣợc công bố từ sâm vũ diệp [25] Phổ 1 H-NMR xuất hiện 7 tín hiệu singlet của các nhóm methyl bậc ba tại δ 0,81; 0,85; 0,93; 0,95; 0,96; 1,05; 1,17 (7 tín hiệu CH3, s, CH3-25, 26, 24, 23,
Trong nghiên cứu này, phổ NMR cho thấy sự hiện diện của một nối đôi tại C-12/C-13 với tín hiệu tại δ 5,27 (1H, br s, H-12) Các tín hiệu cộng hưởng trong vùng δ 3,0-4,0 cho thấy sự có mặt của các nhóm oxymetin và oxymethylen từ bốn phân tử đường, bao gồm một đơn vị glucorunic acid (GluA), hai đơn vị glucose (Glc) và một arabifuranose (Ara(f)) Các tín hiệu proton anomeric được ghi nhận tại δ 4,01 (H-1’), 4,92 (H-1”), 5,19 (H-1”’) và 5,40 (H-1”’’) Phổ 13C-NMR cho thấy 53 tín hiệu nguyên tử carbon, trong đó 23 tín hiệu thuộc bốn đơn vị đường đã nêu Phần aglycon oleanolic acid có 30 tín hiệu còn lại, bao gồm một oxymethin tại δ 91,03 (C-3), nối đôi C-12/C-13 tại δ 123,8 và 144,7 ppm, cùng với một nhóm carbonyl acid carboxylic tại δ 178,1 (C-28) Thêm vào đó, phổ khối ESI-MS của mẫu cho thấy pic ion đáng chú ý.
1087 [M-H] - phù hợp với công thức phân tử C53H84O23 (M88) Từ những dữ liệu phổ trên kết hợp so sánh với số liệu phổ NMR trong tài liệu đã đƣợc công bố
Cấu trúc hoá học của stipuleanoside R2, một saponin chưa được công bố từ sâm vũ diệp, đã được xác định (Hình 6) Trước đó, dạng methyl ester của stipuleanoside R2 đã được ghi nhận trong một nghiên cứu liên quan đến sâm vũ diệp.
Hình 6 Cấu trúc hóa học của chất số 1
Thể chất: bột màu trắng
Phổ ESI-MS: m/z 964 [M+Na] + , tươngứng với khối lượng phân tử là M= 940 Phổ 1 H-NMR (CD3OD; 400 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD; 100 MHz): xem bảng 3
Bảng 3 Số liệu phổ 1 H và 13 C- NMR của hợp chất số 2
Vị trí C * δ C δ C a,b δ H a,c (độ bội, J= Hz)
*c của chất araloside A methyl ester đo trong CD3OD [27]; a Đo trong CD3OD, b100 MHz, c 400 MHz
Hợp chất 2 được chiết xuất dưới dạng bột màu trắng từ phân đoạn BuOH Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất này cho thấy đặc trưng của một saponin, với phần aglycon là acid oleanoic, thể hiện qua các tín hiệu ở nối đôi tại C-12/C-13 với các giá trị δ 122,2 (C-12) và 143,2 (C-13).
13) và 5,22 (1H, br s, H-12)], một nhóm oxymethin tại δ 89,6 (C-3) và một nhóm carbonyl carboxylic tại δ 176,4 (C-28) mà tại đó các phân tử đường tạo liên kết trên cơ sởphân tích độ dịch chuyển hoá học [23; 25] Điểm khác nhau của chất 2 so với chất 1 là phần đường, các tín hiệu trên phổ NMR của chất 2 cho thấy sự có mặt của
3 đơn vị đường với một GluA, một Glc và một Ara(f) bởi 3 tín hiệu proton anomeric [δ 4,35 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1’), 5,03 (1H, br s, H-1’’), 5,38 (1H, d, J=8,0
Phân tử đường GluA chứa nhóm COOCH3 với giá trị δ 53,0 Phổ khối ESI-MS của hợp chất 2 cho thấy tín hiệu tại m/z 946, tương ứng với ion phân tử [M+Na]+ của C48H76O18 (M0) Qua các phân tích và so sánh với dữ liệu từ tài liệu tham khảo [21; 22] về araloside A methyl ester, chúng tôi xác nhận rằng hợp chất 2 chính là araloside A methyl ester (Hình 7), một saponin chưa được công bố từ sâm vũ diệp.
3.3 Phân tích định tính và dấu vân tay hoá học của các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tham khảo các tài liệu [11] chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký đểphân tích định tính 2 saponin phân lập đƣợc nhƣ sau:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity
- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 x 100 mm; cỡ hạt 3,5 àm)
- Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/min
- Thể tớch bơm mẫu: 20 àl
- Dung môi pha mẫu: Methanol
- Pha động: acid acetic 0,5 %/H2O (A) – acetonitrile (B) theo chương trình gradient trong 30 phút: (0-5 phút: 80 % A, 5-15 phút :80-60 % A, 25-30 phút: 80 % A)
Để pha mẫu chất sạch 1 và 2, cần sử dụng cân phân tích để cân chính xác khoảng 1,0 mg mỗi chất Sau đó, pha thành dung dịch gốc với nồng độ 1,0 mg/mL (1000 ppm) trong methanol Tiếp theo, siêu âm trong 10 phút và lọc qua màng lọc 0,45 µm Cuối cùng, pha loãng dung dịch thành nồng độ 500 ppm để sử dụng cho sắc ký HPLC.
Để pha mẫu cao saponin tổng, cần cân chính xác khoảng 50,0 mg cao n-butanol từ sâm vũ diệp Sau đó, hòa tan trong methanol với nồng độ 50,0 mg/ml, siêu âm trong 10 phút và lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Hình 8 S ắc ký đồ HPLC c ủ a hai saponin phân l ập đượ c 1 (A), 2 (B) và cao butanol c ủ a SVD
Kết quả phân tích HPLC cho thấy chất 1 và chất 2 là các hợp chất tự nhiên trong SVD, với thời gian lưu lần lượt là 15,565 phút và 16,577 phút trong dung dịch butanol Diện tích pic trên sắc ký đồ HPLC chỉ ra rằng hai hợp chất này là hai saponin chính trong thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa, đặc biệt là stipuleanoside R2 Hai hợp chất này có thể được xem là chất đánh dấu hoá học của SVD.
Bàn lu ậ n
V ề x ử lý chi ế t m ẫ u và phân l ậ p ch ấ t tinh khi ế t
Phương pháp chiết hồi lưu đơn giản với nhiệt độ 70ºC sử dụng dung môi ethanol cho phép thu được cắn toàn phần Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là tăng tốc độ chiết, giúp hoạt chất trong dược liệu được chiết kiệt một cách hiệu quả.
Dung môi chiết EtOH 70% là lựa chọn hiệu quả để chiết xuất hầu hết các hoạt chất trong dược liệu nhờ vào tính chất giá cả phải chăng, dễ tìm, ít độc hại và khả năng chiết ở nhiệt độ cao Đề tài này áp dụng phương pháp sắc ký cột pha thường và sắc ký cột pha đảo, hai kỹ thuật phổ biến tại Việt Nam cho việc phân lập các chất Chất hấp phụ dễ kiếm và quy trình thực hiện đơn giản hơn so với các phương pháp phân lập khác.
Từ cao chiết toàn phần, các phân đoạn được chiết bằng phương pháp chiết lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần như ether, ethyl acetat và n-butanol, thu được các phân đoạn với khối lượng lần lượt là 1,26% (ether), 0,59% (EtOAc) và 4,71% (BuOH) so với nguyên liệu khô ban đầu Sau khi loại bỏ tạp chất không cần thiết, phân đoạn BuOH được lựa chọn để phân lập vì đây là phân đoạn giàu saponin nhất.
Xác đị nh c ấ u trúc các h ợ p ch ấ t
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập thành công hai hợp chất mới từ sâm vũ diệp (SVD) tại Việt Nam, bao gồm stipuleanosid R2 và aralosid A methyl ester, dựa trên dữ liệu phổ khối (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Mặc dù dạng methyl ester của stipuleanosid R2 đã được công bố trong nghiên cứu trước, aralosid A methyl ester cũng đã được tìm thấy trong các loài khác thuộc chi sâm Phân tích HPLC cho thấy hai hợp chất này là saponin chính trong thân rễ sâm vũ diệp thu hái tại Sa Pa, đặc biệt stipuleanosid R2 có thể được coi là chất đánh dấu hóa học cho loài này Những phát hiện này đóng góp quan trọng vào cơ sở dữ liệu hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu sâm vũ diệp, đồng thời làm nền tảng cho các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của chúng.
Nghiên cứu cho thấy thành phần saponin của sâm vũ diệp thuộc nhóm oleanane, tương tự như saponin của tam thất hoang Các hoạt tính sinh học của stipuleanosid R2 và araloside A methyl ester đã được công bố, cho thấy chúng có tác dụng gây độc tế bào và hạ đường huyết.
Xây d ự ng d ấ u vân tay s ắc ký dƣợ c li ệ u SVD b ằ ng HPLC
Dựa trên tài liệu tham khảo [11] và các điều kiện hiện có, chúng tôi đã xác định được chương trình sắc ký phù hợp cho hai hợp chất saponin đã được phân lập.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity
- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 x 100 mm; cỡ hạt 3,5 àm)
- Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/min
- Dung môi pha mẫu: Methanol
- Pha động: acid acetic 0,5 %/H2O (A) – acetonitrile (B) theo chương trình gradient trong 30 phút: (0-5 phút: 80 % A, 5-15 phút :80-60 % A, 25-30 phút: 80 % A)
Dưới điều kiện sắc ký nêu trên, các chất trong mẫu thử từ dịch chiết n-butanol của thân rễ SVD được tách biệt một cách hiệu quả, với các đỉnh sắc ký cân đối và thời gian lưu hợp lý.
Chương trình sắc ký mà chúng tôi phát triển cho phép phân tích định tính và định lượng hai hợp chất trong SVD.
Việc này rất có ý nghĩa để phân tích hàm lƣợng saponin trong SVD, góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho dƣợc liệu SVD
Khi quan sát bằng mắt thường, việc phân biệt chính xác giữa các loài sâm vũ diệp, tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng) và sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha) không phải lúc nào cũng dễ dàng.
Nghiên cứu cho thấy rằng hai saponin chính, stipuleanosid R2 và araloside A methyl ester, phân lập từ sâm vũ diệp có cấu trúc khung oleanan, khác với saponin chủ yếu của Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grush) có cấu trúc dammarane Do đó, dữ liệu “dấu vân tay HPLC” rất quan trọng để xác định nhanh mẫu sâm vũ diệp và phân biệt các loài có hình thái tương tự, giúp tránh nhầm lẫn dược liệu Mặc dù mục tiêu này chưa hoàn toàn đạt được do thời gian hạn chế, chúng tôi sẽ tiếp tục nỗ lực hoàn thiện trong thời gian tới.
Do sự biến đổi của hàm lượng các thành phần trong dược liệu SVD theo tuổi, mùa vụ, địa điểm trồng trọt và phân bố, không phải lúc nào cũng đạt được sự trùng khớp 100% giữa các đỉnh Tuy nhiên, sự phù hợp có thể được đánh giá khi có sự trùng khớp hầu hết các đỉnh, đặc biệt là các đỉnh chủ yếu.
K ế t lu ậ n và ki ế n ngh ị
K ế t lu ậ n
Qua thời gian nghiên cứu đề tài chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả theo các mục tiêu nghiên cứu đã đề ra nhƣ sau:
- Đã chiết xuất và phân lập đƣợc hai hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n-BuOH của SVD
Cấu trúc của hai hợp chất stipuleanoside R2 và araloside A methyl ester đã được xác định thông qua các phương pháp vật lý và phổ, bao gồm phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân Việc so sánh với dữ liệu công bố trong tài liệu tham khảo cho thấy đây là lần đầu tiên hai hợp chất này được phân lập tại SVD ở Tây Bắc Việt Nam.
Đã phát triển thành công phương pháp HPLC cho hai chất, mang lại ý nghĩa quan trọng trong phân tích định tính và xây dựng dấu vân tay sắc ký Kết quả này giúp định lượng thành phần hoá học, đặc biệt là saponin trong SVD Mặc dù mục tiêu ban đầu chưa hoàn thành, nhưng những kết quả bước đầu này sẽ là nền tảng cho các bước tiếp theo nhằm hoàn thiện dấu vân tay sắc ký một cách đầy đủ hơn.
Ki ế n ngh ị
Đề tài này là một phần trong đề tài cấp nhà nước thuộc chương trình Tây Bắc
Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ nhằm phát triển nguồn nguyên liệu và sản phẩm từ hai loài cây thuốc sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tgam thất hoang (Panax stipuleanatus H Tsai et K.M) của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là nội dung nghiên cứu quan trọng Khóa luận này tập trung vào thành phần hóa học của SVD, với những kết quả tiềm năng và hứa hẹn Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu để khai thác tối đa giá trị của các loài cây này.
- Nghiên cứu thành phần hoá học của phân đoạn e-te còn lại hoặc ở các bộ phận khác của cây SVD
- Xây dựng dấu vân tay sắc ký hoàn chỉnh phục vụ cho công tác tiêu chuẩn hoá dƣợc liệu SVD
1 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 2,
NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 711 - 714
2 Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, Thực vật học 2007, NXB Y học, Hà Nội, tr 285-286
3 Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ, Tài liệu sau Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội
4 Bộ môn hoá phân tích (2006), Trường Đại học Dược Hà Nội, Hoá phân tích
5 Nguyễn Thƣợng Dong (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
6 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr 8-99, 162-196, 234-242
7 Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc Gia, Hà Nội
8 Đỗ Văn Hào, Nguyễn Thị Huệ, Nguyễn Thị Thu Thủy, Đặng Thị Ngần, Đào
Nghiên cứu của Thị Hồng Bích, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Dương Thị Ly Hương và Nguyễn Hữu Tùng (2017) đã chỉ ra thành phần hóa học của phân đoạn ethyl acetat từ rễ cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai Kết quả nghiên cứu được công bố trong Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, tập 33, số 2, trang 50-55.
9 Trần Công Luận, (2002), Phân tích thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng), Đề tài cấp Bộ, tr 1-65
10 Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên và cộng sự (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng)", Tạp chí Dược liệu,
11 Nguyễn Thị Bích Ngọc (2014), Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp- Trường ĐH Dược Hà Nội.
12 Nguyễn Văn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 10(3), tr 71-76
13 Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền (2006), "Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh thái sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr 177-180
14 Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiêu năng cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm Bộ y tế.
15 Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T sai et K M Feng) trên in vitro, Khoá luận tốt nghiệp đại học, Khoa y dƣợc, ĐHQGHN.
16 Viện Dƣợc liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 199 – 222; 493 – 685
17 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng (2007), Bộ y tế, Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107 – 113, 216-250
18 Vụ khoa học và đào tạo (2007), Bộ y tế, Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB y học, tr 79-82, 84-110
19 Agrawal PK (1992), "NMR spectroscopy in the structural elucidation of oligossacharides and glycosides", Phytochemistry, 31, pp 1307-1330
20 Chun Liang, Yan Ding et al (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-Κb", Journal of Ginseng Research, 37(1), pp 74-79
21 Hu M, Ogawa K et al (1995), "Triterpenoid glucuronide saponins from root bark of Aralia armata", Phytochemistry, 39, pp 179-184
22 Liang C, Ding Y, et al (2010), "Oleanane –type triterpenoids from Panax stipuleannatus and their anticancer activities", Bioorg Med Chem Lett., 20, pp
23 Mahato S, Kundu A (1994), " 13 C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-a complication and some salient features", Phytochemistry, 37, pp 1517-1575
24 Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anti- cancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database",
25 Tung NH, Quang TH et al (2011), "Oleanolic triterpenesaponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-
26 Wang D.Q., Feng B.S et al (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains
China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636
27 Yang W Z, Hub Y., Wu W Y., et al (2014), “Saponins in the genus Panax L
(Araliaceae): A systemic review of their chemical diversity”, Phytochemistry,
28 Yoshikawa M, Murakami T et al (1996), "Bioactive saponins and glycosides
VII On the hypoglycemic principles from the root cortex of Aralia elata
Seem.: Structure related hypoglycemic activity of oleanolic acid oligoglycoside", Chem Pharm Bull, 44(10), pp 1923-1927
