Khóa luận ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây thuốc sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) và tam thất hoang (panax stipuleanatus tsai feng) vùng tây bắc

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP

SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm

SVD còn có tên gọi khác là Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Trúc tiết nhân sâm, Ngật đáp thất [1,3]

Cây thảo sống lâu năm, cao từ 0,3 đến 0,5 mét, có thân rễ mập, phân nhánh và nằm ngang, thường nổi trên mặt đất Rễ củ dài, nhiều đốt và có vết sẹo do thân tàn lụi để lại, đầu rễ có hình con quay Thân cây mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, với đường kính từ 0,3 đến 0,6 cm Lá cây dạng kép chân vịt, mọc vòng ở ngọn, thường gồm 2 đến 3 lá, mỗi lá có từ 3 đến 7 lá chét, thuôn dài từ 2,5 đến 14 cm và rộng từ 1,5 đến 4 cm, có gốc tròn, đầu nhọn, xẻ thùy lông chim không đều và mép khía răng, có lông.

Hình 1.1 Hình ảnh Sâm vũ diệp [15]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 - 10 cm, mang từ 20 -

Hoa có cuống dài từ 1 đến 1,5 cm, màu trắng lục với 5 lá nhỏ, 5 cánh hoa và 5 nhị Bầu hoa có 2 đến 3 ô, đầu vỏ nhụy được chia đôi Quả mọng hình cầu hơi dẹt, đường kính từ 0,6 đến 1,2 cm, khi chín có màu đỏ và có chấm đen lớn ở đầu Mỗi quả chứa từ 2 đến 3 hạt hình cầu, màu xám trắng, với vỏ cứng và có rốn hạt.

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái

SVD là loài cây ưa ẩm và bóng râm, thường mọc rải rác dưới tán rừng kín ở độ cao từ 1600 đến 2300 m Loài cây này phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm, với chồi thân mọc lên từ mầm thân rễ vào cuối tháng 2 và đầu tháng 3 Chồi này nhanh chóng ra lá và đạt chiều cao tối đa trong vòng một tháng, và đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa Quả xanh xuất hiện từ cuối tháng 4 đến tháng 6 và chín vào tháng 7, nhưng thường bị cuốn trôi do lượng mưa lớn, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên Sau khi quả chín, từ tháng 9 đến tháng 10, phần thân trên mặt đất tàn lụi, để lộ vết sẹo trên thân rễ, dấu hiệu xác định tuổi cây, trong khi chồi mới bắt đầu hình thành, giúp thân rễ phát triển thêm về chiều dài.

Sâm vũ diệp (SVD) phân bố chủ yếu ở các khu vực tự nhiên như Trung Quốc, Ấn Độ và Nê Pan, đặc biệt là vùng cận Himalaya Điểm phân bố cuối cùng của loài này về phía nam là Sa.

Pa của Việt Nam, đặc biệt là ở khu vực núi Hoàng Liên Sơn như Sa Pa, Bát Xát, và Than Uyên, đang phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng do nạn phá rừng và khai thác bừa bãi Vùng phân bố của loài này đã bị thu hẹp đáng kể, vì vậy việc bảo vệ Pa đang được ưu tiên hàng đầu tại Việt Nam.

Hiện nay, SVD đang được trồng thử nghiệm ở Sa Pa (Lào Cai) và Hà Giang và cho những kết quả khả quan [15,16]

Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002 chỉ ra rằng trong thân rễ và rễ củ của SVD chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin, cùng với acid béo và acid amin Saponin, thành phần hoạt chất chủ yếu, có mặt trong lá và thân SVD, bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng cao và một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn.

Năm 1989, một nhóm nghiên cứu ở Trung Quốc đã phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá cây ginseng, trong đó có các ginsenosid đặc trưng như F, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid, majorosid F1 và bipinnatifidusosid.

Rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid R0, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2

[1] Nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc năm 2011, phân lập một nhóm

Từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, đã xác định được 10 saponin khung oleanan, trong đó có 3 chất mới là bifinosid A-C và 7 hợp chất đã biết, bao gồm narcissiflorin methyl este, chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl este, stipuleanosid R1 và pseudoginsenosid.

RT1 methyl este, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl este [22]

Năm 2018, nhóm nghiên cứu Việt Nam đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2 saponin từ thân rễ SVD là stipuleanosid R2, aralosid A methyl ester [16]

Me : methyl Ara(f) : -L-arabinofuranosyl Ara(p) : -L-arabinopuranosyl Glc : -D-glucopyranosyl Xyl : -D-xylopyranosyl

Hình 1.2 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây Sâm vũ diệp [22]

Bảng 1.1 Các hợp chất saponin đã phân lập từ Sâm vũ diệp

Hiện nay, đã có 25 hợp chất saponin được xác định từ thành phần cây SVD

Tính vị, công năng: SVD có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1]

SVD được sử dụng trong nhiều bài thuốc truyền thống tại Việt Nam và Trung Quốc, nhưng tài liệu khoa học về tác dụng dược lý của nó còn hạn chế Nghiên cứu trên động vật thí nghiệm cho thấy SVD có khả năng tăng cường chức năng sinh lý, cải thiện hệ thần kinh trung ương, nâng cao sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể Ngoài ra, SVD còn có tác dụng tán huyết, chống stress, chống trầm cảm, bảo vệ gan, tăng cường hệ miễn dịch và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

Theo đông y, SVD có tác dụng huyết hành, tiêu đờm, giảm đau và điều trị các triệu chứng như đau gân cốt, thổ huyết, chảy máu mũi và xuất huyết dạ dày Đây là một vị thuốc quý, nổi bật với khả năng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng và tăng cường trí nhớ, đặc biệt có lợi cho phụ nữ sau sinh và người cao tuổi SVD còn được sử dụng để ngâm rượu hoặc nấu cao, có tác dụng kích thích sinh dục khi pha với nước hoặc rượu để uống.

TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU

Tiêu chuẩn cơ sở được phát triển dựa trên các nghiên cứu khoa học, công nghệ, tiến bộ kỹ thuật và kinh nghiệm thực tiễn, nhằm đáp ứng nhu cầu và khả năng thực hiện trong thực tế.

Các quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu bao gồm mô tả, định tính, các phép thử tinh khiết, xác định hàm lượng chất chiết xuất và định lượng hoạt chất trong dược liệu.

Mô tả dược liệu cần bao gồm hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị và các đặc điểm bề mặt, cùng với vết bẻ hoặc mặt cắt Các đặc điểm thể chất này giúp nhận diện và phân loại dược liệu một cách chính xác.

• Định tính: Là những phương pháp dùng đề nhận biết dược liệu, bao gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa

Nhận biết dược liệu có thể thực hiện qua các phương pháp đơn giản và truyền thống, bao gồm việc quan sát sự chìm hay nổi trong nước, lắng nghe âm thanh khi đốt, cũng như kiểm tra màu sắc của ngọn lửa, khói và mùi phát ra Những kỹ thuật này giúp xác định tính chất và chất lượng của dược liệu một cách hiệu quả.

Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học là quá trình quan sát đặc điểm của tế bào và mô trong các lát cắt, bột hoặc bề mặt dược liệu thông qua kính hiển vi.

- Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực, v.v… của các dược liệu

Định tính hóa học là phương pháp kiểm tra các thành phần trong dược liệu thông qua các phản ứng hóa học Cách thức thực hiện được mô tả chi tiết trong các chuyên luận về dược liệu cụ thể.

Định tính sắc ký là quy trình sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao để phát hiện và phân tích các thành phần có trong dược liệu Quy trình này thường được thực hiện bằng cách so sánh các thành phần với chất chuẩn hoặc dược liệu chuẩn để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Định tính huỳnh quang là quá trình quan sát sự phát huỳnh quang của bề mặt hoặc mặt cắt của dược liệu, cũng như dịch chiết của chúng, trong điều kiện thường hoặc sau khi tác dụng với acid, kiềm hoặc thuốc thử Theo quy định, mẫu thử cần được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm.

- Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại

Trải một lớp bột dược liệu mỏng lên vòng kim loại và đậy kín bằng phiến kính có miếng bông tẩm nước lạnh Đặt vòng kim loại lên lưới amiant có lỗ tròn 2 cm, sau đó đun nóng nhẹ dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu cháy xém Sau khi nhấc phiến kính ra và để nguội, quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể chất thăng hoa trên phiến kính bằng kính hiển vi, hoặc tiến hành phản ứng hóa học phù hợp với chất đã thăng hoa.

Thử tinh khiết là phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, bao gồm nhiều chỉ tiêu khác nhau tùy thuộc vào loại dược liệu cụ thể.

- Mất khối lượng do làm khô

- Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric

- Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối

- Tỉ lệ vụn nát của dược liệu

- Hàm lượng kim loại nặng

- Dư lượng các chất bảo vệ thực vật

- Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác)

Định lượng là quá trình xác định hàm lượng của một hoặc nhiều chất có trong dược liệu thông qua các phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học Quá trình này không chỉ bao gồm việc xác định hàm lượng chất béo và tinh dầu mà còn đánh giá hoạt lực của các chất thông qua các phép thử sinh học.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cây Sâm vũ diệp, thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), được trồng tại huyện Sa Pa, Lào Cai, đã được thu hoạch vào ngày 15/07/2016, với độ tuổi 6 năm Mẫu cây này đã được giám định và xác định tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem bởi ThS Nguyễn Quỳnh.

Nga, Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản (DL -

150716) được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu

Thân rễ sâm vũ diệp có đặc điểm nhiều đốt và vết sẹo, hình dáng cong ngoằn ngoèo, dài từ 7-12 cm và đường kính từ 1,2-1,8 cm Chất liệu của nó cứng chắc, giòn và dễ bẻ, với mặt bẻ lởm chởm và màu vàng nâu nhạt Sâm vũ diệp có mùi thơm nhẹ, vị đắng và hơi ngọt.

Để xử lý mẫu thân rễ SVD, trước tiên cần rửa sạch, để khô và thái lát mỏng Sau đó, sấy khô ở nhiệt độ 50°C cho đến khi hàm ẩm đạt dưới 10% Cuối cùng, bảo quản mẫu trong túi nilon kín và để ở nơi khô ráo, thoáng mát để phục vụ cho nghiên cứu.

Hình 2.1 Mẫu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại

Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu và phân tích đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng

- Dung môi hóa chất: Methanol (CH3OH), ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), acetonitrile (CH3CN), acid acetic (CH3COOH), nước cất hai lần,… dùng cho phân tích

- Thuốc thử: Acid sulfuric (Meck), acid acetic (CH3COOH) (Meck)

- Bản mỏng: Silica gel 60 RP-18 F254s (Meck)

- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ)

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức)

- Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic-Hàn Quốc)

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUchi, Thụy Sĩ)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm

- Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa – Thụy Sĩ)

- Cân xác định độ ẩm Precisa HA 60

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000ml

- Bình chạy sắc ký lớp mỏng

- Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Kính hiển vi điện tử

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong…

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tiêu chuẩn dược liệu SVD được xây dựng dựa trên các tiêu chí chung quy định trong DĐVN V tại phụ lục 12.2, bao gồm mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tạp chất, định tính và định lượng.

Kiểm tra về hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan và kiểm tra kích thước bằng cách đo

Mẫu dược liệu SVD được cắt vi phẫu và tẩy sáng bằng dung dịch Cloramin 5-10% Sau đó, mẫu được nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh methylene Cuối cùng, các đặc điểm vi phẫu của dược liệu được quan sát dưới kính hiển vi.

Dược liệu được làm khô rồi nghiển thành bột, lên tiêu bản bằng một giọt dung dịch soi, quan sát các được điểm của bột bằng kính hiển vi [4]

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6: cân chính xác khoảng 3g dược liệu đã cắt nhỏ, sấy trong tủ sấy ở 105°C, áp suất thường trong 5 giờ

Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8

Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức:

Trong đó: m: Khối lượng tro (g) M: Khối lượng mẫu thử (g) B: Độ ẩm của mẫu thử (%)

2.2.6 Tro không tan trong acid

Xác định theo DĐVN V, phụ lục 9.7:

Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500°C đến khối lượng không đổi (nung trong

Tỉ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính tương tự như tro toàn phần

Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.11: Cân khoảng 50g dược liệu dàn mỏng trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp

Cân phần tạp chất và tính phần trăm:

Trong đó: a: Khối lượng tạp chất tính bằng gam p: Khối lượng mẫu thử tính bằng gam

Phương pháp sắc ký bản mỏng với điều kiện:

Pha động: Chọn một hệ dung môi đặc trưng cho nhóm saponin sau:

CH3OH-CH3CN-H2O (2:1:1, v/v/v) (Hệ III)

Pha tĩnh: Bản mỏng đế nhôm Silica gel 60 RP-18 F254S đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phút trước khi dùng

Thuốc thử phát hiện: Acid sulfuric 10% trong ethanol

+ Dung dịch thử: Lấy 1g bột mẫu thử, thêm 10ml methanol : nước (4:1), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký

+ Dung dịch đối chiếu 1: Lấy 1g mẫu bột SVD (mẫu chuẩn) thêm 10ml methanol : nước (4:1), tiếp tục tiến hành giống dung dịch thử

+ Dung dịch đối chiếu 2: Hòa tan một lượng stipuleanosid R2 chuẩn trong methanol để được dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml

Để tiến hành sắc ký, sử dụng bản mỏng silica gel 60 RP-18 F254S đã được kích hoạt ở 105°C trong 60 phút Chấm riêng biệt mỗi 5 µl dung dịch thử và các dung dịch đối chiếu, sau đó thực hiện sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4 Sau khi hệ dung môi được triển khai khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra và để bay hơi hết dung môi trước khi phun thuốc thử Cuối cùng, sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại UV 365 nm cùng ánh sáng thường.

Sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu đã được chụp ảnh và lưu giữ Các giá trị hệ số di chuyển (Rf) của stipuleanosid R2 được ghi nhận.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU vết chính được tính bằng tỷ số giữa đường đi của các vết đó trên đường đi của pha động

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, theo DĐVN V, phụ lục 5.3 a) Xây dựng phương pháp

Chuẩn bị dung dịch thử, dung dịch chuẩn:

Để chuẩn bị dung dịch thử, cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu vào bình tam giác 100 ml, sau đó thêm 50 ml hỗn hợp methanol và nước với tỷ lệ 70:30 Tiến hành siêu âm trong 30 phút, để nguội và bổ sung dung môi cho đủ thể tích Cuối cùng, lọc dung dịch qua màng lọc kích thước 0,45 µm để thu được dung dịch dùng cho tiêm sắc ký.

Chuẩn bị một dãy dung dịch mẫu chuẩn stipuleanosid R2 trong methanol với các nồng độ chính xác là: 18,75 àg/ml, 37,5 àg/ml, 75 àg/ml, 150 àg/ml, 200 àg/ml, 300 àg/ml và 400 àg/ml.

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký:

Dựa trên tài liệu tham khảo và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát định lượng thành phần saponin trong thân rễ SVD.

Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo

Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau

Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector

Để đảm bảo phát hiện chất phân tích hiệu quả, UV, FLD và DAD là những phương pháp tối ưu, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích, vừa phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.

Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU b)Thẩm định và đánh giá phương pháp

Thẩm định điều kiện định lượng saponin chính trong thân rễ SVD được thực hiện với chất đối chiếu đã được nhận dạng cấu trúc Tổng tạp chất được xác định bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích Quy trình này được đánh giá theo hướng dẫn từ các tài liệu [5-7,25] thông qua khảo sát các chỉ tiêu, trong đó độ đặc hiệu là khả năng xác định rõ ràng chất cần phân tích trong sự hiện diện của tạp chất hoặc các chất cản trở khác.

Sắc ký đồ của các mẫu thử với thời gian lưu khác nhau không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với sắc ký đồ của chất chuẩn trong các mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn Độ tương thích hệ thống

Độ chính xác của hệ thống phân tích được xác định qua tính thích hợp của thiết bị, thông qua việc thực hiện nhiều lần đo lặp lại trên cùng một mẫu đã được xử lý.

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn và ghi lại thời gian lưu cùng diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được thể hiện qua giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích.

Yêu cầu: RSD ≤ 5,0 % Độ tuyến tính

Khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích đề cập đến khoảng nồng độ mà tại đó có mối quan hệ tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất phân tích (x) Độ tuyến tính được thể hiện qua phương trình y = ax + b cùng với hệ số tương quan tuyến tính R².

Để xác định nồng độ chất cần phân tích, trước tiên cần chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu với nồng độ tăng dần Sau đó, tiến hành xác định mối quan hệ tuyến tính giữa đáp ứng của pic và nồng độ chất trong mẫu thử thông qua phương trình hồi quy tuyến tính.

Mô tả

Thân rễ SVD là một loại dược liệu có hình dạng cong ngoằn ngèo, dài từ 7-12 cm và đường kính từ 0,5-1,5 cm Bề mặt bên ngoài có màu nâu với các vết nhăn dọc và các vết vân ngang nổi rõ, chia thân rễ thành nhiều đốt Trên thân có nhiều sẹo do sự tàn lụi của thân khí sinh hàng năm Chất liệu của thân rễ cứng chắc, giòn và dễ bẻ, với mặt bẻ có màu vàng nâu nhạt Dược liệu này có mùi thơm nhẹ đặc trưng, vị đắng và hơi ngọt.

Vi phẫu

Lớp bần gồm 5-6 hàng tế bào hình chữ nhật, có thành hơi cong và màu lục, trong khi lớp ngoài bị bong ra Mô mềm của vỏ chứa các tế bào hình nhiều cạnh dày ở góc, chứa nhiều ống tiết và tinh thể calci oxalat hình cầu gai.

Các bó libe gỗ được xếp thành từng bó riêng lẻ, kéo dài theo hướng xuyên tâm và được phân cách bởi các tia ruột rộng Gỗ gỗm bao gồm những tế bào thành dày, nằm trong mô mềm gỗ ít hóa gỗ.

Tầng phát sinh libe-gỗ nằm giữa libe cấp hai và gỗ cấp hai, bao gồm nhiều lớp tế bào nhỏ hình chữ nhật với màng mỏng, được sắp xếp thành dãy đều đặn.

Tia ruột rộng gồ m nhiều tế bào xếp theo hướng xuyên tâm

Ruột cấu tạo từ các tế bào tạo nên những khoảng gian bào và ống tiết, tương ứng với các bó libe-gỗ ở cả phía trong và phía ngoài.

Soi bột

Màu vàng nâu, khi soi kính hiển vi, cho thấy những hạt tinh bột hình bầu dục với kích thước không đều, trong đó có một vạch rõ ràng Mảnh bần chứa các tế bào hình nhiều cạnh, có thành dày màu vàng nâu Mảnh mô mềm bao gồm những tế bào màng mỏng màu trắng Mảnh mạch vạch và mạch mạng xuất hiện, rải rác có chất tiết màu nâu đen Tinh thể canxi oxalat có hình cầu gai.

Bần Mô mềm Mô mềm chứa tinh bột

Mảnh mạch Đám tinh bột Chất tiết Tinh thể calci oxalate

Độ ẩm

Tiến hành xác định độ ẩm của các mẫu dược liệu SVD theo phương

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Hàm ẩm (% )

Độ ẩm trung bình của các mẫu dược liệu SVD là khoảng 8,17%, nằm trong giới hạn an toàn theo quy định của DĐVN Để ngăn ngừa tình trạng dược liệu bị mốc do độ ẩm, quy định yêu cầu hàm ẩm của dược liệu SVD không vượt quá 10%.

Tro toàn phần

Tiến hành xác định tro toàn phần của các mẫu dược liệu kết quả được trình bày tại bảng 3:

Bảng 3.2 Kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Tro toàn phần (% )

Từ bảng phân tích, tỷ lệ tro toàn phần trung bình của dược liệu SVD là 7,53%, với mẫu cao nhất đạt trên 7,8% Vì vậy, quy định tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu không được vượt quá 8%.

Tro không tan trong acid

Sau khi thực hiện theo hướng dẫn ở mục 2.2.6, chúng tôi đã xác định được độ tro không tan trong acid của các mẫu dược liệu SVD, kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 4.

Bảng 3.3 Kết quả xác định độ tro không tan trong acid của các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Tro không tan trong acid (%)

Kết quả phân tích cho thấy độ tro không tan trong acid trung bình của ba mẫu dược liệu SVD là 1,57%, thấp hơn quy định tối đa là 2,0%.

Định tính

Tiến hành chạy SKLM với bản mỏng pha đảo, hệ dung môi và chất thử, chất đối chiếu được chuẩn bị như mục 2.2.8

Kết quả quan sát sắc ký đồ bản mỏng dưới ánh sáng thường cho thấy dung dịch thử (I) có các vết màu sắc và Rf tương đồng với dung dịch đối chiếu (II) Ngoài ra, có một vết nằm trong khoảng Rf 0,3 đến 0,5, có màu sắc và Rf giống với sắc ký đồ của chất chuẩn stipuleanosid R2 (III) (Hình 6).

Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Sâm vũ diệp (Ký hiệu:

Định lượng

Chương trình được thực hiện theo phương pháp do nhóm nghiên cứu của thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Thủy phát triển, bao gồm việc khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp.

Chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity như sau:

- Pha tĩnh: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)

- Detector UV: bước sóng 203 nm

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, điều chỉnh nếu cần thiết

- Pha động: Acetonitril (A) và 0,5% acid acetic/ H2O (B)

Pha động được rửa giải theo chương trình như sau:

Bảng 3.4 Chương trình dung môi Thời gian

25-30 20 80 Đẳng dòng b) Thẩm định phương pháp phân tích

Dung dịch mẫu trắng: dung dịch MeOH

Để pha dung dịch mẫu thử, cân chính xác khoảng 0,1 g cao ethanol thân rễ sâm vũ diệp (độ ẩm 4,7%) vào bình định mức 10 ml Tiếp theo, thêm 7 ml methanol và lắc siêu âm trong 10 phút để hòa tan Sau đó, bổ sung methanol đủ đến vạch định mức, lắc đều và ly tâm để lấy dịch chiết, rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Để pha dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2, cần cân 1,0 mg stipuleanosid R2 và hòa tan trong methanol để tạo ra dung dịch gốc với nồng độ 1000 μg/mL Sau đó, dung dịch được siêu âm trong 10 phút, ly tâm để thu dịch chiết và lọc qua màng lọc 0,45 μm Cuối cùng, pha loãng dung dịch chuẩn gốc với MeOH để tạo ra các dung dịch có nồng độ phù hợp cho việc xây dựng dãy dung dịch chuẩn.

Tính thích hợp hệ thống

Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần cho thấy kết quả sắc ký với các thông số như thời gian lưu, diện tích pic và hệ số đối xứng Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu là 0,15%, diện tích pic là 2,75% và hệ số bất đối là 1,21%, tất cả đều thấp hơn 3% (Bảng 6), chứng tỏ các điều kiện sắc ký đã được tối ưu hóa.

The School of Medicine and Pharmacy at VNU has established a stable and suitable HPLC chromatography system for the analysis of stipuleanosid R2 in the medicinal herb, ginseng.

Bảng 3.5 Tính thích hợp của hệ thống

STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối

Tiến hành sắc ký các mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo quy trình phân tích đã đề ra Ghi nhận sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn Kết quả thu được được trình bày chi tiết trong hình 7.

Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử

Kết quả phân tích cho thấy, sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện pic tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trong dung dịch chuẩn Tuy nhiên, sắc ký đồ của dung dịch thử lại cho thấy một pic có thời gian lưu trùng khớp với stipuleanosid R2 trong dung dịch chuẩn, cho thấy độ tuyến tính của phương pháp phân tích.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng từ dung dịch gốc với các hệ số khác nhau Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, tiêm mỗi dung dịch 3 lần và ghi lại sắc ký đồ để xác định đáp ứng của pic Cuối cùng, xác định phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn trong mẫu so và đáp ứng pic thu được.

Mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 được xác định qua phương trình y = 2,6081x + 49,1185, với hệ số tương quan R² = 0,9988 Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 15,625 đến 400 àg/ml, có sự tương quan chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ stipuleanosid R2, cho thấy hệ số tương quan rất cao.

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2

(àg/ml) Diện tớch pic (mAU*s)

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 Độ đúng

Khi thêm các lượng stipuleanosid R2 chuẩn khác nhau, phương pháp cho thấy độ thu hồi ổn định và độ lệch chuẩn tương đối RSD trong khoảng cho phép Kết quả này khẳng định rằng phương pháp xây dựng có độ thu hồi tốt, phù hợp cho việc định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu Sâm vũ diệp Kết quả chi tiết được trình bày ở bảng 8 với phương trình hồi quy y = 2.6081x + 49.1185 và hệ số xác định R² = 0.9988.

Nồng độ (àg/ml) Đồ thị đường chuẩn của stipuleanosid R2

Bảng 3.7 Khảo sát độ thu hồi

STT Lượng có sẵn (àg)

Lượng tìm lại (àg) Độ thu hồi (%)

Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Tiến hành pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn và phân tích HPLC cho đến khi tín hiệu của chất định phân tích đạt tỉ lệ S/N khoảng 2-3, với S là chiều cao pic chất phân tích và N là chiều cao tín hiệu nhiễu lớn nhất Nồng độ xác định được sẽ là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp đối với chất định phân tích.

Giới hạn định lượng LOQ: Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện LOQ = 3,3 x LOD

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện là LOD

= 1,953 àg/ml, giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,445 àg/ml

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp đã được xây dựng có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương đối phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp.

Ta có sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 và của dược liệu SVD (Hình 9)

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và dược liệu

Kết quả định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong các mẫu SVD được trình bày tại bảng 9:

Bảng 3.8 Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu Sâm vũ diệp

TT Tên mẫu Hàm lượng % stipuleanosid R2 tính theo khối lượng khô tuyệt đối

Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử dao động từ 0,332 % đến 0,338 %, với giá trị trung bình là 0,335 % ± 0,003 Theo tiêu chuẩn quy định của dược liệu SVD, hàm lượng stipuleanosid R2 không được thấp hơn 0,3 %.

Bàn luận

Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu dược liệu đã được xác định tên khoa học, thu hái tại Sa Pa, Lào Cai vào năm 2016 Để đạt được kết quả tốt hơn, cần thực hiện quan sát trên nhiều mẫu thu hái từ các vùng khác nhau.

3.9.2 Về khảo sát các chỉ tiêu theo quy định trong Dược điển Việt Nam

Khi xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu, các chỉ tiêu như độ ẩm, tỷ lệ tro toàn phần và tỷ lệ tro không tan trong acid là những chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng dược liệu SVD trước khi sử dụng Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian và kinh phí, một số chỉ tiêu khác như tạp chất, tỷ lệ vụn nát, hàm lượng kim loại nặng và hàm lượng chất có thể chiết xuất bằng dung môi chưa được thực hiện.

3.9.3 Về định tính Định tính chúng tôi sử dụng phương pháp SKLM: Khi phun thuốc thử

H2SO4 10% trong ethanol khi được hơ nóng trên bản mỏng xuất hiện các vết chất có cùng khoảng Rf và màu sắc, cho thấy sự hiện diện của stipuleanosid R2 Nghiên cứu đã xác định hệ dung môi thích hợp để định tính thành phần stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD bằng phương pháp SKLM.

Chúng tôi đã xác định được hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu dược liệu SVD thu hái ở Sa Pa bằng phương pháp HPLC

Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử dao động từ 0,332 % đến 0,338 % Vì vậy, giới hạn hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD theo tiêu chuẩn không được thấp hơn 0,3 %.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN Đề tài đã thực hiện được các mục tiêu nghiên cứu đã đề ra như sau:

Đã tiến hành khảo sát các tiêu chí của dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế biến dược liệu thân rễ quy định trong DĐVN V, bao gồm mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, cùng với các phương pháp định tính và định lượng.

- Khảo sát, xây dựng được quy trình định lượng saponin bằng phương pháp HPLC tính theo stipuleanosid R2

Nghiên cứu này là bước đầu quan trọng trong việc hoàn thiện tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD của DĐVN Dựa trên kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu đã đề xuất một dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu SVD, bao gồm các chỉ tiêu như độ ẩm không vượt quá 10,0%, tro toàn phần không quá 8,0%, tro không tan trong acid không quá 2,0%, và hàm lượng stipuleanosid R2 không được thấp hơn 0,3%.

1 Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu, tỉ lệ vụn nát và xác định hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu SVD

2 Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD để bổ sung một chuyên luận mới về dược liệu SVD trong Dược điển Việt Nam

3 Đề xuất thầm định tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD.

Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và Nguyễn Thượng Đông cùng cộng sự đã biên soạn cuốn "Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam" tập 2, xuất bản năm 2003 bởi Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, với thông tin chi tiết từ trang 711 đến 714.

[2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr 285-

[3] Bộ Khoa học và Công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam, Nhà xuất bản

Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, tr 85 – 87

[4] Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học

[5] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009 TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc

[6] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-113,

[7] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn Thị Thu Hương

(2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 326 – 338

[8] Phạm Xuân Đà (2010), Thẩm định phương pháp phân tích trong hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr 19-58

[9] Nguyễn Thị Thu Hương và và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam,

NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 464 - 466

[10] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh

(2005), "Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr 196-200

[11] Nguyễn Thị Thu Hương và Trần Mỹ Tiên, (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống stress và chống trầm cảm của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis

Ha et Grushv Araliaceae) và hoạt chất chính majonosid-R2", Tạp chí Dược liệu, 6(1), tr 25-27

Trần Công Luận (2002) đã thực hiện nghiên cứu phân tích thành phần hóa học và các tác dụng dược lý của hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng) trong một đề tài cấp Bộ Nghiên cứu này cung cấp những thông tin quan trọng về giá trị dược liệu của hai loại sâm này.

Nghiên cứu của Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên và Nguyễn Tập (2009) trên hai loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng) đã chỉ ra thành phần hóa học và một số tác dụng dược lý quan trọng của chúng Kết quả nghiên cứu được công bố trong Tạp chí dược liệu, tập 14, số 1, trang 17-23.

Lã Đình Mỡi và các cộng sự (2013) đã trình bày trong bài viết của họ về họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.) như một nguồn tài nguyên phong phú chứa đựng nhiều hoạt chất sinh học đa dạng và tiềm năng tại Việt Nam Nghiên cứu này được công bố tại Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, nhấn mạnh tầm quan trọng của họ Nhân sâm trong việc phát triển các sản phẩm sinh học có giá trị.

[15] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr 71-76

Nghiên cứu của Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền và Lê Thanh Sơn (2006) đã chỉ ra kết quả về phân bố và sinh thái của sâm vũ diệp và tam thất hoang tại Việt Nam Bài viết đăng trên Tạp chí Dược liệu, số 11(5), trang 177-180, cung cấp cái nhìn sâu sắc về tình trạng và môi trường sống của hai loại dược liệu quý này.

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Thủy và các cộng sự (2018) đã phân tích thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.) được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai Kết quả nghiên cứu được công bố trên Tạp chí Dược liệu, số 2(23), trang 82-88, cung cấp thông tin quý giá về giá trị dược liệu của cây sâm này.

Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2006) đã thực hiện nghiên cứu về tác dụng của sâm Việt Nam đối với trí nhớ thông qua việc xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động Kết quả nghiên cứu được công bố trong Tạp chí Dược liệu, số 11, trang 202-206.

Nghiên cứu của Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2005) đã chỉ ra rằng lá sâm Việt Nam có tác dụng dược lý đáng chú ý, đặc biệt là trong việc chống stress và chống oxy hóa Bài viết đăng trên Tạp chí Dược liệu, số 10(1), trang 27-32, cung cấp những thông tin quý giá về lợi ích sức khỏe của loại thảo dược này.

[20] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462, pp

[21] Gurung B, Bhardwaj PK et al (2018), "Major ginsenoside contents in rhizomes of Panax sokopayensis and Panax bipinnatifidus", Nat Prod Res, 33(2), pp 234-238

[22] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L

Pham, et al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420

[23] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al

(1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593-599

[24] Wang D.Q., Feng B.S et al (1989), "Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains China", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636

[25] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva

[26] Zhang Y, Shi C et al (2016), "Saponins from Panax bipinnatifidus

Seem.: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1039, pp 79-87

PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA

PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP

Sâm vũ diệp (thân rễ)

Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Ngật đáp thất

Thân rễ đã phơi và sấy khô của cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), họ Nhân sâm (Araliaceae)

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,37 MB