Khóa luận nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng)

TỔNG QUAN

Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp

Sâm vũ diệp, hay còn gọi là Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất và Vũ diệp tam thất, có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., thuộc họ Nhân Sâm - Araliaceae.

Sâm vũ diệp là cây thảo sống lâu năm với rễ dài có nhiều đốt và dấu vết do thân rụng hàng năm Cây có thân mảnh cao từ 10-50 cm, thường lụi vào mùa khô Lá của cây là lá kép chân vịt, mọc vòng ba cái một, với 3-7 lá chét mỏng, không lông và mép có răng đôi cạn hoặc sâu Hoa của sâm vũ diệp có màu trắng lục, xếp thành tán đơn với 20-30 bông trên một trục dài 15-20 cm ở ngọn thân, cuống hoa dài khoảng 1 cm Quả của cây khi chín có màu đỏ và chứa 1-2 hạt.

Tam thất hoang, còn được biết đến với các tên như Tam thất rừng, Dã tam thất, Bình biên tam thất và Thổ tam thất, có tên khoa học là Panax stipuleanatus H T Tsai et.

K M Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], cây thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh Mỗi khóm thường có một thân mang lá Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5-10 cm Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm Hoa màu vàng xanh với năm lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2cm, khi chín màu đỏ Hạt 1 hoặc 2, màu xám trắng [4, 25]

Sâm vũ diệp và Tam thất hoang là hai loài thực vật có hình thái tương đối giống nhau, nhưng điểm khác biệt nổi bật là Sâm vũ diệp có lá xẻ thùy, trong khi Tam thất hoang không có đặc điểm này.

Hình 1.1 Sâm vũ diệp Hình 1.2 Tam thất hoang

1.1.2 Thực trạng và phân bố

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được Seemann phát hiện lần đầu tiên tại vùng núi Hymalaya của Ấn Độ và được công bố năm 1868 trên tạp chí J

Sâm vũ diệp, một loài thực vật quý, chủ yếu phân bố ở Trung Quốc, bắc Myanma, đông bắc Ấn Độ và Nepal Tại Việt Nam, loài này có sự phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng Liên Sơn, bao gồm các khu vực Sapa, Bát Xát (Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu).

Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên thế giới ( khoảng

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) được hai nhà khoa học người Trung Quốc công bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica

Loài Sinica được phát hiện lần đầu tiên tại khu rừng Mã Quan, Trung Quốc, ở độ cao từ 1100-1700 m so với mực nước biển Hiện nay, loài này chỉ được tìm thấy tại tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một số khu vực trong Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn, tỉnh Lào Cai, Việt Nam.

Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang phân bố tự nhiên chủ yếu ở sườn tây bắc dãy Hoàng Liên Sơn, trong khu vực của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và Sa Pa, tỉnh Lào Cai Phạm vi phân bố của chúng rất hạn chế, với các quần thể nhỏ trong tự nhiên Gần đây, Sâm vũ diệp đã được thuần hóa và thử nghiệm trồng tại một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai.

1.1.3 Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang

Theo Đông y, Tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng và tính ấm, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như bổ dưỡng, cường tráng, tiêu viêm, giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu Tất cả các bộ phận của cây đều có thể sử dụng làm thuốc, trong đó thân rễ thường được dùng để bổ sung dinh dưỡng, cầm máu, tăng cường sinh dục và giảm stress Lá, nụ và hoa có thể chế biến thành trà, giúp kích thích tiêu hóa và an thần.

Sâm vũ diệp có vị đắng, nhạt, tính hàn, mang lại nhiều lợi ích như tư bổ cường tráng, tiêu viêm, giảm đau, và cầm máu Thân rễ và rễ củ của cây được sử dụng để điều trị các loại vết thương và xuất huyết, đồng thời là thuốc bổ cho những người thiếu máu, đặc biệt là phụ nữ sau sinh Ngoài ra, sâm vũ diệp còn có tác dụng kích thích sinh dục và hỗ trợ điều trị vô sinh Tại Vân Nam, Trung Quốc, rễ củ được dùng để chữa thổ huyết, chảy máu mũi, và các chấn thương gây đau lưng.

Nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy cao Tam thất hoang và Sâm vũ diệp có khả năng phục hồi giấc ngủ bị rút ngắn do stress với các liều 44, 88, và 176 mg/kg Cao saponin toàn phần của Tam thất hoang có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA ở nồng độ 25, 50, và 100 µg/mL Năm 2009, Viện Dược liệu cũng đã chỉ ra rằng phân đoạn saponin của Tam thất hoang có hoạt tính chống oxy hóa lipid peroxidation, và dịch chiết ethanol tổng hợp có tác dụng chống trầm cảm ở liều 44-176 mg/kg trên chuột.

Nghiên cứu của Lê Thị Tâm năm 2017 cho thấy Sâm vũ diệp có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro Các phân đoạn tổng, n-butanol và etylacetat đều cho thấy tác dụng ở các mức liều 0,5-1-2.

Tam thất hoang có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro với các phân đoạn và mức liều khác nhau Cụ thể, phân đoạn tổng cho hiệu quả ở mức liều 1-2-5 mg/mL, phân đoạn n-butanol hiệu quả nhất ở mức liều 5 mg/mL, và phân đoạn n-hexan có hiệu quả ở các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL.

Nghiên cứu thành phần hóa học của lá và thân rễ Sâm vũ diệp cho thấy sự hiện diện của nhiều saponin thuộc khung dammaran và oleanan Năm 1989, Trung Quốc đã phân lập 13 saponin khung dammaran, trong đó có hai saponin mới là bipinnatifidusoside F1 và F2, cùng với 11 saponin đã biết từ lá khô của Sâm vũ diệp thu thập ở dãy núi Qinling Các saponin đã biết bao gồm ginsenosid F1, F2, F3 và Rg2.

Re, Rd, Rb1, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1 [44]

Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc đã phân lập và xác định cấu trúc 10 saponin khung oleanan từ thân rễ Sâm vũ diệp tại Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới là bifinosid A-C và 7 hợp chất đã biết như narcissiflorine methyl ester, chikusetsusaponin IVa, và pseudoginsenoside RP1 methyl ester Đến năm 2015, Viện Dược liệu đã nghiên cứu thành phần hoá học của Sâm vũ diệp, phân lập được hỗn hợp saponin bao gồm stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid, β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid, glycosphingolipid và dichaccarid saccharose, cùng với saponin 28-desglucosylchikusetsusapnin IV từ phân đoạn chiết ethyl acetat Đây là lần đầu tiên một số hợp chất này được công bố.

Sinh lý học tiểu cầu

Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, không có nhân, với đường kính từ 3-4 micromet Chúng được sản xuất từ mẫu tiểu cầu, bắt nguồn từ tế bào nguồn dòng tủy do tế bào gốc sinh máu tạo ra Mỗi mẫu tiểu cầu có khả năng tạo ra khoảng 3000 tiểu cầu.

Tiểu cầu trong máu ngoại vi có nồng độ khoảng 150 - 450 × 10^9/L và có tuổi thọ ngắn, chỉ từ 8-14 ngày Hiện tại, tiểu cầu có thể được bảo quản ngoài cơ thể trong 7 ngày ở nhiệt độ 20-22 °C với điều kiện lắc liên tục.

Tiểu cầu có một cấu trúc phức tạp gồm 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu bào quan và khu màng

Khu ngoại vi của tiểu cầu bao gồm lớp màng kết nối với hệ thống ống mở, trong đó màng tiểu cầu được cấu tạo từ hai lớp lipid Màng này chứa các glycoprotein quan trọng, hoạt động như các receptor bề mặt, có vai trò thiết yếu trong quá trình đông máu.

Glycoprotein Ib (GPIb) là protein xuyên màng giúp tiểu cầu dính vào collagen thông qua yếu tố von Willebrand (wWF), đánh dấu bước đầu tiên trong quá trình đông cầm máu Glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) là protein màng phụ thuộc vào ion canxi, liên kết với fibrinogen để tiểu cầu ngưng tập và hình thành đinh cầm máu Phospholipid điện tích âm, đặc biệt là phosphatidylserine (PS), đóng vai trò quan trọng trong đông máu, là nền tảng cho phản ứng enzym tiểu cầu tạo ra thromboxan A2 (TXA2), một sản phẩm quan trọng trong hoạt hóa tiểu cầu và quá trình ngưng tập Màng tiểu cầu có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong.

Hình 1.3 Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [29]

Hệ thống kênh mở trong tiểu cầu bao gồm các không bào, giúp tăng diện tích bề mặt và cho phép các hạt tiểu cầu phóng thích chất qua các kênh này Hệ thống ống dẫn từ bào tương ra lớp màng ngoài tạo nên các lỗ nhỏ trên bề mặt tiểu cầu, đóng vai trò như đường dẫn cho các chất từ môi trường bên ngoài vào tế bào chất, đồng thời là nơi giải phóng các chất từ hạt khi tiểu cầu bị hoạt hóa.

Khu sol-gel nằm dưới khu ngoại vi, bao gồm các vi ống và vi sợi, trong đó vi ống sát màng tiểu cầu tạo khung đỡ và tham gia vào hoạt động co rút khi tiểu cầu bị kích thích Vi sợi, bao gồm các sợi actin, liên kết chặt chẽ với vi ống và tham gia vào quá trình tạo giả túc của tiểu cầu Ngoài ra, khu sol-gel còn chứa glycogen.

Khu bào quan bao gồm các loại hạt và thành phần tế bào như lysosom và ty thể, đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất Những bào quan này không chỉ tham gia vào việc dự trữ enzym mà còn chứa một lượng lớn các chất thiết yếu cho chức năng của tiểu cầu.

Platelet granules contain various essential substances, including ADP, ATP, GDP, GTP, serotonin, histamine, calcium, magnesium, pyrophosphate, and other nucleotides, which are released upon platelet activation The γ-granules (lysosomal granules) house enzymes such as galactosidase, fucosidase, hexosaminidase, and glucuronidase α-granules are rich in adhesive proteins like fibrin, fibronectin, vWF, thrombospondin, thromboglobulin, and vitronectin, as well as growth factors like platelet-derived growth factor (PDGF) and connective tissue activating peptide (CTAP) They also contain platelet factor 4, coagulation factors including factor V, kininogen, fibrinogen, factor XI, protein S, and plasminogen activation inhibitors λ-granules play a crucial role in dissolving blood clots during the later stages of vascular recovery.

Khu vực màng của tiểu cầu chứa hệ thống ống dày đặc, giữ vai trò quan trọng trong việc dự trữ canxi một cách chọn lọc Đồng thời, đây cũng là nơi tổng hợp các enzyme cyclooxygenase và prostaglandin.

Hình 1.4 Cấu trúc của tiểu cầu [29]

Chức năng chính của tiểu cầu là làm vững bền mạch máu, tạo nút cầm máu ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [17, 29]

1.2.2.1 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu

Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không gắn kết với nội mô mạch máu nguyên vẹn Khi tế bào nội mô bị tổn thương, tiểu cầu nhanh chóng tham gia vào các phản ứng phối hợp tinh vi, dẫn đến việc hình thành một nút tiểu cầu tại vị trí tổn thương.

Quá trình chuyển đổi tiểu cầu từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt hóa diễn ra liên tục và có thể được phân chia thành ba bước chính: bám dính, kết tập và phóng thích các chất.

Tiểu cầu bám vào các bề mặt lạ của tổ chức dưới nội mạc khi mạch máu bị tổn thương (in vivo) hoặc bề mặt thủy tinh và lam kính trong môi trường ống nghiệm (in vitro) [17].

Trong các mạch máu khỏe mạnh, tiểu cầu được duy trì ở trạng thái không hoạt động nhờ vào oxid nitric và prostacyclin từ tế bào nội mô Tế bào nội mô cũng chứa ADPase, giúp ức chế quá trình kích hoạt ADP Khi mạch máu bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị mất và lớp dưới nội mô với các protein dính như collagen, yếu tố von Willebrand, fibronectin, và laminin sẽ lộ ra Yếu tố von Willebrand (vWF) đóng vai trò quan trọng trong việc tạo điều kiện cho sự bám dính ban đầu của tiểu cầu thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V, một thụ thể quan trọng trong quá trình này.

Màng tiểu cầu và vWF có vai trò quan trọng trong việc bám dính của tiểu cầu khi dòng máu cao, trong khi ở tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính chủ yếu qua liên kết collagen với GPIa/IIa Những tương tác này giúp tiểu cầu lưu thông chậm lại, tạo điều kiện cho sự tương tác và ràng buộc giữa các cặp thụ thể - phối tử, dẫn đến bám dính tĩnh Đặc biệt, sự tương tác giữa collagen và GPVI kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa vWF và collagen tạo ra các liên kết mạnh mẽ với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, trong khi fibrinogen liên kết với GPIIb/IIIa giúp giữ tiểu cầu tại chỗ.

Tiểu cầu tập trung thành nút qua hiện tượng dính, được kích hoạt và tạo điều kiện cho ngưng tập Ngưng tập tiểu cầu đặc trưng bởi sự tích tụ của chúng vào một nút cầm máu, với các thụ thể GPIIb/IIIa đóng vai trò trung tâm, liên kết tiểu cầu thông qua cầu fibrinogen Tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng 4.000-5.000 phức hợp GPIIb/IIIa, nhưng trong trạng thái không hoạt động, các thụ thể này không thể gắn với fibrinogen và các yếu tố khác Khi tiểu cầu được hoạt hóa, GPIIb/IIIa trở thành thụ thể cho fibrinogen, tạo cầu nối giữa các tiểu cầu, dẫn đến ngưng tập và tiếp tục kích hoạt Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa diễn ra liên tục cho đến khi hình thành nút tiểu cầu.

Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu

Hiện nay, có nhiều phương pháp đánh giá chức năng tiểu cầu, bao gồm đo thời gian máu chảy, sức bền mao mạch, đếm số lượng tiểu cầu, co cục máu đông, độ dính tiểu cầu và độ ngưng tập tiểu cầu.

Khi mạch máu bị tổn thương, máu sẽ chảy ra ngoài và hệ thống cầm máu sẽ được kích hoạt, bao gồm vai trò của thành mạch và tiểu cầu Nếu hoạt động cầm máu không hiệu quả, thời gian để cầm máu sẽ kéo dài Xét nghiệm thời gian máu chảy được thực hiện bằng cách tạo ra tổn thương mạch máu và đo thời gian từ khi máu bắt đầu chảy cho đến khi ngừng chảy.

Phương pháp Duke sử dụng kim chủng để tạo ra một vết thương nằm ngang ở giữa dái tai và tiến hành đo thời gian chảy máu Giá trị bình thường của thời gian này là

Phương pháp Ivy đo thời gian máu chảy từ các vết thương ở mặt duỗi cẳng tay dưới áp suất cố định, với trị số bình thường từ 4 đến 8 phút.

Phương pháp Borchgrevink có trị số bình thường từ 7-10 phút [23]

1.3.2 Đo sức bền mao mạch

Có 2 phương pháp, nhưng phương pháp giảm áp ít dùng hơn phương pháp tăng áp: dùng huyết áp kế, duy trì lực bằng trung bình cộng giữa huyết áp tối đa và tối thiểu trong vòng 10 phút sau đó tháo hơi nhanh Đếm số nốt xuất huyết ngay dưới vùng dưới da nếp khuỷu Nếu trên 7 nốt xuất huyết là dương tính Sức bền

Giảm mao mạch có thể xảy ra trong một số bệnh lý như giảm tiểu cầu, viêm thành mạch dị ứng, và viêm thành mạch do độc tố Bệnh von-Willebrand và rối loạn chức năng tiểu cầu cũng liên quan đến tình trạng này Ngoài ra, hiện tượng giảm mao mạch còn có thể xuất hiện ở người già, những người thiếu vitamin C, hoặc do yếu tố di truyền.

1.3.3 Đếm số lượng tiểu cầu

Hiện nay, phương pháp đếm tiểu cầu phổ biến tại các bệnh viện là sử dụng máy dựa trên nguyên lý trở kháng hoặc laser, với trị số bình thường từ 150.000 đến 300.000/mm³ Sự giảm số lượng tiểu cầu có thể xảy ra do các nguyên nhân như xuất huyết do giảm tiểu cầu miễn dịch, suy tủy xương, leucemie cấp và sốt xuất huyết Ngược lại, số lượng tiểu cầu tăng có thể gặp trong các trường hợp như tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt và đa hồng cầu tiên phát.

1.3.4 Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm Giêmsa

Rất cần thiết phải làm đặc biệt ở các trường hợp nghi ngờ bệnh lý tiểu cầu

Tiểu cầu thường có màu đỏ tím, không có nhân và có các hạt màu đỏ, thường đứng thành cụm nếu máu chưa qua chống đông Nồng độ tiểu cầu tăng cao có thể thấy trong các tình trạng như tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt và đa hồng cầu tiên phát Ngược lại, nồng độ tiểu cầu giảm có thể gặp trong suy tuỷ xương và leucemie cấp.

Kỹ thuật Budtz-Olzen là phương pháp lâm sàng phổ biến để đánh giá sự co cục máu, thông qua việc quan sát cục máu đông sau 2 giờ Nguyên lý của phương pháp này dựa trên quá trình đông máu, trong đó máu ra khỏi thành mạch sẽ chuyển thành dạng rắn nhờ sự hình thành các sợi fibrin Các sợi fibrin tạo thành mạng lưới ôm lấy các thành phần hữu hình và co rút lại, tạo nên cục máu đông tách biệt với phần huyết thanh Cục máu đông co hoàn toàn phản ánh tình trạng bình thường của fibrinogen và tiểu cầu, cả về số lượng và chất lượng Ngược lại, cục máu không co hoặc co không hoàn toàn cho thấy sự bất thường của tiểu cầu và/hoặc fibrinogen, với mức độ bất thường càng nặng thì cục máu càng không co.

Xét nghiệm co cục máu phụ thuộc vào số lượng và chất lượng tiểu cầu, lượng fibrinogen, yếu tố VIII và hematocrit [16, 23]

1.3.6 Đo độ dính tiểu cầu

Phương pháp Borchrevink được sử dụng để đo độ dính tiểu cầu in vivo bằng cách lấy máu và đếm tiểu cầu tại vết thương theo các khoảng thời gian đều đặn, với trị số bình thường dao động từ 20-40% Đối với in vitro, có ba phương pháp chính: Salzman, Bowie và Hellem, nhằm đo độ dính tiểu cầu sau khi cho máu hoặc huyết tương qua cột bi thủy tinh Độ dính tiểu cầu có thể giảm trong các bệnh như Von-Willebrand, một số rối loạn chức năng tiểu cầu, khi sử dụng thuốc giảm đau hoặc sau khi truyền Dextran Ngược lại, độ dính tiểu cầu tăng trong các tình trạng bệnh lý huyết khối, tiểu đường, hút thuốc lá, cũng như sau phẫu thuật, sau sinh hoặc sau chấn thương, đặc biệt là sau cắt lách.

1.3.7 Đo độ ngưng tập tiểu cầu

Có nhiều kỹ thuật đo độ ngưng tập tiểu cầu, chủ yếu dựa trên nguyên lý rằng mật độ quang của huyết tương giàu tiểu cầu tỷ lệ thuận với nồng độ tiểu cầu Khi thêm chất gây ngưng tập như ADP hay adrenalin vào huyết tương, hiện tượng ngưng tập tiểu cầu xảy ra, làm giảm nồng độ tiểu cầu dưới dạng phân tử riêng lẻ và tăng mật độ quang học Việc ghi nhận hình ảnh quá trình thay đổi mật độ quang giúp xác định đặc điểm của quá trình ngưng tập tiểu cầu.

Hình 1.7 Nguyên lí của xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu

(PPP: huyết tương nghèo tiểu cầu, PRP: huyết tương giàu tiểu cầu)

Phương pháp đo quang sử dụng thiết bị quang phổ kế với bước sóng cố định để đo độ ngưng tập tiểu cầu Một chùm ánh sáng đỏ chiếu qua huyết tương giàu tiểu cầu và một chùm khác qua huyết tương nghèo tiểu cầu Mẫu huyết tương giàu tiểu cầu được dùng để thiết lập điểm chuẩn với độ dẫn truyền ánh sáng 0%, trong khi huyết tương nghèo tiểu cầu thiết lập điểm chuẩn với độ dẫn truyền 100% Khi thêm các chất kết tập như ADP, collagen, thrombin, epinephrin, acid arachidonic, và ristocetin vào huyết tương giàu tiểu cầu, hiện tượng ngưng tập tiểu cầu xảy ra, làm tăng độ dẫn truyền ánh sáng Kết quả được thể hiện bằng % độ dẫn truyền ánh sáng của huyết tương giàu tiểu cầu khi tiểu cầu đã ngưng tập tối đa.

Các thuốc kháng tiểu cầu

Tiểu cầu đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh huyết khối, với sự hoạt hóa tiểu cầu bao gồm dính, ngưng tập và phóng thích các yếu tố nội tiểu cầu, tạo điều kiện cho sự hình thành huyết khối Do đó, liệu pháp kháng tiểu cầu ngày càng được chú trọng trong điều trị dự phòng và chống hình thành huyết khối Thuốc kháng tiểu cầu giúp ức chế quá trình kết dính và ngưng tập tiểu cầu, nhằm ngăn ngừa tắc mạch Hiện nay, có nhiều loại thuốc kháng tiểu cầu với cơ chế khác nhau như Aspirin, Ticlopidin, Clopidogrel và Prasugrel được sử dụng để điều trị.

1.4.1 Nhóm ức chế men Cyclo-oxygenase: Aspirin

Aspirin được coi là thuốc kháng tiểu cầu hàng đầu và được sử dụng rộng rãi

Aspirin hoạt động bằng cách ức chế men cyclooxygenase 1 (COX-1), ngăn chặn sự hình thành Thromboxan A2 (TXA2) và từ đó ức chế ngưng tập tiểu cầu Hiệu quả này rất mạnh và kéo dài suốt vòng đời của tiểu cầu, vì tiểu cầu không thể tổng hợp thêm men mới Ngoài ra, Aspirin cũng ức chế sự tổng hợp prostaglandin kháng đông PGI2 từ tế bào nội mạc thông qua việc ức chế men prostacyclin synthetase, tuy nhiên tác dụng này yếu hơn và không kéo dài do tế bào nội mạc có khả năng tổng hợp men mới Aspirin có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu với các chất như collagen, ADP và epinephrin.

1.4.2 Nhóm ức chế ADP Receptor (nhóm Thienopyridin)

Ticlopidin hoạt động bằng cách ức chế sự kết dính tiểu cầu thông qua tương tác với glycoprotein IIb/IIIa receptor của fibrinogen, ngăn cản fibrinogen gắn vào tiểu cầu đã được kích hoạt Ngoài ra, thuốc còn làm tăng nồng độ prostaglandin D2 và E2, giúp chống đông vón tiểu cầu và kéo dài thời gian chảy máu Tuy nhiên, Ticlopidine hiện nay ít được sử dụng do một số tác dụng phụ nghiêm trọng như giảm bạch cầu hạt, có thể dẫn đến tử vong, suy tủy và tắc mật.

Clopidogrel là một tiền thuốc không có hoạt tính kháng tiểu cầu Sau khi hấp thu ở ruột, khoảng 85% lượng thuốc sẽ được chuyển hóa bởi các enzym esterase thành các chất không có hoạt tính, trong khi 15% còn lại được chuyển hóa qua hệ enzym cytochrome P-450 tại gan thành chất có hoạt tính ức chế thụ thể P2Y12 trên bề mặt tiểu cầu Điều này ngăn cản ADP gắn vào thụ thể, dẫn đến việc tiểu cầu không được hoạt hóa.

Prasugrel là thuốc mới nhất thuộc nhóm Thienopyridin, có khả năng ức chế kết tập tiểu cầu hiệu quả Sau khi vào ống tiêu hóa, prasugrel nhanh chóng bị thủy phân bởi esterase trong ruột và máu thành chất chuyển hóa trung gian Chất này sau đó được chuyển đổi thành chất chuyển hóa có hoạt tính nhờ enzym cytochrome P450, có khả năng ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 của tiểu cầu Nhờ đó, prasugrel khắc phục được nhược điểm của clopidogrel, mang lại tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu mạnh mẽ, nhanh chóng và ổn định hơn.

Thuốc ức chế P2Y12 không thuộc nhóm thienopyridin là một loại thuốc ức chế trực tiếp có khả năng hồi phục thụ thể P2Y12 của tiểu cầu Đây là một loại thuốc đầy triển vọng được chứng minh qua nghiên cứu PLATO (Nghiên cứu Ức chế Tiểu cầu và Kết quả Điều trị).

1.4.3 Cá c thuốc ức chế thụ thể Glycoprotein IIb/IIIa của tiểu cầu

Abciximab, Eptifibatide và Tirofiban là các thuốc ức chế glycoprotein IIb/IIIa, có tác dụng ngăn chặn các liên kết chéo giữa các tiểu cầu do fibrin, từ đó ức chế quá trình hình thành huyết khối.

1.4.4 Thuốc làm tăng AMP vòng tiểu cầu

Dipyridamol là một chất ức chế phosphodiesterase, giúp ngăn chặn sự phân hủy của AMP vòng Nhờ đó, nồng độ AMP vòng tăng lên, từ đó ngăn cản quá trình ngưng tập, phóng thích và kết dính tiểu cầu.

22] Thuốc có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu nhưng không làm kéo dài thời gian chảy máu [23]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

Mẫu Sâm vũ diệp toàn cây tươi thu hái ở Sa Pa – Lào Cai vào tháng 3 năm

Năm 2016, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được giám định bởi các chuyên gia thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Phần dưới mặt đất của cây được rửa sạch, thái lát mỏng, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 40-50 °C để đạt độ ẩm dưới 10 % Sau khi xay nhỏ, mẫu được bảo quản trong túi nilon Để chiết xuất, dược liệu được ngâm trong dung môi EtOH 50 % với tỷ lệ 7:1 ở nhiệt độ 90 °C, thực hiện chiết 2 giờ mỗi lần và lặp lại 3 lần cho mỗi mẻ Dịch chiết cồn 50 % thu được sẽ được cô đặc dưới áp suất giảm cho đến khi tạo thành cao lỏng với tỷ lệ 1:1.

Cao chiết toàn phần của Sâm vũ diệp chứa nhiều tạp chất như hợp chất ít phân cực, dầu béo và saccarid tan trong nước Để loại bỏ các tạp chất này, phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với n-hexan theo tỷ lệ 1:1 được thực hiện ba lần, sau đó cất thu hồi dung môi n-hexan để tái sử dụng Lớp nước sau chiết lỏng-lỏng sẽ chứa toàn bộ lượng saponin đã được loại bỏ dầu béo và tạp chất thân dầu Cuối cùng, để loại bỏ các thành phần saccarid tan trong nước, sử dụng sắc ký hấp phụ với resin diaion HP-20 và rửa giải bằng EtOH 96%.

Sau khi thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, cao đặc được sấy chân không ở nhiệt độ 55-60 °C trong 24 giờ Sau đó, sử dụng máy xay dược liệu để nghiền cao thành dạng bột và rây qua sàng 355, thu được cao khô định chuẩn giàu saponin của Sâm vũ diệp Sản phẩm này được bảo quản trong túi nilon kín ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Các phân đoạn chiết cao khô định chuẩn này được thực hiện tại bộ môn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Hữu Tùng.

Hình 2.1 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp [27]

Mẫu toàn cây tươi Tam thất hoang thu hái ở Sa Pa - Lào Cai ngày 26 tháng

10 năm 2015 được giám định tên khoa học là Tam thất hoang- Panax stipuleanatus

H T Tsai et K M Feng Thân rễ Tam thất hoang rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 °C đạt độ ẩm dưới 10 %, xay nhỏ, thu được bột thô

Bột thô Tam thất được chiết xuất bằng ethanol 50% với tỷ lệ dung môi so với dược liệu là 10:1, tại nhiệt độ 90 °C Quá trình chiết diễn ra trong 1 giờ cho mỗi lần chiết, thực hiện 3 lần cho mỗi mẻ Dịch chiết cồn 50% thu được sau đó được cô dưới áp suất giảm để tạo ra cao lỏng với tỷ lệ 1:20.

Quá trình loại tạp sử dụng phương pháp chiết lỏng-rắn với nhựa hấp phụ D101 và rửa giải bằng EtOH 80% Sau khi thu dịch rửa giải, dung môi được cất thu hồi dưới áp suất giảm cho đến khi cao đặc Cao được sấy chân không ở nhiệt độ 55-60°C trong 24 giờ, sau đó nghiền thành bột và rây qua rây 355 Cuối cùng, cao tam thất hoang được bảo quản trong túi nilon kín ở nhiệt độ phòng.

Trình chiết xuất cao giàu hoạt chất từ tam thất hoang được thực hiện tại khoa Hóa thực vật, viện Dược liệu, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đỗ Thị Hà, thuộc Trường Đại học Y Dược, VNU.

Hình 2.2 Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang [8]

Trong nghiên cứu này, các vật liệu sử dụng bao gồm xylanh 10 mL và 20 mL, kim lấy máu 20 G, ống nghiệm chống đông citrate, ống nghiệm sạch, ống đo mẫu, viên khuấy từ, đầu côn, micropipet, găng tay, máy ly tâm, và máy đo độ ngưng tập tiểu cầu chronolog Ngoài ra, còn có ADP, dung môi DMSO (Dimethyl sulfoxide), thuốc thử từ cao dược liệu, và thuốc chứng dương aspirin (Aspegic 100mg).

Bột thô tam thất hoang

Cô dưới áp suất giảm

- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

- Sấy chân không tại 55-60 o C, 24 h Kiểm tra TLC Đóng gói Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở

Sau khi nhận được sự đồng ý từ hội đồng đạo đức, chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu máu từ những người tình nguyện khỏe mạnh, tuân thủ tuyên bố Helsinki về đạo đức nghiên cứu Người tham gia nghiên cứu được thông báo rõ ràng về lý do, mục đích, lợi ích và rủi ro của nghiên cứu, đồng thời ký cam kết đồng thuận tham gia Những người tình nguyện đều đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ đã được xác định.

Tiêu chuẩn lựa chọn cho người tình nguyện bao gồm: sức khỏe tốt, độ tuổi từ 20 đến 25, không hút thuốc lá, không có tiền sử bệnh lý liên quan đến máu, và không đang sử dụng các loại thuốc ảnh hưởng đến quá trình đông máu hoặc tiêu fibrin.

Tiêu chuẩn loại trừ bao gồm các trường hợp có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, và những người mới cho máu với lượng vượt quá 450 mL trong vòng 28 ngày trước đó.

Tất cả các nghiên cứu được tiến hành vào buổi sáng với tình nguyện viên nhịn ăn trong 12 giờ trước khi lấy mẫu máu Máu tĩnh mạch toàn phần được thu thập bằng kim tiêm cỡ 20 gauge.

Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp đo độ đục của Born: đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy Chrono - Log CA - 560 của Mỹ [34]

Lấy 10-15 ml máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh chống đông bằng natri citrate 3,8 % (1:10); người tình nguyện phải nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu, có số lượng tiểu cầu từ 200-400 G/L, hematocrit bình thường

Để đảm bảo máu được chống đông hoàn toàn, cần lắc đều trước khi ly tâm Thực hiện ly tâm ở tốc độ 500 vòng/phút trong 10 phút để thu được huyết tương giàu tiểu cầu (PRP), sau đó chuyển vào ống falcon vô khuẩn có nắp và bảo quản ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, ly tâm phần huyết tương còn lại ở tốc độ cao 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu được huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP).

Cao chiết saponin từ Tam thất hoang và Sâm vũ diệp có nồng độ 200 mg/mL trong DMSO 10% được pha loãng với nước muối sinh lý để tạo ra các nồng độ cuối cùng trong nghiên cứu là 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 và 1,6 mg/mL DMSO 0,1% được sử dụng trong quá trình này.

% làm chứng âm Nghiên cứu thăm dò từ giai đoạn trước của Lê Thị Tâm năm

Năm 2017, nghiên cứu đã thử nghiệm Aspirin với các liều 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,75 mg/mL và 1 mg/mL, phát hiện rằng liều 1 mg/mL mang lại hiệu quả tối ưu và đạt được mức ức chế kết tập tiểu cầu như mong muốn Do đó, liều 1 mg/mL được chọn làm liều chứng dương.

Tiến hành đo mẫu trên máy Chrono - Log CA – 560

Cho 450 µl huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP) và 50 µl DMSO 0,1% vào cuvet thủy tinh không chứa bi khuấy từ Tiếp theo, thêm 450 µl huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) vào cuvet thủy tinh chứa bi khuấy từ Sau đó, lần lượt thêm 50 µl hóa chất gồm DMSO 0,1%, Aspirin (1 mg/mL), và các phân đoạn giàu saponin của Sâm vũ diệp hoặc Tam thất hoang với các nồng độ 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 mg/mL Ủ hỗn hợp trong 5 phút ở 37 °C, sau đó đưa ống vào vị trí đo (01 ống nghèo tiểu cầu và 01 ống giàu tiểu cầu) trên máy Thêm 5 µl chất kết tập ADP vào ống giàu tiểu cầu và chờ máy chạy để đo mẫu tự động Ghi lại các kết quả bao gồm phần trăm NTTC tối đa (MPA), tốc độ thay đổi ngưng tập trong 1 phút (Slope) và diện tích dưới đường cong (AUC) Lặp lại thí nghiệm 7 lần cho mỗi nồng độ Quy trình thí nghiệm được thể hiện trong hình 2.3.

Hình 2.3 Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu

Ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP

Hình 2.4 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP

Sử dụng chất kết tập ADP 5 àL kích thích receptor ADP trên bề mặt tiểu cầu, dẫn đến sự giải phóng Canxi nội bào và acid arachidonic từ màng phospholipid Quá trình này làm thay đổi hình dạng tiểu cầu từ đĩa sang dạng cầu gai, tạo ra đáp ứng nguyên phát, tiếp theo là đáp ứng thứ phát thông qua việc giải phóng hạt đặc như adenine nucleotide, serotonin và thromboxan Toàn bộ quá trình này được gọi là sóng ngưng tập nguyên phát và thứ phát, và được chia thành 5 giai đoạn.

1- Trước khi đưa chất kết tập ADP vào cuvet

2- Chất kết tập được thêm vào, đồ thì dạng đỉnh nhọn

3- Ánh sáng truyền qua cuvet giảm, tiểu cầu thay đổi hình dạng (kết quả của việc ADP bám vào tiểu cầu)

4- Tăng ánh sáng truyền qua cuvet, tạo sóng ngưng tập nguyên phát

5- Nếu kích thích không đủ mạnh, tiểu cầu sẽ không ngưng tập được (dữ liệu không hiển thị được) Nếu đủ mạnh, sẽ taọ sóng ngưng tập thứ phát của ADP – ngưng tập tăng lên Sự uốn cong nhẹ ở cuối giai đoạn 4 (mũi tên) cho

The School of Medicine and Pharmacy at VNU observes the initiation of secondary platelet aggregation, which leads to the release of various components such as fibrinogen, serotonin, thromboxane, and ADP, ultimately enhancing the aggregation response.

Các thông số nghiên cứu

Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA) được xác định qua chỉ số Amplitude Độ ngưng tập tiểu cầu của các mẫu thử và mẫu chứng dương được chuẩn hóa dựa trên MPA của DMSO, coi MPA của DMSO là 100% MPA (%) của Aspirin và cao giàu Tam thất hoang cùng Sâm vũ diệp được tính toán theo công thức cụ thể ở các nồng độ khác nhau.

Bên cạnh độ ngưng tập tiểu cầu tối đa MPA, tốc độ thay đổi trong một phút (Slope) cũng là chỉ số quan trọng để đánh giá giai đoạn đầu của quá trình ngưng tập và tiểu cầu được hoạt hóa Slope được xác định bằng cách vẽ một đường tiếp tuyến với đường ngưng tập sau giai đoạn tiểu cầu biến dạng (giai đoạn 4).

Mức độ ngưng tập tiểu cầu (NTTC) được đánh giá qua chỉ số diện tích dưới đường cong (AUC), tính từ thời điểm tiểu cầu biến dạng cho đến khi đạt mức ngưng tập tối đa AUC là chỉ số quan trọng nhất trong việc xác định hiệu quả của quá trình này.

Copyright © Trường Đại học Y Dược, VNU nhấn mạnh rằng tốc độ thay đổi ngưng tập và phần trăm ngưng tập tối đa là những chỉ số quan trọng trong việc đánh giá chức năng tiểu cầu Ba chỉ số này hiện đang được các nhà lâm sàng chú ý, vì chúng có giá trị cao trong việc phân loại các dạng bệnh lý tiểu cầu.

Hình 2.6 Chỉ số diện tích dưới đường cong - AUC Phương pháp phân tích số liệu

Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0, với kết quả được trình bày dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn) Để so sánh giá trị trung bình giữa các lô, chúng tôi sử dụng kiểm định ANOVA một chiều, kèm theo kiểm định hậu Tukey hoặc Dunnett’T3 để so sánh từng lô Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả

3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp

3.1.1.1 Ảnh hưởng của cao giàu saponin Sâm vũ diệp lên mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC)

Bảng 3.1 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin Sâm vũ diệp

Lô Thuốc dùng N AUC P so với lô dùng DMSO

P so với lô dùng Aspirin

Sâm vũ diệp chứa cao giàu saponin không làm thay đổi mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng Tuy nhiên, kết quả từ bảng 3.1 cho thấy ở mức liều 0,8 mg/mL và 1,6 mg/mL, Sâm vũ diệp đã làm giảm mức độ ngưng tập tiểu cầu so với lô chứng DMSO, với AUC tương ứng là 213,78±21,50 và 145,93±12,76, trong khi lô chứng DMSO có AUC là 255,05±20,90.

3.1.1.2 Ảnh hưởng của cao giàu saponin Sâm vũ diệp đến phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet aggregation - MPA)

Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin Sâm vũ diệp

Lô Thuốc dùng N MPA (%) P so với lô dùng DMSO

Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy rằng nồng độ 0,8 và 1,6 mg/mL của cao saponin từ Sâm vũ diệp có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu rõ rệt so với nhóm chứng DMSO (p0,05).

3.1.1.4 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp

Phần trăm NTTC tối đa (Maximum platelet aggregation -

Phần trăm NTTC điểm cuối (Final platelet aggregation -

Hình 3.1 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp

(A: DMSO; B: Aspirin 1 mg/mL; C: Sâm vũ diệp 0,1 mg/mL; D: Sâm vũ diệp 0,2 mg/mL;

E: Sâm vũ diệp 0,4 mg/mL; F: Sâm vũ diệp 0,8 mg/mL; G: Sâm vũ diệp 1,6 mg/mL)

Cao giàu saponin của Sâm vũ diệp ở liều 0,8 mg/mL cho thấy hiệu quả giảm tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu tương đương với Aspirin 1 mg/mL, trong khi liều 1,6 mg/mL có tác dụng mạnh hơn so với Aspirin Ngược lại, lô chứng âm DMSO không có tác dụng Sau khi đạt ngưỡng ngưng tập tối đa, tiểu cầu có xu hướng phục hồi, cho thấy rằng sau 5 phút, cả Aspirin và cao saponin của Sâm vũ diệp đều có xu hướng phân rã ngưng tập, dẫn đến sự giảm tiếp tục tỷ lệ ngưng tập tiểu cầu, thể hiện qua sự gia tăng ở cuối đồ thị ngưng tập.

3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Tam thất hoang

3.1.2.1 Ảnh hưởng của cao giàu saponin Tam thất hoang lên mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area under the aggregation curve – AUC)

Bảng 3.4 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin Tam thất hoang

Lô Thuốc dùng N AUC P so với lô dùng DMSO

Nghiên cứu cho thấy cao giàu saponin của Tam thất hoang ở liều 0,8 và 1,6 mg/mL có khả năng giảm đáng kể mức độ ngưng tập tiểu cầu so với nhóm chứng DMSO Đặc biệt, liều 1,6 mg/mL cho hiệu quả giảm ngưng tập tiểu cầu mạnh hơn cả Aspirin với p

Định dạng
Số trang	48
Dung lượng	2,42 MB