Khóa luận nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng) trên sự biểu hiện COX 2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập

TỔNG QUAN

Tổng quan về Tam thất hoang

Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H T Tsai et K M

Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8]

Cây thân thảo có chiều cao từ 25 đến 75 cm, với rễ mập nằm ngang và nhiều vết lõm do thân để lại Cây thường ít phân nhánh, mỗi khóm thường chỉ có một thân mang lá, hiếm khi có từ 2 đến 3 lá.

Lá kép chân vịt thường mọc thành vòng ở ngọn, có từ 1 đến 3 lá, với cuống dài từ 5 đến 10 cm Mỗi lá chét có cuống ngắn, hình thuôn hoặc mác thuôn, dài từ 5 đến 13 cm và rộng từ 2 đến 4 cm, nhọn ở cả hai đầu Hoa của cây có màu vàng xanh, bao gồm 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô Quả của cây là loại quả mọng, gần hình cầu dẹp, có đường kính từ 0,6 đến 1,2 cm và khi chín có màu đỏ Hạt của quả thường có 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng.

Hình 1.1 Tam thất hoang ( Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) [11]

1.1.2 Sinh thái và phân bố

Tam thất hoang (TTH) là loài cây ưa ẩm và ánh sáng, thường mọc trên đất giàu mùn trong các khu rừng thường xanh, ở độ cao từ 1600 đến 2300 mét Loài cây này tái sinh chủ yếu bằng hạt, ra hoa vào tháng 4 đến tháng 5 và cho quả từ tháng 5 đến tháng 9 Hiện nay, Tam thất hoang chỉ được tìm thấy ở tỉnh Vân Nam, Trung Quốc và một số khu vực tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn, tỉnh Lào Cai, Việt Nam.

Trong thân rễ của TTH, có chứa một lượng cao saponin thuộc khung oleanan, chủ yếu là các dẫn chất acid oleanolic, bên cạnh một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp.

Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2 saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19]

Năm 2002, nhóm nghiên cứu tại Đại học Toyama, Nhật Bản đã phân tích dịch chiết ethanol từ TTH thu hái ở Trung Quốc và phát hiện hàm lượng nhỏ các saponin khung dammaran, bao gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd.

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được

Trong nghiên cứu về các hợp chất saponin, đã phát hiện 11 hợp chất dẫn xuất từ acid oleanolic, bao gồm spinasaponin A methyl ester mới được chiết xuất từ rễ TTH ở Việt Nam Năm 2013, nhóm nghiên cứu đã xác định thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác, mở rộng hiểu biết về các hợp chất này.

3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P stipuleanatus [45]

Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự cho thấy, ngoài saponin, TTH còn chứa nhiều thành phần khác như polyacetylen, triterpenoid, tinh dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic, acid béo, acid amin và các nguyên tố vi lượng.

Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 –

Nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã thử nghiệm tác dụng gây độc trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người (HCT-116) Kết quả cho thấy Chất 1 có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với giá trị IC 50 lần lượt là 4,44 và 0,63 àM trên hai dòng tế bào HL-60 và HCT-116.

Năm 2013, Chun Liang và cộng sự đã đánh giá hoạt tính của 15 chất trên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2, cho thấy các chất từ 6 đến 11 có khả năng ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 đến 18,9 àM Đặc biệt, các chất 8, 10 và 11 đã ức chế sự biểu hiện của mARN iNOS và COX-2 theo nồng độ, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị như chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần.

Năm 2011, hai polyacetylen mới là stipudiol và stipuol được phân lập từ TTH, cho thấy khả năng ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thông qua việc kích hoạt quá trình apoptosis của tế bào.

Nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 tại Việt Nam cho thấy cao TTH có khả năng phục hồi thời gian ngủ do stress, hiệu quả ở các liều 44, 88 và 176 mg/kg Cao saponin toàn phần của TTH ở nồng độ 25, 50 và 100 μg/ml cho thấy tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd Ngoài ra, cao thân rễ và rễ củ TTH có độc tính cấp đường uống với liều LD 50 là 8,8 g/kg.

Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11]

Sách đỏ Việt Nam (2007) ghi nhận rằng tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc, trong đó thân rễ thường được sử dụng để bổ sung dinh dưỡng, cầm máu, tăng cường sinh dục và giảm stress Lá và nụ hoa được chế biến thành trà, có tác dụng kích thích tiêu hóa và an thần Cây này có tác dụng tán ứ và định thống, với bộ phận sử dụng chủ yếu là thân rễ Rhizoma Panacis Stipuleanati.

Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS

Giải phẫu học thành động mạch bao gồm ba lớp áo đồng tâm: lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ với các sợi thần kinh; lớp áo giữa chứa sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mô.

Hình 1.3 Cấu trúc thành động mạch [1]

Thành của các loại mạch như động mạch, tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch huyết đều được lót bởi một lớp tế bào nội mô thuộc biểu mô lát đơn Lớp nội mô này bao gồm một hàng tế bào hình đa giác dẹt, với phần bào tương chứa nhân lồi vào trong lòng mạch và phần bào tương ngoại vi tỏa thành lá mỏng Các tế bào nội mô liên kết với nhau thông qua các dải bịt hoặc liên kết khe Ở người trưởng thành, nội mạc mạch máu chứa khoảng mười ngàn tỷ tế bào, bao phủ diện tích từ 1 đến 7 mét vuông, tạo thành một tổ chức nặng khoảng 1 kg.

1.2.1.2 Chức năng của nội mạc mạch máu

Nội mạc mạch máu đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh lưu thông máu, trương lực mạch, và sự kết tập tiểu cầu Nó cũng tham gia vào việc điều hòa các quá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa, và duy trì sự hằng định nội môi.

[30] Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52]

Nội mạc mạch máu tạo thành hàng rào bán thấm, kiểm soát sự di chuyển của các chất hòa tan, đại phân tử và tế bào giữa dòng máu và mô xung quanh Irie và Tavassoli gọi đây là hàng rào máu – mô Rối loạn tính thấm của nội mạc có thể dẫn đến nhiều bệnh lý, bao gồm phù, sốc và xung huyết.

Endothelial cells have the ability to produce various molecules, including vasodilators such as nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), and endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) They also generate vasoconstrictors like endothelin, thromboxane A2, and angiotensin II Additionally, these cells release adhesion molecules including E-selectin, P-selectin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) Furthermore, endothelial cells secrete cytokines and growth factors such as granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interleukins (IL-1, IL-6), and stem cell factor (SCF), as well as chemokines like α and β chemokines and fractalkine They are also involved in hemostasis by producing tissue plasminogen activator (t-PA) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1).

Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, yếu tố mô (TF), và chất ức chế con đường yếu tố mô (TFPI) đều đóng vai trò quan trọng trong sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch.

VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor), PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor) [17,26,27,38]

Rối loạn cấu trúc và chức năng của nội mạc mạch máu có liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn và các hội chứng viêm.

Năm 1980, Furchgott và Zawadzki đã phát hiện rằng sự giãn nở của động mạch thỏ do acetylcholin (ACh) kích thích phụ thuộc vào nội mô nguyên vẹn Họ cũng xác định rằng ACh kích thích sự giải phóng yếu tố giãn mạch nguồn gốc nội mạc (EDGR).

Năm 1987, Palmer và cộng sự đã phát hiện ra nitric oxide (NO), một trong những gốc khí tự do đơn giản nhất, có vai trò quan trọng như một tín hiệu trung gian trong cơ thể NO tham gia vào việc điều hòa nhiều quá trình sinh lý, bao gồm dẫn truyền thần kinh, trương lực mạch máu, co cơ, kết tập tiểu cầu, chuyển hóa, đáp ứng miễn dịch, phiên mã gen, dịch mã mARN và quá trình biến đổi sau dịch mã của protein.

NO là một gốc khí tự do nhỏ, có trọng lượng phân tử 30 Dalton, không màu và có nhiệt độ nóng chảy khoảng 163,6 °C.

Nitric oxide (NO) có một electron chưa ghép cặp, cho phép nó phản ứng với các nguyên tố kim loại chuyển tiếp để tạo thành nitrosyl kim loại, một đặc tính quan trọng trong con đường tín hiệu của nó Mặc dù NO tan kém trong nước, nhưng nó có khả năng dễ dàng vượt qua màng tế bào để điều hòa các quá trình sinh lý Tuy nhiên, NO không bền và có thời gian bán thải ngắn, đồng thời bị chuyển hóa nhanh chóng trong cơ thể.

Trong cơ thể, nitric oxide (NO) được tổng hợp qua hai con đường chính: thông qua enzym nitric oxide synthase (NOS) hoặc từ quá trình khử nitrat (NO2-) Enzym NOS xúc tác cho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O2 Ở động vật có vú, NOS có ba dạng chính, được mã hóa bởi các gen riêng biệt trên các nhiễm sắc thể khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1, NOS do cảm ứng (iNOS) hay NOS loại 2, và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 Con đường thứ hai để hình thành NO là từ phản ứng khử NO2-.

Phản ứng khử NO2- được thực hiện nhờ enzym NO2- reductase, cùng với các enzym chứa molypden như xanthin oxidase và nhiều thành phần trong chuỗi vận chuyển điện tử của ti thể Phản ứng này đặc biệt quan trọng trong điều kiện thiếu oxy, khi mà hoạt động của NOS bị hạn chế.

Trong cơ thể, nitric oxide (NO) được chuyển hóa qua quá trình oxy hóa thành NO2- và NO3- Quá trình này có thể xảy ra tự nhiên (autooxidation) hoặc dưới sự xúc tác Một phần NO bị bất hoạt trong điều kiện stress oxy hóa khi nó kết hợp với superoxide (O2-) để tạo thành peroxynitrit (ONOO-).

Bảng 1.1 Các dạng của NOS [13,69]

Tên phổ biến nNOS (Neuronal NOS) iNOS (Inducible NOS) eNOS (Endothelial NOS)

Neuron thần kinh và một số tế bào khác

Nhiều loại tế bào hệ thống miễn dịch như đại thực bào khi đáp ứng với lipopolysaccharid (LPS), cytokin và các chất khác

Gen NST 12, gồm 29 exon NST 17, 26 exon NST 7, 26 exon Đặc điểm Enzym cấu trúc Enzym cảm ứng Enzym cấu trúc

Hệ thần kinh trung ương có chức năng quan trọng trong việc học tập và ghi nhớ, đồng thời kiểm soát huyết áp Trong khi đó, hệ thần kinh ngoại vi đảm nhiệm vai trò của chất dẫn truyền thần kinh, giúp giãn cơ trơn và mạch máu.

Tham gia vào sinh lý bệnh của quá trình viêm và hệ thống miễn dịch

Tổng quan về viêm và COX-2

Viêm là phản ứng bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh, nhưng cũng có thể dẫn đến tổn thương và rối loạn chức năng cơ quan Phản ứng viêm được đặc trưng bởi tăng tính thấm của thành mạch, giãn mạch và sự xuyên mạch của bạch cầu, gây ra các dấu hiệu sưng, nóng, đỏ, đau Nhiều chất trung gian hoạt tính như histamin, bradykinin, prostaglandin và leucotrien tham gia vào quá trình này, trong đó prostaglandin (PG) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng viêm.

PG và thromboxan A2 (TXA2) là các prostanoid được hình thành từ acid arachidonic (AA), một acid béo không bão hòa Acid arachidonic được giải phóng từ phospholipid màng tế bào nhờ enzym phospholipase A2 và sau đó được oxi hóa bởi cyclooxygenase (COX) để tạo ra PGG2 và PGH2 PGH2 không bền và được chuyển hóa bởi các enzym prostaglandin synthase để sản xuất các prostaglandin khác nhau.

Có 4 PG hoạt tính sinh học chủ yếu được tạo ra trong in vivo đó là: prostaglandin E 2 (PGE 2 ), prostacyclin (PGI 2 ), prostaglandin D 2 (PGD 2 ) và prostaglandin F 2α (PGF 2α ) [33,61] Trong đó, PGE 2 đóng vai trò quan trọng trong viêm vì nó tham gia vào tất cả các quá trình dẫn đến các dấu hiệu kinh điển của viêm Cụ thể, PGE 2 gây giãn mạch, làm tăng dòng máu đến mô viêm, đồng thời cùng với các chất trung gian của quá trình viêm như histadin, bradykinin, leucotrien,PGE 2 làm tăng tính thấm của thành mạch gây thoát dịch và kết quả đỏ và sưng xuất hiện Đau là kết quả PGE 2 làm tăng nhạy cảm của các sợi thần kinh cảm giác ngoại vị và trung ương ở não và tủy sống dẫn đến tăng cảm giác đau Cuối cùng, PGE 2 được xem như một chất trung gian gây sốt Trong viêm, các PG còn làm khuếch đại các phản ứng viêm bằng cách tăng cường và kéo dài các tín hiệu gây ra bởi các chất tiền viêm [21,36]

Sự sản xuất của PG phụ thuộc nhiều vào hoạt tính của enzym COX Enzym này có 2 dạng chính là COX-1 (cyclooxygenase - 1) và COX-2 (cyclooxygenase –

COX-1 là enzyme được biểu hiện liên tục trong nhiều loại tế bào lành, đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất prostaglandin (PG) cần thiết cho các chức năng sinh lý bình thường như tăng tiết chất nhầy ở dạ dày, kết tập tiểu cầu và tăng sức lọc cầu thận Ngược lại, COX-2 là enzyme cảm ứng, thường không biểu hiện hoặc chỉ có mức độ rất thấp trong các mô bình thường, nhưng có thể được kích thích bởi các yếu tố tiền viêm và hormone.

Sự biểu hiện tăng lên của COX-2 là yếu tố quan trọng trong việc sản xuất các prostaglandin (PG) gây viêm và liên quan đến các bệnh lý viêm Do đó, COX trở thành mục tiêu chính cho các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs), và hiện nay, các NSAIDs tác dụng chọn lọc trên COX-2 đang là xu hướng nghiên cứu nổi bật.

Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin [33]

(Thromboxan A 2 , PGD 2 , PGE 2 , PGI 2 , và PGF 2α được tạo ra bởi các enzym prostaglandin synthase khác nhau gồm TxAS, PGDS, PGES, PGIS và PGFS)

COX-2 là một trong hai dạng chính của enzyme COX, chịu trách nhiệm cho hai bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp prostaglandin (PG) Gen mã hóa COX-2 nằm trên nhiễm sắc thể số 1, có kích thước khoảng 8 Kb và bao gồm 10 exon Enzyme này được coi là cảm ứng, chủ yếu tham gia vào việc sản xuất PG trong các phản ứng viêm Sự gia tăng biểu hiện của COX-2 đã được ghi nhận trong các mô hình viêm khớp ở động vật và trong dịch khớp của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp.

1.3.2.1 COX-2 trong một số bệnh lý a Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là tình trạng tích tụ cholesterol trong động mạch, dẫn đến hẹp và xơ cứng lòng mạch, gây ra các bệnh lý nghiêm trọng như hội chứng mạch vành cấp, đột quỵ và thiếu máu cục bộ Quá trình viêm trong các mảng xơ vữa đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh Nghiên cứu cho thấy enzym COX-1 xuất hiện ở cả động mạch bình thường và xơ vữa, trong khi COX-2 chỉ có trong động mạch xơ vữa, được biểu hiện bởi các tế bào như đại thực bào, bạch cầu mono và tế bào nội mô Enzym COX-2 có thể tham gia vào quá trình xơ vữa động mạch thông qua việc hoạt hóa các chất hóa hướng động, sản xuất cytokine gây viêm và thay đổi tính thấm của thành mạch.

Nghiên cứu trên chuột cho thấy celecoxib, một chất ức chế chọn lọc COX-2, có khả năng ngăn chặn sự tiến triển của tổn thương mảng xơ vữa, từ đó làm nổi bật vai trò của viêm và COX-2 trong xơ vữa động mạch Tuy nhiên, việc sử dụng các chất ức chế chọn lọc COX-2 cũng có thể gây bất lợi cho sự ổn định của mảng xơ vữa, dẫn đến tăng nguy cơ các biến cố tim mạch và tử vong.

Sinh mạch là quá trình hình thành các mạch máu mới từ mạch máu cũ, diễn ra trong phát triển phôi thai và liên quan đến nhiều rối loạn, đặc biệt là ung thư Nghiên cứu cho thấy các chất trung gian gây viêm như PGE 2, CRP, IL-6, và TNF α gia tăng trong ung thư Cụ thể, sự tăng tổng hợp PGE 2 và biểu hiện COX-2, nhưng không phải COX-1, đã được ghi nhận trong mô ung thư đại trực tràng so với mô lành Hơn nữa, cả hai loại NSAIDs, bao gồm loại không chọn lọc và chọn lọc COX-2, đã chứng minh khả năng ức chế sinh mạch và tăng sinh khối u trong các mô hình động vật, từ đó nhấn mạnh vai trò quan trọng của COX-2 trong sự tiến triển của ung thư.

Các prostaglandin, đặc biệt là PGE 2 và PGI 2, có vai trò quan trọng trong chức năng thận của người trưởng thành Chúng giúp giãn mạch thận, ức chế tái hấp thu natri ở ống thận, và điều chỉnh sự giải phóng renin cũng như phát triển thận trong giai đoạn bào thai Vai trò của COX-2 trong tổng hợp prostaglandin tại thận rất phức tạp, liên quan đến cả đáp ứng sinh lý và bệnh lý Nghiên cứu chỉ ra rằng, trong trường hợp suy thận, nồng độ mARN của các prostaglandin này có sự thay đổi đáng kể.

Sự tăng biểu hiện của COX-2 và hoạt tính của enzyme này liên quan đến sản xuất angiotensin II, dẫn đến tăng natri, tăng huyết áp cầu thận và viêm ống thận Các chất ức chế chọn lọc COX-2 đã cho thấy khả năng làm chậm quá trình xơ hóa cầu thận và giảm protein niệu trên chuột bị cắt bỏ một phần thận, gợi ý về vai trò tích cực của chúng trong điều trị suy thận.

1.3.2.2 Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2

Các thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal anti-inflammatory drugs

NSAIDs được sử dụng phổ biến trong điều trị lâm sàng nhờ vào tác dụng hạ sốt, giảm đau và chống viêm Tuy nhiên, chúng cũng gây ra nhiều tác dụng phụ, đặc biệt là viêm loét dạ dày tá tràng do ức chế không chọn lọc enzym COX-1 Để giảm thiểu tác dụng phụ này, xu hướng hiện nay là phát triển các NSAIDs có tác dụng chọn lọc trên enzym COX-2, như rofecoxib, celecoxib và valdecoxib, nhằm duy trì hiệu quả chống viêm Nghiên cứu về vai trò của COX-2 trong một số bệnh lý cũng mở ra hướng đi mới cho các tác dụng khác của thuốc ức chế chọn lọc COX-2, bao gồm khả năng chống ung thư Tuy nhiên, cần lưu ý rằng một trong những tác dụng phụ nghiêm trọng của các thuốc này là tăng nguy cơ bệnh tim mạch, do đó việc sử dụng cần thận trọng ở bệnh nhân có tiền sử tim mạch.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Dung môi, hóa chất và thiết bị

- Acetylcholin được mua từ Sigma-Aldrich và được pha với nước cất theo tỷ lệ 1:10 3 , 1:10 4 và 1:10 5

- Dung dịch nuôi Tyrode (Thành phần gồm: NaCl: 139,2 mM; KCl: 2,7 mM;

CaCl 2 : 1,8 mM; MgCl 2 : 0,49 mM; NaHCO 3 : 11,3 mM; Na 2 HPO 4 : 0,4 mM; glucose: 5,5 mM)

Nghiên cứu biểu hiện của eNOS và COX-2 được thực hiện bằng cách sử dụng bộ dụng cụ kiểm tra, chất chuẩn hóa, kháng thể và các dung môi, tất cả đều được mua từ các nhà cung cấp uy tín như Promega, Sigma-Aldrich và Santa Cruz.

- Hệ thống bình nuôi cô lập gồm 4 bình nuôi, với hệ thống ổn nhiệt và cung cấp oxy liên tục cho các bình nuôi

- Hệ thống ghi Powerlab 8.0 của công ty Austruments, Úc

- Máy đo mật độ quang Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific)

- Máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied Biosystems)

- Máy chụp Western blot Odyssey Fc Imager (LI-COR Biosciences).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập được thực hiện tại Bộ môn Sinh lý học, Học viện Quân Y, với quy trình thử thuốc rõ ràng và khoa học.

Sau khi cô lập cơ trơn và gắn vào bình nuôi, cần áp dụng một lực tác động cơ sở tương đương 2 g lên đoạn cơ trơn đã cô lập Sau đó, chờ 30 phút để hoạt động của cơ trơn ổn định.

Nhỏ 0,15 ml dung dịch acetylcholin với nồng độ từ 1:10³ đến 1:10⁵ vào bình nuôi Khi quan sát thấy sự thay đổi rõ rệt trong lực co cơ trên đồ thị, tiến hành thử nghiệm tác dụng của dược liệu.

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm bằng cách nhỏ 0,15 ml dung dịch mỗi loại dịch chiết dược liệu vào bình nuôi cô lập, với nồng độ từ 0,5 mg/ml đến 2 mg/ml Trong nghiên cứu này, bốn phân đoạn dược liệu (Cao tổng, phân đoạn n-hexan, phân đoạn diclomethan và phân đoạn n-butanol) được thử nghiệm với ba mức liều: 0,5 mg/ml, 1 mg/ml và 2 mg/ml, mỗi phân đoạn được thử nghiệm hai lần.

Theo dõi sự giãn cơ trơn của cơ quan cô lập trên đồ thị giúp đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dược liệu đến sự giãn cơ trơn này Việc phân tích các yếu tố dược liệu là cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế tác động của chúng đối với sự giãn nở của cơ trơn.

2.3.2 Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa

 Phân tích RT – PCR cho mARN của COX-2

ARN toàn phần được tách chiết từ tế bào bằng bộ Kit miRNeasy Mini Kit (Qiagen, #217004) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Mức độ biểu hiện mARN được phân tích bằng máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied Biosystems) với thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Xanh (Qiagen, #204156) và cặp mồi Ptgs2 (COX-2, QT00165347) có trình tự mồi xuôi 5’-GCCCAGCACTTCACGCATCAG-3’ và mồi ngược 5’-GACCAGGCACCAGACCAAAGACC-3’ Cặp mồi Mm_GADPH (QT01658692) có trình tự mồi xuôi 5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′ và mồi ngược 5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’.

Sau khi nuôi cấy, các tế bào sẽ được thu gom và rửa sạch bằng dung dịch PBS (Phosphate buffer saline), bao gồm các thành phần NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM và KH2PO4 1,8 mM.

- Ly giải tế bào bằng 100 àl dung dịch đệm gồm NaCl 120 mM, Tris 40 mM (pH 8), NP40 0,1% trong đá ở thời gian 30 phút

- Ly tâm tốc độ 13.000 vòng/ phút trong 20 phút Phần dung dịch phía trên được thu thập và nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford

- Ủ phần dung dịch chứa protein ở 95 °C trong 5 phút và điện di trên gel SDS - polyacrylamid 10%

- Chuyển protein trong gel sang màng nitrocellulose

Ủ kháng thể đơn dòng sơ cấp chuột chống COX-2 để nghiên cứu biểu hiện của COX-2 và phosphoryl-eNOS, đồng thời nghiên cứu biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa và beta-actin Để phát hiện kháng thể sơ cấp, các màng được tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase.

Trong các phân tích Western blot, beta-actin được sử dụng như là protein chứng cho biểu hiện của các protein khác

Cuối cùng, protein được phát hiện thông qua việc sử dụng chất tăng cường phát quang, cho phép xác định các băng protein đích trên màng nitrocellulose (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

 Đo quang sản phẩm NO

Lượng NO trong môi trường nuôi cấy tế bào được xác định gián tiếp thông qua ion NO2- (nitrit) bằng cách sử dụng thuốc thử Griess Do NO có thời gian bán hủy ngắn và bị chuyển hóa thành NO2- và NO3- (nitrat) trong cơ thể, việc phân tích chính xác lượng NO tổng số cần theo dõi cả nồng độ NO2- và NO3- Thuốc thử Griess bao gồm sulfanilamid và N-1-naphthylethylenediamin dihydrochlorid (NED), trong đó sulfanilamid phản ứng với NO2- tạo thành muối diazoni, sau đó muối này phản ứng với NED để hình thành hợp chất azo màu hồng với cực đại hấp thụ ở bước sóng 540 nm.

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO 2 -

Mụi trường tế bào HUVEC (100 àl) sau khi được ủ 24 giờ với 30 àg/ml dịch chiết dược liệu, được ủ tiếp với enzym nitrit reductase trong 1 giờ ở 37 ° C để khử

NO 3 - thành NO 2 - Thờm thuốc thử Griess 100 àl sau đú và mẫu được đem đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm

Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Khoa học Y học thực nghiệm, Khoa

Y, Đại học Lund, Thụy Điển (Department of Experimental Medical Science, Faculty of Medicine, Lund University, Sweden)

Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0, với kết quả được trình bày dưới dạng X ± SE (X là giá trị trung bình và SE là sai số chuẩn) Để so sánh giá trị trung bình giữa các lô, phương pháp kiểm định one-way ANOVA được áp dụng, kèm theo kiểm định hậu Tukey hoặc Dunnett’s T3 để so sánh từng lô Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

- Hình ảnh điện di protein được xử lý bằng phần mềm Image J 1.49u để đưa ra dữ liệu định lượng cho kết quả protein trên bản điện di

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	2,15 MB