Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidae và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.) trồng tại Việt Nam

Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidae và enzym PTP1B in vitro của dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.) trồng tại Việt Nam với mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidae in vitro của các phân đoạn dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.). Đánh giá tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro của các phân đoạn dịch chiết lá cây ổi (Psidium Guajava L.).

TỔNG QUAN

Bệnh đái tháo đường

1.1.1 Tổng quan về bệnh đái tháo đường

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), đái tháo đường là một rối loạn chuyển hóa phức tạp, gây ra bởi nhiều nguyên nhân khác nhau Bệnh này đặc trưng bởi tình trạng tăng đường huyết mạn tính, kèm theo sự rối loạn trong chuyển hóa carbohydrat, chất béo và protein Nguyên nhân chính dẫn đến đái tháo đường là do sự suy giảm tiết insulin và giảm hoạt tính của insulin trong cơ thể.

Bệnh đái tháo đường đã được ghi nhận từ rất sớm trong lịch sử y học, với những tài liệu từ khoảng 1.500 năm trước công nguyên của người Ai Cập cổ đại mô tả các triệu chứng tương tự như bệnh đái tháo đường hiện nay.

Các tài liệu cổ của Ấn Độ đã ghi chép về những bệnh nhân có triệu chứng uống nước nhiều, cùng với hiện tượng "ruồi bâu, kiến bậu" xuất hiện trong nước tiểu.

Y học cổ xưa đã phát triển nhiều phương pháp điều trị, bao gồm việc sử dụng thuốc lợi tiểu, tắm bồn nước nóng, rạch tĩnh mạch, tẩy giun và áp dụng các loại thảo mộc.

Năm 1674, Thomas Willis đã lần đầu tiên so sánh vị ngọt của đường trong nước tiểu với mật, từ đó thuật ngữ “diabetes mellitus” ra đời và vẫn được sử dụng cho đến ngày nay.

Năm 1869, Paul Langerhans đã phát hiện ra tụy có hại loại tế bào

Vào năm 1872, Bouchardat phát hiện rằng lượng đường trong nước tiểu giảm ở những bệnh nhân nhịn đói lâu ngày hoặc theo chế độ ăn kiêng nghiêm ngặt Phát hiện này đã thu hút sự chú ý đến chế độ ăn uống như một phương pháp điều trị bệnh tiểu đường.

Từ năm 1875 đến 1901, các nghiên cứu về tế bào đảo tụy tiếp tục diễn ra Năm 1901, Eugen Opie phát hiện rằng bệnh nhân đái tháo đường có tổn thương ở đảo tụy Langerhans Ông cho rằng sự thiếu hụt các chất do tế bào đảo tụy tiết ra là nguyên nhân gây ra bệnh đái tháo đường.

Năm 1906, George Zuelzer đã tiến hành thử nghiệm điều trị bệnh đái tháo đường bằng cách tiêm chiết xuất từ tụy, nhưng thử nghiệm này không thành công do bệnh nhân gặp phải co giật.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Năm 1920, Frederick Banting và các đồng nghiệp đã thành công khi dùng chất chiết xuất của tụy để nuôi sống những con chó đã bị cắt tuyến tụy

Họ đã đặt tên cho chất này là “isletin”

Năm 1921, chất isletin lần đầu tiên được thử nghiệm trên một bệnh nhân 14 tuổi, giúp giảm nhanh chóng mức glucose máu từ 440 mg/dL xuống 320 mg/dL Cùng thời điểm này, giáo sư Macleod tại trường đại học Toronto đã sử dụng huyết thanh này trong điều trị và đổi tên "isletin" thành "insulin".

Từ năm 1922, insulin đã được nghiên cứu và bán trên thị trường, mang lại sự tiện lợi cho người dùng, mặc dù giá vẫn còn cao Vào năm 1979, insulin được sản xuất bằng công nghệ AND tái tổ hợp, và đến năm 1982, insulin tái tổ hợp thành công, giúp giảm giá thành và hỗ trợ hàng triệu bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới.

Năm 1998, nghiên cứu tại Anh đã chỉ ra rằng liệu pháp điều trị tích cực có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ người bệnh đái tháo đường type 2 và giảm thiểu các biến chứng mạn tính liên quan đến bệnh này.

1.1.2 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và tại Việt Nam

Theo Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF), vào năm 2015, có 415 triệu người lớn (từ 20 đến 79 tuổi) trên toàn cầu sống với bệnh đái tháo đường, và dự đoán con số này sẽ tăng lên khoảng 642 triệu vào năm 2040 Đồng thời, bệnh đái tháo đường type 2 đang gia tăng ở trẻ em do thói quen ăn uống không lành mạnh và thiếu hoạt động thể chất, trở thành một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng.

Bệnh đái tháo đường có thể dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng như bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận và cắt cụt chi Tuy nhiên, tin vui là 70% trường hợp đái tháo đường type 2 có thể được dự phòng hoặc làm chậm tiến triển bằng cách duy trì lối sống lành mạnh, chế độ dinh dưỡng hợp lý và tăng cường hoạt động thể chất.

Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường (ĐTĐ) đã tăng đáng kể từ năm 1990, khi tỷ lệ chỉ là 1,1% tại Hà Nội và 2,25% tại Hồ Chí Minh Theo nghiên cứu năm 2012 của Bệnh viện Nội tiết trung ương, tỷ lệ hiện mắc ĐTĐ ở người trưởng thành trên toàn quốc đạt 5,42%, với 63,6% trường hợp chưa được chẩn đoán Ngoài ra, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose toàn quốc là 7,3% và rối loạn glucose máu lúc đói là 1,9% (năm 2003) Kết quả điều tra STEPwise năm 2015 cho thấy tỷ lệ ĐTĐ ở nhóm tuổi từ 18-69 là 4,1%, trong khi tiền đái tháo đường là 3,6%.

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ của bệnh đái tháo đường type 2

Bệnh đái tháo đường type 2, hay còn gọi là đái tháo đường không phụ thuộc insulin, thường gặp ở người trên 40 tuổi và có tình trạng béo phì Đây là một rối loạn mạn tính, nguyên nhân do sự tương tác giữa yếu tố di truyền và môi trường.

1.1.3.1 Thừa cân và béo phì

Tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân (BMI từ 25 – 30 kg/m 2 ) và béo phì (BMI > 30 kg/m 2 ) trên thế giới được dự đoán sẽ tăng lên 57,8% vào năm

Tổng quan về enzym α-glucosidase và PTP1B

1.2.1 Tổng quan về enzym 1.2.1.1 Khái niệm

Enzym là chất xúc tác sinh học được tạo ra từ protein có cấu trúc hóa học đặc trưng trong tế bào Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của sinh vật, giúp thúc đẩy các phản ứng hóa học diễn ra nhanh chóng trong điều kiện bình thường mà không cần các yếu tố như nhiệt độ hay áp suất Enzym có thể được chiết xuất từ nhiều nguồn sống khác nhau, bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật.

Enzym là những chất xúc tác chọn lọc trong cơ thể sinh vật, có vai trò quan trọng trong việc định hướng tất cả các phản ứng xảy ra trong tế bào Ngoài ra, nhiều enzym vẫn có khả năng hoạt động tương tự ngay cả khi ở bên ngoài tế bào.

Chất ức chế enzym là những hợp chất có khả năng làm giảm hoặc ngăn chặn hoàn toàn hoạt động của enzym, với nguồn gốc hóa học đa dạng như ion kim loại, anion, hợp chất hữu cơ nhỏ hoặc protein Các chất ức chế này có thể tương tác với enzym theo hai cách: phản ứng thuận nghịch và không thuận nghịch, trong đó có hai loại chính là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh.

1.2.2 Tổng quan về enzym α-glucosidase 1.2.2.1 Danh pháp và phân loại

Enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) còn có những tên gọi khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase glucoamylase, α- glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucoside hydrolase, α-1,4-glucosidase, α-D-glucoside glucohydrolase [7]

Enzym α-glucosidase là một enzym một thành phần có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside, giải phóng các phân tử α-D-glucose từ đầu tận cùng không khử của carbohydrate Chất nền đặc trưng của enzym này bao gồm các disaccharide, oligosaccharide, cùng với các aryl- và akyl-α-glucopyranoside khác.

Enzym α-glucosidase thuộc lớp glycoside hydrolase, enzym có khả năng tách các liên kết glycoside giữa hai phân tử carbohydrate Đây là một trong những liên kết mạnh nhất trong các polymer tự nhiên Các enzym này có thể bẻ gãy liên kết glycoside nhanh hơn 10^17 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác.

Carbohydrat trong thức ăn là nguồn cung cấp đường cho cơ thể Khi vào cơ thể, carbohydrat được thủy phân thành các phân tử đường đơn nhờ enzym trong ruột non, và các phân tử này cung cấp năng lượng cho tế bào.

Tiến trình phân hóa carbohydrat bắt đầu khi tụy tiết ra α-amylase, enzyme này có nhiệm vụ phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid Tiếp theo, màng tế bào ruột non tiết ra α-glucosidase, enzyme này tiếp tục phân hóa oligosaccharid thành các phân tử đường đơn để thẩm thấu vào máu Chức năng chính của α-glucosidase là xúc tác cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucosid của cơ chất, giải phóng α-D-glucose.

Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy phân của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu [12]

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym α-glucosidase a Các chất tổng hợp Acarbose và miglitol đang được sử dụng rộng rãi như thuốc điều trị đái tháo đường type 2 Cơ chế hoạt động của các thuốc này là ức chế enzym α- glucosidase ở ruột Cụ thể chất ức chế α-glucosidase là các saccharide hoạt động như chất ức chế sự cạnh tranh của các enzym cần thiết để tiêu hóa carbohydrate, đặc biệt là enzym α-glucosidase

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử Acarbose b Các chất tự nhiên

Hiện nay, nhiều hợp chất tự nhiên như flavonoid, anthocyanidin, isoflavone, phenolic, curcuminoids và terpinoid đã được phát hiện là có khả năng ức chế enzym α-glucosidase Việc nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên ngày càng thu hút sự chú ý toàn cầu, đặc biệt là khi các hợp chất hóa học truyền thống thường gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn.

Bảng 1.1 Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase [22]

STT Nhóm hợp chất Tên hoạt chất

Apigennin Hesperetin (+)-catechin Cyanidin-3-galactoside Cyanidin-3- galactoside 2R,3R,4R,5R)2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4- dihydroxypyrrolidine

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l- arabinopyranosyl-(1→3)- β -d- xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester,…

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic axit Axit 28-O-α-larabinopyranosyl-(1→4)-α-l- arabinopyranosyl-(1→3)- β -d- xylopyranosyl-(1→4)-α-lrhamnopyranosyl- (1→2)-β -d-fucopyranosyl ester, …

Chebulanin Chebulagic axit Chebulinic axit (-)-3- O-galloylepicatechin (-)-3-O-galloylcatechin

1.2.3 Tổng quan về enzym PTP1B (protein tyrosine phosphatase 1B) 1.2.3.1 Danh pháp và phân loại

PTP1B (EC 3.1.3.48) là protein tyrosin phosphatase 1B, một enzym thuộc phân họ pTyr PTP cổ điển, nằm trong siêu họ enzym Protein Tyrosin Phosphatase.

PTP1B là một protein bao gồm 435 axit amin, với vùng xúc tác nằm từ axit amin 30 đến 278 Đầu tận C kị nước đóng vai trò quan trọng trong việc enzym gắn vào bề mặt lưới nội chất Cấu trúc đặc trưng của PTP1B bao gồm vòng xúc tác với đơn phân Cys215, vòng WPD (gồm tryptophan, prolin, và axit aspartic), cùng với vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp.

Trung tâm hoạt động của PTP1B có cấu trúc phổ biến giống như các PTP khác, với vị trí xúc tác chính được xác định từ các axit amin 214-221 (His-Cys-Ser-Ala-Gly-Ile-Gly-Arg), tạo thành một vòng 8 axit amin bền vững, giúp tương tác với gốc aryl-phosphat của cơ chất Vòng này chứa vị trí ái nhân Cys215, trong khi bốn vòng khác (Asp181, Phe182, Tyr46, Val49, Lys120, Gln262) tạo thành các cạnh của khe xúc tác, góp phần vào quá trình xúc tác và nhận diện cơ chất Chiều sâu của khe xúc tác là 8-9Å cho cơ chất đặc hiệu.

Vòng WPD, với sự thay đổi hình dạng của PTP1B, có vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác của enzym khi liên kết với cơ chất Sự di chuyển 12Å của vòng WPD (axit amin 79-187) giúp đóng vòng phenyl của cơ chất, từ đó tăng cường tương tác kị nước.

Asp181 di chuyển để hoạt động như một axit, chuyển proton cho nhóm tyrosyl Arg221 cũng thay đổi vị trí để tối ưu hóa tương tác “cầu muối” với phosphat Trong quá trình này, Cys215 liên kết với nguyên tử phospho của cơ chất, cho thấy tác nhân ức chế PTP1B có thể tác động vào cả quá trình chuyển dạng.

“mở” và “đóng” của PTP1B [29]

Vị trí liên kết aryl-phosphat thứ cấp đóng vai trò là vị trí xúc tác không hoạt động, tạo ra liên kết yếu hơn so với vị trí hoạt động cơ bản do tiếp xúc với môi trường nhiều hơn Mặc dù không hoạt động, vị trí này vẫn rất quan trọng trong việc thiết kế các tác nhân ức chế PTP1B.

Vùng xúc tác có chứa 3 tiểu phân (cystein, aspatat và glycin) – là 3 axit amin cần thiết cho quá trình xúc tác

Đặc điểm thực vật, phân bố của cây ổi tại Việt Nam

1.3.1 Vị trí phân loại thực vật

Cây ổi thuộc loài Psidium guajava L., chi Psidium L., họ Sim

(Myrtaceae), bộ Sim (Myrtales), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [42]

Cây ổi, thuộc họ Sim (Myrtaceae), có khoảng 3.000 loài và phân bố trong 130-150 chi, chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm áp trên toàn cầu Chi Ổi (Psidium) có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ với khoảng 100 loài cây bụi Hiện nay, cây ổi được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia thuộc Châu Phi, Nam Á, Đông Nam Á, vùng Caribbean, cận nhiệt đới Bắc Mỹ và Úc.

[2] Ở Việt Nam cây ổi thường (Psidium guajava L.) được phát triển trên khắp cả nước từ đồng bằng ven biển cho đến vùng núi có độ cao khoảng 1500 m trở xuống [2]

1.3.3 Đặc điểm thực vật Ổi hay còn gọi là ủi, phan thạch lựu là cây thân gỗ sống lâu năm, thân phân cành nhiều, cao 4-6 m, cao nhất 10 m, đường kính thân tối đa 30 cm

Thân cây ngắn, chắc khỏe và nhẵn nhụi, với vỏ già có khả năng tróc thành từng mảng Vỏ mới có màu xám hơi xanh và nhẵn Cành non có hình dạng 4 cạnh, sau đó sẽ tròn dần khi trưởng thành.

Rễ ổi là rễ cọc, có khả năng ăn sâu xuống đất từ 3 đến 4 mét hoặc hơn Lá ổi đơn, mọc đối, không có lá kèm, với phiến lá hình bầu dục, gốc thuôn tròn, và đầu lá có lông gai hoặc lõm Kích thước lá dài từ 11 đến 16 cm và rộng từ 5 đến 7 cm, mặt trên lá có màu xanh đậm hơn mặt dưới.

Lá non có đường viền màu hồng tía kéo dài đến cuống, phủ lông trắng nhạt và vị chát Gân lá hình lông chim với gân giữa nổi rõ ở mặt dưới Cuống lá màu xanh, hình trụ dài từ 1-1,3 cm và có rãnh cạn ở mặt trên Hoa trắng to, lưỡng tính, thường mọc thành chùm 2-3 chiếc, chủ yếu ở nách lá thay vì ở đầu cành.

Cây có 4-5 lá đài và 4-5 cánh hoa, với nhiều nhị và bầu dưới 5 ô Quả hình tròn, hình trứng hoặc hình quả lê, dài từ 3-10cm Vỏ quả non có màu xanh, khi chín chuyển sang màu vàng, trong khi thịt vỏ quả có thể màu trắng, vàng hoặc ửng đỏ Ruột quả có màu trắng, vàng hoặc đỏ, với vị chua ngọt hoặc ngọt và mùi thơm đặc trưng Hạt quả nhiều, màu vàng nâu, hình đa giác, có vỏ cứng và nằm trong khối thịt quả màu trắng, hồng hoặc đỏ vàng.

Cây ổi phát triển tốt trong nhiệt độ từ 15,5°C đến 32°C và ưa sáng, thích hợp với khí hậu ẩm Cây có thể trồng trên nhiều loại đất, với pH lý tưởng từ 4,5 đến 8,2.

Theo nghiên cứu của đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh cho biết, trong lá ổi có chứa [5]:

- Tanin (7-10%) gồm gallotanins, axit ellagic

- Tinh dầu (0,31%) trong đó có aromadendrene, beta-bisabolene, caryophyllene, nerolidiol, selinene, dl limonene, các ancol thơm…

- Các axit hữu cơ gồm axit mastinic, axit aleanolic, axit oxalic, axit guaijavolic, axit guajanoic, axit crategolic, axit psidiolic, axit ursolic

- Flavonoid gồm quercetin, leucocyanidin, avicularin, guaijaverin

- Lá non và búp non có khoảng 7-10% tanin loại pyrogallic và 3% nhựa

1.3.5 Tác dụng và công dụng

Theo Y học cổ truyền, lá ổi có vị đắng, tính ấm, giúp tiêu thũng, giải độc và cầm máu, trong khi quả ổi có vị ngọt hơi chua, tính ấm, có tác dụng thu liễm và kiện vị Các bộ phận của cây ổi thường được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý như tiêu chảy, lỵ mạn tính, viêm dạ dày ruột, thấp độc, thấp chẩn, xuất huyết và tiểu đường.

Beta-sitosterol trong lá ổi được biết đến là một phương thuốc hiệu quả cho việc điều trị cholesterol cao và các bệnh tim mạch Theo FDA, thực phẩm chứa các este sterol thực vật như beta-sitosterol có khả năng giảm nguy cơ mắc các bệnh mạch vành.

Quercetin được biết đến như một chất chống oxi hóa mạnh, chống viêm hay giúp làm giảm cholesteron[25] Avicularin, guaijaverin có tác dụng ức chế tụ cầu [44]

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của Beta-sitosterol

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Quercetin [25]

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử của Guaijaverin [45]

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của Avicularin [45]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu và thiết bị

Lá ổi tươi được thu hái vào tháng 10 năm 2018 ở Long Biên, Hà Nội

Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

Lá ổi tươi được rửa sạch, sấy khô ở 75-80°C, nghiền nhỏ Lá khô (1,04kg) chiết với Ethanol 96% (3,24L x 3 lần) bằng phương pháp ngấm kiệt

Dịch chiết được lọc và gộp lại, cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không thu được cao Ethanol toàn phần (350g) Lấy 30g cao toàn phần phân tán trong

350 mL nước cất rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, EtOAc, BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 350mL)

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 2.1.3.1 Hóa chất

The study utilized various reagents and enzymes, including α-glucosidase and p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) from Sigma, Singapore, as well as 4-Nitrophenol and p-Nitrophenyl phosphate (pNPP) sourced from the same supplier Additionally, the enzyme PTP1B was also obtained from Sigma, Singapore The antioxidant activity was assessed using 1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), while ursolic acid was acquired from Himedia, India.

Dung môi: n – Hexan, Ethyl acetat (EtOAc), n – Buthanol (n-BuOH), Ethanol 96% (EtOH) (Shouguang, Trung Quốc) và nước cất

Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản)

Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức)

Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal

Pipet, bình định mức, cối xứ, giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

Dưới tác dụng của enzym α-glucosidase, cơ chất p-nitrophenyl-α-D- glucopyranosid (PNP-G) bị thủy phân tạo ra α-D-glucose và p-nitrophenol

Nồng độ p-nitrophenol tỷ lệ thuận với hoạt động của enzym α-glucosidase, và được xác định qua phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm Để đánh giá hoạt tính của enzym α-glucosidase, ta so sánh độ hấp thụ màu của mẫu thử với mẫu chứng ở 405nm.

Hình 2.1 Phản ứng thủy phân PNP-G dưới tác dụng của enzym α- glucosidase [7]

Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự [21] Cụ thể như sau:

- Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong đệm phosphate

10 mM (pH 6.8) và 50 l được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64 g/ml; 16 g/ml; 4 g/ml

- 20 àl α- glucosidase (0,5U/ml) và 130 àl đệm phosphate 100 mM (pH 6.8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37 o C trong 15 phút p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid

- Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) được đưa tiếp vào từng giếng thí nghiệm rồi ủ tiếp ở 37 o C trong 60 phút

Đĩa thí nghiệm bao gồm mẫu thử, đệm phosphate và pNPG được sử dụng làm đối chứng trắng Trong khi đó, giếng thí nghiệm chứa DMSO 10%, đệm phosphate, enzym và pNPG được dùng làm đối chứng Thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.

- Dừng thớ nghiệm bằng cỏch thờm vào 80 àl Na 2 CO 3 0,2M và đo OD ở bước sóng 405nm bằng máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad)

- Khả năng ức chế enzym α- glucosidase của mẫu thử được xác định theo công thức sau:

% ức chế = 100 - (Amẫu thử/ A đối chứng *100) Trong đó: A đối chứng = OD đối chứng - OD blank

Amẫu thử = ODmẫu thử - OD blank mauthu

2.2.1.2 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

2.2.2 Đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B in vitro

Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym PTP1B được thực hiện ở nhiệt độ 30°C, trong đó cơ chất p-nitrophenyl phosphate (pNPP) bị phosphoryl hóa thành p-nitrophenol (PNP dưới tác dụng của enzym này Nồng độ p-nitrophenol được xác định thông qua đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 405nm Khi có mặt chất ức chế, nồng độ PNP sẽ giảm, cho phép xác định nồng độ enzym PTP1B dựa trên sự chênh lệch giữa mẫu thử và mẫu chứng.

Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym PTP1B được thực hiện dựa trên quy trình đã được Hung và cộng sự mô tả, với những điều chỉnh phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm hiện tại.

Cơ chất là p-nitrophenyl phosphate (pNPP) được sử dụng trong thí nghiệm Dung dịch đệm gồm có 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic axit), và 50 mM citrate (pH 6.0)

Thí nghiệm được thực hiện bằng cách kết hợp 10 L mẫu thử với 20 L enzym PTP1B (1 g/ml) và 40 L pNPP 4 mM trong 130 L dung dịch đệm trong đĩa 96 giếng Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 37 o C trong 30 phút, và phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 10 L NaOH 1M Cuối cùng, lượng p-nitrophenol sinh ra được đo bằng độ hấp thụ quang tại bước sóng 405 nm.

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác Axit ursolic được sử dụng làm chất đối chứng dương Phần trăm ức chế hoạt động của enzym PTP1B (% I) được tính toán theo công thức cụ thể.

Trong đó: I% phần trăm hoạt tính PTP1B bị ức chế

Ac : độ hấp thu của mẫu chứng (khụng chứa 10 àL dung dịch thử)

At : độ hấp thu của mẫu thử

Ao : độ hấp thu của mẫu trắng

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê sử dụng phần mềm SigmaPlot 10 (Systat Software Inc, Mỹ) Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả chiết xuất và phân đoạn dịch chiết lá ổi

Sau khi sấy khô và nghiền nhỏ 1kg lá ổi, chiết xuất bằng Ethanol 96% đã thu được 350g cao toàn phần Từ 30g cao toàn phần, tiến hành chiết phân đoạn với n-Hexan, EtOAc và n-Buthanol, cho ra ba loại cao phân đoạn: 8,31g cao n-Hexan, 2,43g cao EtOAc và 18,12g cao n-Buthanol.

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá ổi

Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro

Cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lỏ ổi đã được thử nghiệm tác dụng ức chế enzym α-glucosidase ở các nồng độ 128, 32, 8, và 2 µg/mL, với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Acarbose được sử dụng làm chất đối chứng dương Kết quả cho thấy khả năng ức chế enzym của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ, như thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi và Acarbose

STT Mẫu ức chế tại các nồng đ

Bảng 3.1 tóm tắt giá trị IC50 của các chiết xuất khác nhau cho thấy tác dụng ức chế α-glucosidase tăng dần theo nồng độ Cao chiết toàn phần EtOH, phân đoạn n-Hexan, EtOAc và BuOH đều có khả năng ức chế cao với giá trị IC50 lần lượt là 2,20; 2,53; 2,24 và 2,16 àg/mL, trong khi Acarbose có IC50 là 139,52 àg/mL Đặc biệt, phân đoạn BuOH cho thấy hiệu quả ức chế tốt tại nồng độ 128 àg/ml (99,86%) và 32 àg/ml (98,05%) Cao chiết toàn phần cũng cho thấy tác dụng ức chế khả quan tại 128 àg/ml (98,73%) Các phân đoạn EtOAc và n-Hexan cũng có tiềm năng đáng chú ý trong việc ức chế α-glucosidase.

The study conducted by the School of Medicine and Pharmacy, VNU, indicates that the inhibitory effect is weaker at a concentration of 128 µg/ml, with results of 96.08% and 90.84% Additionally, the positive control substance, acarbose, demonstrated stable activity throughout the experiment.

Tác dụng ức chế enzym PTP1B in vitro

Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết từ lá ổi được thử nghiệm tại các nồng độ 1000; 500; 250; 125; 62,5;

Nồng độ axit usolic được xác định là 31,25 àg/mL, với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác và lấy kết quả trung bình Axit usolic được sử dụng làm chất đối chứng dương (bảng 3.3) Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế enzym của cao toàn phần và các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ, như thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của cao chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết lá ổi

Bảng 3.3 Tác dụng ức chế enzym PTP1B của axit ursolic

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết lá ổi

EtOH n-Hexane EtOAc BuOH Ức chế

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym PTP1B của axit ursolic

Bảng 3.2 và 3.3 trình bày giá trị IC50 của dịch chiết toàn phần, các phân đoạn dịch chiết và axit ursolic Tác dụng ức chế PTP1B của các phân đoạn dịch chiết gia tăng theo nồng độ, trong đó phân đoạn EtOAc và BuOH cho thấy khả năng ức chế cao nhất với IC50 lần lượt là 120,23 và 97,72 µg/mL, so với chứng dương axit ursolic là 19,7 µg/mL Ngược lại, phân đoạn n-Hexan thể hiện tác dụng ức chế enzym PTP1B thấp nhất với IC50 là 204,17 µg/mL.

BÀN LUẬN

Đái tháo đường type 2 hiện đang trở thành bệnh lý phổ biến nhất toàn cầu, chiếm 90% tổng số ca mắc tiểu đường và có tỷ lệ tử vong cao Đây là một bệnh lý chuyển hóa mạn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm ảnh hưởng đến các cơ quan như tim, thận và mạch máu Các biến chứng có thể dẫn đến di chứng nghiêm trọng như mù mắt hoặc phải cắt cụt chi, gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh Đáng lo ngại hơn, độ tuổi mắc bệnh đang ngày càng trẻ hóa.

Nhiều nghiên cứu toàn cầu đang tìm kiếm các loại thuốc mới để điều trị hiệu quả bệnh đái tháo đường type 2, nhằm giảm thiểu biến chứng và nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân Các nhà khoa học hiện đang chuyển hướng sang nghiên cứu các loại thuốc thảo dược an toàn với ít tác dụng phụ, trong đó có những thuốc ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B Ổi, một loại cây đã tồn tại lâu đời và phổ biến toàn cầu, đang được chú ý trong lĩnh vực này.

Cây ổi có nhiều bộ phận có tác dụng, trong đó lá và quả ổi được sử dụng phổ biến nhất Từ xưa, lá và quả ổi đã được áp dụng cho nhiều mục đích khác nhau trên toàn thế giới Quả ổi không chỉ là thực phẩm mà còn có công dụng chữa bệnh Theo y học cổ truyền, lá ổi có vị đắng, tính ấm, giúp tiêu thũng, giải độc và cầm máu Nghiên cứu cho thấy các hợp chất trong lá ổi có khả năng kháng khuẩn, chống oxi hóa và giảm cholesterol Lá ổi có tiềm năng trở thành nguyên liệu mới trong sản xuất thuốc tự nhiên để điều trị nhiều bệnh, bao gồm đái tháo đường type 2 Nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh tác dụng ức chế enzym α-glucosidase và PTP1B từ các phân đoạn dịch chiết lá ổi, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về loại lá này.

Enzym α-glusidase, nằm trong màng đường ruột, đóng vai trò quan trọng trong bước cuối của quá trình tiêu hóa, giúp phân hủy các disaccaride như sucrose và maltose thành monosaccharide như glucose Do đó, các chất ức chế α-glusidase có ý nghĩa quan trọng trong việc điều chỉnh quá trình tiêu hóa.

Acarbose, voglibose và miglitol là những thuốc điều trị đái tháo đường type 2 nhưng có thể gây ra tác dụng phụ như đau bụng và tiêu chảy Nghiên cứu cho thấy các phân đoạn dịch chiết lá ổi, đặc biệt là phân đoạn BuOH, có khả năng ức chế enzym tốt với IC50 là 2,16 Các phân đoạn khác cũng cho thấy khả năng ức chế đáng kể, mặc dù còn nhiều tạp chất Đái tháo đường type 2 liên quan đến đề kháng insulin, do suy giảm tín hiệu từ thụ thể insulin PTP1B là enzym quan trọng trong việc điều hòa tín hiệu insulin, cần thiết để kết thúc tín hiệu bằng cách khử phospho của phân tử IRβ và các phân tử liên quan.

Enzym PTP1B khi tăng hoạt động sẽ làm tăng quá trình khử phospho hóa IRβ, dẫn đến giảm tín hiệu insulin và kháng insulin Do đó, giảm hoạt động của PTP1B có thể làm tăng độ nhạy insulin, mở ra tiềm năng cho các hợp chất ức chế PTP1B trong điều trị bệnh đái tháo đường type 2 và béo phì Các hợp chất trong lá ổi bao gồm morin flavonoid, morin-3-O-lyxoside, morin-3-O-arabinoside, quercetin, quercetin-3-O-arabinoside, glycosides, alkaloids, saponins và triterpenoid.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng hạ đường huyết của cây ổi, trong đó nghiên cứu của Haseena Banu và cộng sự cho thấy cao chiết lá ổi với liều 300 mg/kg thể trọng có hiệu quả hạ đường huyết ở chuột tiểu đường do streptozotocin Kết quả cho thấy cao chiết lá ổi không chỉ giảm glucose máu và nồng độ HbA1c mà còn làm tăng lượng insulin trong huyết tương, đồng thời cải thiện hoạt tính của các enzym chuyển hóa carbohydrate như hexokinase và pyruvate kinase.

Nghiên cứu cho thấy cao chiết nước từ lá ổi (250 mg/kg) có tác dụng hạ đường huyết đáng kể trên chuột tiểu đường do alloxan Ngoài ra, tiêm dịch chiết lá ổi (10 mg/kg) vào màng bụng có khả năng ức chế protein tyrosine phosphatase 1B ở chuột tiểu đường mang gen Lepr(db)/Lepr(db).

Nghiên cứu dài hạn trên chuột cho thấy việc uống cao chiết nước hoặc ethanol từ lá ổi có tác dụng tăng nồng độ insulin huyết tương và cải thiện vận chuyển glucose vào các cơ quan dự trữ như gan và cơ Đồng thời, lá ổi cũng làm tăng hoạt tính của các enzym hexokinase, phosphofructokinase và glucose-6-phosphate dehydrogenase ở chuột bị tiểu đường Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cơ chế tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường của lá ổi thông qua việc ức chế enzym glucosidase và Protein Tyrosin Phosphatase 1B.

Định dạng
Số trang	49
Dung lượng	1,1 MB