Khóa luận nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α glucosidae và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây ổi (psidium guajava l ) trồng tại việt nam

TỔNG QUAN

Bệnh đái tháo đường

1.1.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đường

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), đái tháo đường là một rối loạn chuyển hóa phức tạp, dẫn đến tăng đường huyết mạn tính Tình trạng này liên quan đến sự rối loạn trong chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein, thường do sự suy giảm tiết insulin và giảm hoạt tính của insulin.

Bệnh đái tháo đường đã được ghi nhận trong lịch sử y học từ rất sớm, với những mô tả về triệu chứng của bệnh xuất hiện trong tài liệu của người Ai Cập cổ đại từ khoảng 1.500 trước Công Nguyên.

Tài liệu cổ của Ấn Độ ghi nhận những bệnh nhân có triệu chứng uống nước nhiều và hiện tượng "ruồi bâu, kiến bậu" xuất hiện trong nước tiểu.

Y học cổ xưa đã phát triển nhiều phương pháp điều trị hiệu quả, bao gồm việc sử dụng thuốc lợi tiểu, tắm bồn nước nóng, rạch tĩnh mạch, tẩy giun và áp dụng các loại thảo mộc tự nhiên.

Vào năm 1674, Thomas Willis lần đầu tiên so sánh vị ngọt của đường trong nước tiểu với mật, từ đó thuật ngữ “diabetes mellitus” được hình thành và vẫn được sử dụng cho đến ngày nay.

Năm 1869, Paul Langerhans đã phát hiện ra tụy có hại loại tế bào

Năm 1872, Bouchardat phát hiện ra rằng nồng độ đường trong nước tiểu giảm ở những bệnh nhân nhịn đói lâu ngày hoặc theo chế độ ăn kiêng nghiêm ngặt Phát hiện này đã mở ra sự quan tâm đến chế độ ăn uống trong việc điều trị bệnh đái tháo đường.

Từ năm 1875 đến 1901, nghiên cứu về tế bào đảo tụy tiếp tục phát triển Năm 1901, Eugen Opie phát hiện rằng bệnh nhân đái tháo đường có tổn thương ở đảo tụy Langerhans, và ông cho rằng sự thiếu hụt chất do các tế bào này tiết ra là nguyên nhân gây ra bệnh đái tháo đường.

Vào năm 1906, George Zuelezer đã tiến hành thử nghiệm điều trị bệnh đái tháo đường bằng cách tiêm chiết xuất từ tụy, nhưng thử nghiệm này đã không thành công do bệnh nhân gặp phải tình trạng co giật.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Năm 1920, Frederick Banting và các đồng nghiệp đã thành công khi dùng chất chiết xuất của tụy để nuôi sống những con chó đã bị cắt tuyến tụy

Họ đã đặt tên cho chất này là “isletin”

Năm 1921, chất isletin lần đầu tiên được thử nghiệm trên một bệnh nhân 14 tuổi, giúp hạ mức glucose máu từ 440 mg/dL xuống 320 mg/dL Cùng thời điểm này, giáo sư Macleod tại trường đại học Toronto đã sử dụng huyết thanh này để điều trị bệnh nhân và đổi tên "isletin" thành "insulin".

Từ năm 1922, insulin đã được nghiên cứu và thương mại hóa, mang lại sự tiện lợi cho người sử dụng, mặc dù giá thành vẫn cao Năm 1979, công nghệ AND tái tổ hợp đã được áp dụng để sản xuất insulin, và đến năm 1982, insulin tái tổ hợp ra đời, giúp giảm giá thành và hỗ trợ hàng triệu bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới.

Năm 1998, Anh đã công bố một nghiên cứu quan trọng cho thấy liệu pháp điều trị tích cực có vai trò quyết định trong việc hỗ trợ người mắc bệnh tiểu đường type 2 và giảm thiểu các biến chứng mạn tính liên quan đến bệnh này.

1.1.2 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và tại Việt Nam

Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), năm 2015 có 415 triệu người lớn (20-79 tuổi) mắc bệnh đái tháo đường, và dự đoán đến năm 2040, con số này sẽ tăng lên khoảng 642 triệu Sự gia tăng này, cùng với việc trẻ em ngày càng sử dụng thực phẩm không lành mạnh và thiếu hoạt động thể lực, đã dẫn đến sự gia tăng bệnh đái tháo đường type 2 ở trẻ em, trở thành một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng.

Bệnh đái tháo đường gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận và cắt cụt chi Tuy nhiên, có tới 70% trường hợp đái tháo đường type 2 có thể được dự phòng hoặc làm chậm sự phát triển của bệnh thông qua lối sống lành mạnh, chế độ dinh dưỡng hợp lý và tăng cường luyện tập thể lực.

Tại Việt Nam, tỷ lệ bệnh tiểu đường (ĐTĐ) đã có sự gia tăng đáng kể từ năm 1990, khi tỷ lệ chỉ là 1,1% ở Hà Nội và 2,25% ở Hồ Chí Minh Theo nghiên cứu của Bệnh viện Nội tiết trung ương năm 2012, tỷ lệ hiện mắc ĐTĐ ở người trưởng thành đã lên tới 5,42%, với 63,6% trong số đó chưa được chẩn đoán Thêm vào đó, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose toàn quốc là 7,3% và rối loạn glucose máu lúc đói là 1,9% vào năm 2003 Kết quả điều tra STEPwise năm 2015 cho thấy tỷ lệ ĐTĐ ở nhóm tuổi từ 18-69 là 4,1% và tiền đái tháo đường là 3,6%.

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh đái tháo đường type 2

Bệnh đái tháo đường type 2, hay còn gọi là đái tháo đường không phụ thuộc insulin, thường xuất hiện ở người trên 40 tuổi và có tình trạng béo phì Đây là một rối loạn mạn tính, nguyên nhân do sự tương tác giữa yếu tố di truyền và môi trường.

1.1.3.1 Thừa cân và béo phì

Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m 2 ) và béo phì (BMI > 30 kg/m 2 ) trên thế giới được dự đoán sẽ tăng lên 57,8% vào năm

Tổng quan về enzym α-glucosidase và PTP1B

1.2.1 Tổng quan về enzym 1.2.1.1 Khái niệm

Enzym là chất xúc tác sinh học được tạo ra từ protein trong tế bào, có cấu trúc hóa học đặc thù Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của sinh vật, thúc đẩy các phản ứng hóa học diễn ra nhanh chóng mà không cần điều kiện đặc biệt như nhiệt độ hay áp suất Enzym có thể được chiết xuất từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật.

Enzym trong cơ thể sinh vật đóng vai trò xúc tác chọn lọc, định hướng mọi phản ứng tế bào Ngoài ra, nhiều enzym vẫn duy trì khả năng hoạt động khi ở ngoài tế bào.

Chất ức chế enzym là những hợp chất có khả năng làm giảm hoặc ngăn chặn hoàn toàn hoạt động của enzym Chúng có thể có nguồn gốc hóa học đa dạng, bao gồm ion kim loại, anion, hợp chất hữu cơ nhỏ hoặc protein Các chất ức chế này có thể tương tác với enzym theo hai cách: phản ứng thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong đó, có hai loại ức chế thuận nghịch chính là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh.

1.2.2 Tổng quan về enzym α-glucosidase 1.2.2.1 Danh pháp và phân loại

Enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) còn có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase glucoamylase, α- glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucoside hydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-glucoside glucohydrolase [7]

Enzym α-glucosidase là một enzym quan trọng với hoạt tính exohydrolysis, có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4-glycoside ở đầu không khử của carbohydrate, từ đó giải phóng các phân tử α-D-glucose Chất nền đặc trưng của enzym này bao gồm các disaccharide, oligosaccharide, và các aryl- và akyl-α-glucopyranoside khác.

Enzym α-glucosidase thuộc lớp glycoside hydrolase, là nhóm enzym có khả năng tách liên kết glycoside giữa các phân tử carbohydrate Đây là một trong những liên kết mạnh nhất trong các polymer tự nhiên Các enzym glycoside hydrolase có khả năng bẻ gãy các liên kết này nhanh hơn 10^17 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác.

Carbohydrat trong thực phẩm là nguồn cung cấp đường cho cơ thể Khi vào cơ thể, carbohydrat được enzym trong ruột non thủy phân thành các phân tử đường đơn, từ đó cung cấp năng lượng cho các tế bào.

Tiến trình phân hóa carbohydrat bắt đầu khi tụy tiết ra α-amylase, giúp phá vỡ các phân tử lớn thành oligosaccharid Sau đó, màng tế bào ruột non tiết ra α-glucosidase, enzym này tiếp tục phân hóa oligosaccharide thành các phân tử đường đơn để thẩm thấu vào máu Chức năng chính của α-glucosidase là cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất, giải phóng α-D-glucose.

Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy phân của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu [12]

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym α-glucosidase a Các chất tổng hợp Acarbose và miglitol đang được sử dụng rộng rãi như thuốc điều trị đái tháo đường type 2 Cơ chế hoạt động của các thuốc này là ức chế enzym α- glucosidase ở ruột Cụ thể chất ức chế α-glucosidase là các saccharide hoạt động như chất ức chế sự cạnh tranh của các enzym cần thiết để tiêu hóa carbohydrate, đặc biệt là enzym α-glucosidase

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử Acarbose b Các chất tự nhiên

Hiện nay, nhiều hợp chất tự nhiên như flavonoid, anthocyanidin, isoflavone, phenolic, curcuminoids và terpinoid đã được phát hiện là những chất ức chế enzym α-glucosidase Sự quan tâm toàn cầu đối với việc tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng, đặc biệt khi các hợp chất hóa học thường gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn.

Bảng 1.1 Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase [22]

STT Nhóm hợp chất Tên hoạt chất

Apigennin Hesperetin (+)-catechin Cyanidin-3-galactoside Cyanidin-3- galactoside 2R,3R,4R,5R)2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4- dihydroxypyrrolidine

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l- arabinopyranosyl-(1→3)- β -d- xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester,…

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l- arabinopyranosyl-(1→3)- β -d- xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester, …

Chebulanin Chebulagic axit Chebulinic axit (-)-3- O-galloylepicatechin (-)-3-O-galloylcatechin

1.2.3 Tổng quan về enzym PTP1B (protein tyrosine phosphatase 1B) 1.2.3.1 Danh pháp và phân loại

PTP1B (EC 3.1.3.48) là viết tắt của protein tyrosin phosphatase 1B, một enzym thuộc phân họ pTyr PTP cổ điển, là một trong bốn phân họ của siêu họ enzym Protein Tyrosin Phosphatase.

PTP1B là một loại protein gồm 435 axit amin, với vùng xúc tác nằm từ axit amin thứ 30 đến thứ 278 Đầu C kị nước của protein này là điểm gắn kết enzym vào bề mặt lưới nội chất Cấu trúc đặc trưng của PTP1B bao gồm vòng xúc tác với đơn phân Cys215, vòng WPD (gồm tryptophan, prolin và axit aspartic) cùng với vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp.

Trung tâm hoạt động của PTP1B có cấu trúc tương tự như các protein phosphatase khác, với vị trí xúc tác chính nằm ở các axit amin 214-221 (His-Cys-Ser-Ala-Gly-Ile-Gly-Arg) Vòng 8 axit amin này có cấu trúc ổn định, hỗ trợ việc tương tác với gốc aryl-phosphat của cơ chất, đồng thời chứa vị trí ái nhân Cys215 Bốn axit amin khác (Asp181, Phe182, Tyr46, Val49, Lys120 và Gln262) tạo thành các cạnh của khe xúc tác, góp phần vào quá trình xúc tác và nhận diện cơ chất Chiều sâu của khe xúc tác đạt 8-9Å, phù hợp cho cơ chất đặc hiệu.

Vòng WPD, với sự thay đổi hình dạng của PTP1B, ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzym khi liên kết với cơ chất Khi vòng WPD (axit amin 79-187) di chuyển tới 12Å, nó đóng vòng phenyl của cơ chất, từ đó tăng cường tương tác kị nước.

Asp181 di chuyển đến vị trí hoạt động như một axit, giúp chuyển proton cho nhóm tyrosyl Arg221 thay đổi vị trí để tối ưu hóa tương tác "cầu muối" với phosphat Trong quá trình chuyển dạng, Cys215 đóng vai trò là vị trí liên kết ái nhân với nguyên tử phospho của cơ chất, cho thấy rằng tác nhân ức chế PTP1B có thể ảnh hưởng đến toàn bộ quá trình chuyển dạng này.

“mở” và “đóng” của PTP1B [29]

Vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp là một vị trí xúc tác không hoạt động, tạo ra liên kết yếu hơn so với vị trí hoạt động cơ bản do tiếp xúc nhiều hơn với môi trường Mặc dù vậy, vị trí này đóng vai trò quan trọng trong việc thiết kế các tác nhân ức chế PTP1B.

Vùng xúc tác có chứa 3 tiểu phân (cystein, aspatat và glycin) – là 3 axit amin cần thiết cho quá trình xúc tác

Đặc điểm thực vật, phân bố của cây ổi tại Việt Nam

1.3.1 Vị trí phân loại thực vật

Cây ổi thuộc loài Psidium guajava L., chi Psidium L., họ Sim

(Myrtaceae), bộ Sim (Myrtales), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [42]

Cây ổi, thuộc Họ Sim (Myrtaceae), có khoảng 3.000 loài và phân bố trong 130-150 chi, chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm áp trên toàn thế giới Chi Ổi (Psidium) có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ với khoảng 100 loài cây bụi Hiện nay, cây ổi được trồng rộng rãi ở nhiều khu vực như Châu Phi, Nam Á, Đông Nam Á, vùng Caribbean, cận nhiệt đới Bắc Mỹ và Úc.

[2] Ở Việt Nam cây ổi thường (Psidium guajava L.) được phát triển trên khắp cả nước từ đồng bằng ven biển cho đến vùng núi có độ cao khoảng 1500 m trở xuống [2]

1.3.3 Đặc điểm thực vật Ổi hay còn gọi là ủi, phan thạch lựu là cây thân gỗ sống lâu năm, thân phân cành nhiều, cao 4-6 m, cao nhất 10 m, đường kính thân tối đa 30 cm

Thân cây ngắn, chắc khỏe và nhẵn nhụi, với vỏ già có khả năng tróc ra từng mảng, trong khi vỏ mới có màu xám, hơi xanh Cành non có hình dạng 4 cạnh và sẽ dần tròn khi trưởng thành.

Rễ ổi là loại rễ cọc, có khả năng ăn sâu xuống đất từ 3 đến 4 mét hoặc hơn Lá ổi đơn, mọc đối và không có lá kèm, có phiến hình bầu dục với kích thước dài từ 11-16 cm và rộng từ 5-7 cm Gốc lá thuôn tròn, đầu lá có lông gai hoặc lõm, mặt trên lá có màu xanh đậm hơn so với mặt dưới.

Lá non của cây có đường viền màu hồng tía kéo dài đến cuống lá, phủ lớp lông trắng nhạt và có vị chát Gân lá hình lông chim, với gân giữa nổi bật ở mặt dưới Cuống lá có màu xanh, hình trụ dài từ 1 đến 1,3 cm, với rãnh cạn ở mặt trên Hoa của cây lớn, màu trắng, lưỡng tính, thường mọc thành chùm từ 2 đến 3 bông, chủ yếu ở nách lá thay vì ở đầu cành.

Cây có 4-5 lá đài và 4-5 cánh hoa, với nhiều nhị và bầu dưới 5 ô Quả có hình tròn, hình trứng hoặc hình quả lê, dài từ 3-10cm Vỏ quả non có màu xanh và chuyển sang vàng khi chín, trong khi thịt vỏ có thể màu trắng, vàng hoặc ửng đỏ Ruột quả có màu trắng, vàng hoặc đỏ, với vị chua ngọt hoặc ngọt và mùi thơm đặc trưng Hạt quả nhiều, màu vàng nâu, hình đa giác, có vỏ cứng và nằm trong khối thịt quả có màu trắng, hồng hoặc đỏ vàng.

Cây ổi phát triển tốt trong nhiệt độ từ 15,5°C đến 32°C, ưa sáng và thích khí hậu ẩm Loài cây này có thể trồng trên nhiều loại đất với pH phù hợp từ 4,5 đến 8,2.

Theo nghiên cứu của đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh cho biết, trong lá ổi có chứa [5]:

- Tanin (7-10%) gồm gallotanins, axit ellagic

- Tinh dầu (0,31%) trong đó có aromadendrene, beta-bisabolene, caryophyllene, nerolidiol, selinene, dl limonene, các ancol thơm…

- Các axit hữu cơ gồm axit mastinic, axit aleanolic, axit oxalic, axit guaijavolic, axit guajanoic, axit crategolic, axit psidiolic, axit ursolic

- Flavonoid gồm quercetin, leucocyanidin, avicularin, guaijaverin

- Lá non và búp non có khoảng 7-10% tanin loại pyrogallic và 3% nhựa

1.3.5 Tác dụng và công dụng

Theo y học cổ truyền, lá ổi có vị đắng và tính ấm, có tác dụng tiêu thũng, giải độc, và thu sáp chỉ huyết Trong khi đó, quả ổi có vị ngọt hơi chua, cũng tính ấm, giúp thu liễm và kiện vị cố tràng Các bộ phận của cây ổi thường được sử dụng để chữa trị nhiều bệnh lý như tiêu chảy, lỵ mạn tính, viêm dạ dày ruột, và các triệu chứng liên quan đến tiểu đường và băng huyết.

Beta-sitosterol có trong lá ổi được sử dụng như một phương thuốc để điều trị cholesterol cao và các bệnh tim mạch Theo FDA, thực phẩm chứa ester sterol thực vật như beta-sitosterol có khả năng làm giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành.

Quercetin được biết đến như một chất chống oxi hóa mạnh, chống viêm hay giúp làm giảm cholesteron[25] Avicularin, guaijaverin có tác dụng ức chế tụ cầu [44]

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của Beta-sitosterol

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Quercetin [25]

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của Guaijaverin [45]

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của Avicularin [45]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu và thiết bị

Lá ổi tươi được thu hái vào tháng 10 năm 2018 ở Long Biên, Hà Nội

Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

Lá ổi tươi được rửa sạch, sấy khô ở 75-80°C, nghiền nhỏ Lá khô (1,04kg) chiết với Ethanol 96% (3,24L x 3 lần) bằng phương pháp ngấm kiệt

Dịch chiết được lọc và gộp lại, cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không thu được cao Ethanol toàn phần (350g) Lấy 30g cao toàn phần phân tán trong

350 mL nước cất rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, EtOAc, BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 350mL)

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 2.1.3.1 Hóa chất

The study utilized various reagents and enzymes sourced from Sigma in Singapore, including α-glucosidase, p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), 4-Nitrophenol, p-Nitrophenyl phosphate (pNPP), and PTP1B Additionally, 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) was employed, along with ursolic acid obtained from Himedia in India.

Dung môi: n – Hexan, Ethyl acetat (EtOAc), n – Buthanol (n-BuOH), Ethanol 96% (EtOH) (Shouguang, Trung Quốc) và nước cất

Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản)

Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức)

Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal

Pipet, bình định mức, cối xứ, giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

Dưới tác dụng của enzym α-glucosidase, cơ chất p-nitrophenyl-α-D- glucopyranosid (PNP-G) bị thủy phân tạo ra α-D-glucose và p-nitrophenol

Nồng độ p-nitrophenol tỷ lệ thuận với hoạt động của enzym α-glucosidase Để xác định nồng độ p-nitrophenol trong dung dịch, phương pháp đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 405nm được sử dụng Hoạt tính của enzym α-glucosidase được đánh giá dựa trên độ hấp thụ màu của mẫu thử so với mẫu chứng tại 405nm.

Hình 2.1 Phản ứng thủy phân PNP-G dưới tác dụng của enzym α- glucosidase [7]

Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự [21] Cụ thể như sau:

- Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong đệm phosphate

10 mM (pH 6.8) và 50 l được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64 g/ml; 16 g/ml; 4 g/ml

- 20 àl α- glucosidase (0,5U/ml) và 130 àl đệm phosphate 100 mM (pH 6.8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37 o C trong 15 phút p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid

- Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37 o C trong 60 phút

Trong thí nghiệm, đĩa thí nghiệm chứa mẫu thử, đệm phosphate và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng Đối chứng cho giếng thí nghiệm là DMSO 10%, đệm phosphate, enzym và pNPG Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác.

- Dừng thớ nghiệm bằng cỏch thờm vào 80 àl Na 2 CO 3 0,2M và đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad)

- Khả năng ức chế enzym α- glucosidase của mẫu thử được xác định theo công thức sau:

% ức chế = 100 - (Amẫu thử/ A đối chứng *100) Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank

Amẫu thử = ODmẫu thử - OD blank mauthu

2.2.1.2 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

2.2.2 Đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B in vitro

Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B được thực hiện ở nhiệt độ 30°C, trong đó cơ chất p-nitrophenyl phosphate (pNPP) bị phosphoryl hóa dưới tác dụng của PTP1B, tạo ra p-nitrophenol (PNP) Nồng độ PNP trong dung dịch được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm Sự hiện diện của chất ức chế dẫn đến giảm nồng độ PNP, từ đó cho phép xác định nồng độ enzym PTP1B dựa trên sự chênh lệch giữa mẫu thử và mẫu chứng.

Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym PTP1B được thực hiện theo cách đã được Hung và cộng sự mô tả, với những điều chỉnh phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.

Cơ chất là p-nitrophenyl phosphate (pNPP) được sử dụng trong thí nghiệm Dung dịch đệm gồm có 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic axit), và 50 mM citrate (pH 6.0)

Thí nghiệm được thực hiện bằng cách kết hợp 10 L mẫu thử với 20 L enzym PTP1B (1 g/ml) và 40 L pNPP 4 mM trong 130 L dung dịch đệm trong đĩa 96 giếng Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 37 độ C trong 30 phút Để dừng phản ứng, thêm 10 L NaOH 1M, và đo lượng p-nitrophenol sinh ra bằng cách xác định độ hấp thụ quang tại bước sóng 405 nm.

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ba lần, sử dụng axit ursolic làm chứng dương Phần trăm ức chế hoạt động của enzym PTP1B (% I) được tính toán theo công thức đã định.

Trong đó: I% phần trăm hoạt tính PTP1B bị ức chế

Ac : độ hấp thu của mẫu chứng (khụng chứa 10 àL dung dịch thử)

At : độ hấp thu của mẫu thử

Ao : độ hấp thu của mẫu trắng

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê sử dụng phần mềm SigmaPlot 10 (Systat Software Inc, Mỹ) Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả chiết xuất và phân đoạn dịch chiết lá ổi

Sau khi sấy khô và nghiền nhỏ 1kg lá ổi, chiết xuất bằng Ethanol 96% thu được 350g cao toàn phần Từ 30g cao toàn phần, tiến hành chiết phân đoạn với n-Hexan, EtOAc và n-Buthanol, cho ra ba loại cao phân đoạn: 8,31g cao n-Hexan, 2,43g cao EtOAc và 18,12g cao n-Buthanol.

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá ổi

Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

Cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lỏ ổi đã được thử nghiệm khả năng ức chế enzym α-glucosidase ở các nồng độ 128, 32, 8, và 2 µg/mL Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác và kết quả trung bình được ghi nhận Acarbose được sử dụng làm chất đối chứng dương Kết quả cho thấy khả năng ức chế enzym của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ, như thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi và Acarbose

STT Mẫu ức chế tại các nồng đ

Bảng 3.1 tóm tắt giá trị IC50 của các chiết xuất và Acarbose cho thấy tác dụng ức chế α-glucosidase tăng dần theo nồng độ Các chiết xuất toàn phần EtOH, n-Hexan, EtOAc và BuOH có khả năng ức chế α-glucosidase cao với IC50 lần lượt là 2,20; 2,53; 2,24 và 2,16 àg/mL, so với Acarbose có IC50 139,52 àg/mL Đặc biệt, phân đoạn BuOH đạt hiệu quả ức chế 99,86% tại nồng độ 128 àg/ml và 98,05% tại 32 àg/ml Cao chiết toàn phần cũng cho thấy hiệu quả ức chế 98,73% tại nồng độ 128 àg/ml, trong khi hai phân đoạn EtOAc và n-Hexan có tác dụng ức chế đáng kể.

The study conducted by the School of Medicine and Pharmacy, VNU, indicates that the inhibitory effect was weaker at a concentration of 128 µg/ml, with effectiveness rates of 96.08% and 90.84% Additionally, the positive control, acarbose, demonstrated stable activity throughout the experiment.

Tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro

Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi được thử nghiệm tại các nồng độ 1000; 500; 250; 125; 62,5;

Kết quả thử nghiệm cho thấy nồng độ 31,25 àg/mL cho khả năng ức chế enzym của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ, với axit usolic được sử dụng làm chất đối chứng dương Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác và kết quả trung bình được ghi nhận trong bảng 3.2 và bảng 3.3.

Bảng 3.2 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi

Bảng 3.3 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của axit ursolic

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết lá ổi

EtOH n-Hexane EtOAc BuOH Ức chế

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của axit ursolic

Bảng 3.2 và 3.3 trình bày giá trị IC50 của dịch chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết và axit ursolic Tác dụng ức chế PTP1B của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Trong đó, phân đoạn dịch chiết EtOAc và BuOH thể hiện khả năng ức chế cao nhất với IC50 lần lượt là 120,23 và 97,72 µg/mL, so với chứng dương axit ursolic có IC50 là 19,7 µg/mL Ngược lại, phân đoạn n-Hexan cho thấy tác dụng ức chế enzym PTP1B thấp nhất với IC50 là 204,17 µg/mL.

BÀN LUẬN

Đái tháo đường type 2 hiện đang trở thành bệnh lý phổ biến nhất toàn cầu, chiếm 90% tổng số ca mắc tiểu đường và có tỷ lệ tử vong cao Đây là một bệnh lý chuyển hóa mạn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm ảnh hưởng đến các cơ quan như tim, thận và mạch máu Các biến chứng có thể dẫn đến di chứng nghiêm trọng như mù mắt hoặc phải cắt cụt chi Bệnh đái tháo đường type 2 và các biến chứng của nó không chỉ ảnh hưởng nghiêm trọng đến cuộc sống của người bệnh mà còn đang có xu hướng gia tăng ở độ tuổi trẻ.

Nhiều nghiên cứu toàn cầu đang tìm kiếm các loại thuốc mới để điều trị hiệu quả bệnh tiểu đường type 2, nhằm giảm thiểu biến chứng và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân Các nhà khoa học đang chuyển hướng sang nghiên cứu thuốc thảo dược an toàn với ít tác dụng phụ, trong đó có những loại thuốc ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B Ổi, một loại cây phổ biến trên toàn thế giới, đang được xem xét trong các nghiên cứu này.

Các bộ phận của cây ổi, đặc biệt là lá và quả, đã được sử dụng từ xa xưa cho nhiều mục đích khác nhau trên toàn thế giới Quả ổi không chỉ là thực phẩm mà còn có tác dụng chữa bệnh Theo y học cổ truyền, lá ổi có vị đắng, tính ấm, giúp tiêu thũng, giải độc và cầm máu Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất trong lá ổi có khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa và giảm cholesterol Lá ổi có tiềm năng trở thành nguyên liệu mới trong sản xuất thuốc tự nhiên để điều trị nhiều bệnh, bao gồm đái tháo đường type 2 Nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B từ các phân đoạn dịch chiết lá ổi, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về loại lá này.

Enzym α-glusidase là một enzym quan trọng nằm trong màng đường ruột, tham gia vào bước cuối của quá trình tiêu hóa, giúp phân hủy các đường disaccaride như sucrose và maltose thành monosaccharide như glucose Vì vậy, các chất ức chế α-glusidase đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình tiêu hóa và kiểm soát mức đường huyết.

Trong điều trị bệnh tiểu đường type 2, các chất ức chế α-glucosidase như acarbose, voglibose và miglitol thường gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn như đau bụng và tiêu chảy Nghiên cứu cho thấy rằng các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi, đặc biệt là phân đoạn BuOH, có khả năng ức chế enzym tốt với IC50 là 2,16, trong khi các phân đoạn khác cũng thể hiện khả năng ức chế đáng kể, mặc dù còn chứa nhiều tạp chất Đái tháo đường type 2 liên quan đến đề kháng insulin, do suy giảm tín hiệu từ các thụ thể insulin, và PTP1B được xác định là enzym điều hòa ngược tín hiệu insulin quan trọng, cần thiết để kết thúc tín hiệu bằng cách khử phospho của phân tử IRβ và các phân tử tiếp theo.

Enzym PTP1B khi tăng hoạt động sẽ làm tăng quá trình khử phospho hóa IRβ, dẫn đến giảm tín hiệu insulin và kháng insulin Do đó, giảm hoạt động của PTP1B có thể làm tăng độ nhạy insulin, mở ra tiềm năng cho các hợp chất ức chế PTP1B trong điều trị bệnh đái tháo đường type 2 và béo phì Các hợp chất có trong lá ổi bao gồm morin flavonoid, morin-3-O-lyxosyde, morin-3-O-arabinoside, quercetin, quercetin-3-O-arabinoside, glycosides, alkaloids, saponins và tritecpenoid.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng hạ đường huyết của cây ổi Một nghiên cứu của Haseena Banu và cộng sự cho thấy, khi sử dụng cao chiết lá ổi với liều 300 mg/kg thể trọng, có thể giảm đường huyết ở chuột mắc tiểu đường do streptozotocin Kết quả cho thấy cao chiết lá ổi không chỉ hạ glucose máu và nồng độ HbA1c mà còn làm tăng đáng kể lượng insulin trong huyết tương, đồng thời cải thiện hoạt tính của các enzym chuyển hóa carbohydrate như hexokinase và pyruvate kinase.

Nghiên cứu cho thấy cao chiết nước từ lá ổi với liều 250 mg/kg có tác dụng hạ đường huyết đáng kể trên mô hình chuột tiểu đường do alloxan Ngoài ra, tiêm dịch chiết lá ổi với liều 10 mg/kg có khả năng ức chế protein tyrosine phosphatase 1B ở chuột tiểu đường mang gen Lepr(db)/Lepr(db).

Nghiên cứu dài hạn trên chuột cho thấy việc sử dụng cao chiết nước hoặc ethanol từ lá ổi có khả năng tăng nồng độ insulin huyết tương và cải thiện vận chuyển glucose vào các cơ quan dự trữ như gan và cơ Đồng thời, nó cũng làm tăng hoạt tính của các enzym hexokinase, phosphofructokinase và glucose-6-phosphate dehydrogenase ở chuột bị tiểu đường Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng lá ổi hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường thông qua cơ chế ức chế enzym glucosidase và Protein Tyrosin Phosphatase 1B.

Tiêu đề	Nghiên Cứu Tác Dụng Ức Chế Enzym α-Glucosidase Và Enzym PTP1B In Vitro Của Dịch Chiết Lá Cây Ổi (Psidium Guajava L.) Trồng Tại Việt Nam
Tác giả	Trần Trọng Nghĩa
Người hướng dẫn	PGS.TS. Bùi Thanh Tùng
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	49
Dung lượng	1,1 MB