LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng chân thành, xin cảm ơn: Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại Học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh cung cấp cho kiến thức quý báu suốt khóa học Thầy PGS.TS Trần Linh Thước ThS Nguyễn Tiến Dũng tận tâm hướng dẫn tạo điều kiện để hoàn thành tốt luận văn Thầy Long, bạn Huệ, Na, Phượng, Ánh, Thanh, Loan Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học, Phòng Thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh hết lòng giúp đỡ suốt thời gian thực nghiệm Nhân xin chân thành cảm ơn sở Giáo dục Đào tạo Tp Hồ Chí Minh, Ban Giám Hiệu Trường Trung học phổ thông Trần Phú tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành tốt khóa học Thành phố Hồ Chí Minh tháng - 2005 Nguyễn Thị Ngọc Yến BẢNG CHỮ VIẾT TẮT AOAC : Association of Official Analytical Chemist (Hiệp Hội nhà hóa học phân tích nhà nước) Bp : base pair (cặp base) CFU : Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) KDa : Kilo Dalton (1.000 da) DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : 2'- Deoxynucleoside - 5'- triphosphate (nucleotide dùng để tổng hợp DNA) ELISA : Enzyme - linked Immunosorbent Assay (thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzim) ISO : International Standards Organization (Tổ chức Tiêu chuẩn quốc NordVal : Nordic System for Validation of Alternative Biological Method tế) (hệ thống Nordic đánh giá phương pháp sinh học thay thế) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi tổng hợp polymerase) TAE : Tris acetic acid - Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Taq : Thermus aquaticus TE : Tris - EDTA MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN T T BẢNG CHỮ VIẾT TẮT T T MỤC LỤC T T MỞ ĐẦU T T CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11 T T 1.1.NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 11 T T 1.2.KHÁI QUÁT VỀ GIỐNG CLOSTRIDIUM 11 T T 1.2.1.Đặc điểm chung [4], [20] 11 T T 1.2.2.Các tác hại Clostridium [4], [17] 12 T T 1.3.ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 12 T T 1.3.1.Lịch sử phát [2], [10] 12 T T 1.3.2.Đặc điểm sinh học 13 T T 1.3.2.1.Hình thái sinh tí tế bào [l1] [2] 13 T T 1.3.2.2.Đặc điểm nuôi cấy [1] 13 T T 1.3.2.3.Đặc điểm sinh hóa [8], [9] 14 T T 1.3.2.4.Phân loại [10], [16] 14 T T 1.4.NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO C PERERINGENS 15 T T 1.4.1 Nguyên nhân triệu chứng ngộ độc thực phẩm C perfringens [5], T [9] 15 T 1.4.2.Độc tố đường ruột C perfringens [9], [11] 16 T T 1.4.3.Các tiêu c perfringens thực phẩm [4] 17 T T 1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG THỰC T PHẨM 19 T 1.5.1.Phương pháp nuôi cấy [4], [8] 19 T T 1.5.3 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) [6], [7] 20 T T 1.5.4.So sánh ưu nhược điểm phương pháp 20 T T 1.6.KĨ THUÂT PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH T TRONG THỰC PHẨM 21 T 1.6.1.Nguyên tắc kĩ thuật PCR [3], [4] 21 T T 1.6.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR [3], [4] 22 T T 1.6.3.Ưu nhược điểm cua phương pháp PCR phát vi sinh vật gây T bệnh thực phẩm 24 T 1.7.XÁC NHẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP THAY THẾ 25 T T 1.7.1.Các khái niệm [13], [14] 25 T T 1.7.2.Các bước xác nhận hiệu lực [13], [14] 26 T T 1.7.3.Các thông số kĩ thuật qui trình xác nhận hiệu lực phương pháp T định tính vi sinh vật 27 T 1.7.4.Ý nghĩa việc xác nhận hiệu lực 29 T T CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30 T T 2.1.VẬT LIỆU 30 T T 2.1.1.Dụng cụ thiết bị 30 T T 2.2.2.Hóa chất môi trường 30 T T 2.1.2.1.Hoá chất 30 T T 2.1.2.2.Môi trường 32 T T 2.1.3.Nguyên vật liệu 33 T T 2.2.PHƯƠNG PHÁP 34 T T 2.2.1.Phương pháp thu xử lí mẫu 34 T T 2.2.2.Pha loãng mẫu 34 T T 2.2.3.Đồng mẫu 34 T T 2.2.4.Xác định mẫu âm tính 35 T T 2.2.5.Định lượng Clostridium perfringens 35 T T 2.2.6.Phương pháp phân lập khẳng định C perfringens từ mâu thực T phẩm 36 T 2.2.7.Phương pháp loại bỏ ôxi khỏi môi trường nuôi cấy 37 T T 2.2.8.Gây nhiễm C perfringens lên mẫu thực phẩm 38 T T 2.2.9.Thu xử lí khuôn DNA cho phản ứng PCR 39 T T 2.2.10.Điều kiện phản ứng PCR 39 T T 2.2.11.Phân tích sản phẩm PCR điện di gelagarose 39 T T 2.2.12.Khảo sát điều kiện tối ưu phản ứng PCR 39 T T 2.2.13.Khảo sát thời gian tăng sinh tối thiểu phát C perfringens T mẫu thực phẩm 40 T 2.2.14.Xác định tính chuyên biệt cặp mồi PL 40 T T 2.2.15.Khảo sát độ nhạy phát C perfringens PCR 40 T T 2.2.16.Xác định giới hạn phất C perfringens 41 T T 2.2.17.Xác định thông số kĩ thuật tương đổi phương pháp PCR so với T phương pháp nuôi cấy 41 T 2.2.18.Ứng dụng quy trình PCR để phát C perfringens mẫu T thực phẩm 42 T CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 T T 3.1.XÂY T ĐỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 43 T 3.1.1.Tính chuyên biệt cặp mồi phái Clostridium perfringens T phương pháp PCR 43 T 3.1.2.Khảo sát điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR 44 T T 3.1.2.1.Xác định nồng độ Mg2+ tối ưu 44 T P P T 3.1.2.2.Xác định nồng độ mồi tối ưu 45 T T 3.1.2.3.Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 46 T T 3.1.3.Thời gian tăng sinh cần thiết đề phát C perfringens thực T phẩm phản ứng PCR 47 T 3.1.4.Khảo sát độ nhạy phản ứng PCR phát C perfringens 48 T T 3.1.5.Quy trình PCR phát C perfringens mẫu thực phẩm 49 T T 3.2.XÁC NHẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ T PHÂN TÍCH C PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM 52 T 3.2.1.Phân lập định danh chủng C perfringens thực phẩm 52 T T 3.2.2.Giới hạn phát C perfringens mẫu thực phẩm 56 T T 3.2.3.Xác định thông số kĩ thuật tương đối phương pháp PCR so với T phương pháp nuôi cấy 58 T 3.3.ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PGR ĐỂ KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM C T PERFRINGENS TRÊN MẪU THỰC TẾ 61 T KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 T T KẾT LUẬN 63 T T KIẾN NGHỊ 64 T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 T T CÁC TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 65 T T CÁC TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 65 T T MỞ ĐẦU Trong kinh tế xã hội phát triển nay, đời sống vật chất tinh thần người dân nâng cao Điều kéo theo yêu cầu chất lượng vệ sinh thực phẩm khắt khe Người tiêu dùng không đòi hỏi cao chất lượng dinh dưỡng, cảm quan thực phẩm mà mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm Tuy nhiên, thực tế cho thấy tình trạng ngộ độc thực phẩm năm gần lại xảy nhiều, chủ yếu vụ ngộ độc tập thể công ty, xí nghiệp, trường học, khu chế xuất., gây không hoang mang người tiêu dùng Trong số tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, vi sinh vật thường chiếm tỉ lệ gây ngộ độc cao nên việc kiểm nghiệm chúng thực phẩm quan tâm Vì vậy, vấn đề cấp bách cần phải có phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm hữu hiệu nhằm ngăn ngừa tình trạng ngộ độc giảm ca ngộ độc đến mức thấp Ngoài cần có phương pháp xét nghiệm tìm nguyên nhân gây ngộ độc để có biện pháp điều trị kịp thời Để đáp ứng nhu cầu trên, nhiều phương pháp kiểm nghiệm nhanh tự động hóa bước phát triển phổ biến rộng như: phương pháp phân tích miễn dịch (ELISA, IMS ), phương pháp PCR, phương pháp sử dụng mẫu dò, phương pháp phát dựa ữên kĩ thuật phát quang sinh học [4] Góp phần vào việc nghiên cứu trình phát nhanh mầm bệnh vi sinh có thực phẩm, Trung tâm Khoa học Công nghệ với Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh tiến hành quy trình khảo sát phát E coli, Salonella, Vibrio, Staphylococcus aureuSy Shigella thực phẩm Hiện nay, tiếp tục hướng nghiên cứu việc khảo sát quy trình phát Clostridium perfringens gây bệnh thực phẩm phương pháp PCR Ngộ độc thực phẩm C perfringens gây không nguy hiểm ngộ độc thịt lại xảy phổ biến, đặc biệt nước phát triển Mỹ, Phần Lan Tại Mỹ, C perfringens tác nhân thường xuyên gây ngộ độc thực phẩm xếp vào hàng thứ ba sau Salmonella spp Staphylococcus aureus Tại Phần Lan, số vụ ngộ độc C perfringens gây chiếm 20% tổng số ca ngộ độc thống kê từ năm 1975 đến năm 1999 [12] Các trường hợp ngộ độc C perfringens gây phần lớn có liên quan đến loại đồ hộp, sản phẩm tạo điều kiện kị khí môi trường thuận lợi cho vi khuẩn phát triển sinh độc tố Vì vậy, tiêu vi sinh thực phẩm đóng chai, đóng hộp không cho phép diện loại vi khuẩn Từ trước đến nay, nước ta việc phát C perfringens thực phẩm thường dựa phương pháp nuôi cấy vi sinh, sinh hóa truyền thống Các phương pháp có độ ổn định cao hạn chế mặt thời gian, tốn công lao động nên làm tăng chi phí sản xuất, tồn đọng hàng hóa Do hạn chế đó, việc phát nhanh, nhạy xác vi khuẩn thực phẩm cần thiết quan trọng Với phát triển nhanh chóng kĩ thuật sinh học phân tử nhiều phương pháp phát nhanh vi sinh vật thực phẩm thiết lập Các phương pháp phân tích có xu hướng rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, giảm bớt công lao động, thay phương pháp truyền thống việc phát đánh giá mức độ an toàn vi sinh thực phẩm Tuy nhiên, phương pháp số nhược điểiĩí định, chưa đạt tất yêu cầu trên, chúng chưa đưf c phổ biến rộng rãi Trong đó, phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) xem phương pháp có nhiều ưu điểm Có nhiều nghiên cứu nước cố gắng thiết lập hoàn thiệa qui trình phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm kĩ thuật PGR, nhưtig phương pháp chưa ứng dụng lịộng rãi chưa xem phương pháp thức sử dụng để xét Nghiệm C perfringens hệ thống phân tích đo lường Để phương pháp trở thành có giá trị sử dụng rộng rãi phương pháp nậy cần xác nhận hiệu lực Do đó, mục tiêu đề tài luận văn thiết lập qui trình phát C perfringens thực phẩm kĩ thuật PCR nhằm khắc phục hạn chế phương pháp tỊruyền thống đồng thời xác nhận hiệu lực sơ phương pháp tạo sộ cho bước xác nhận hiệu lực thứ cấp để đưa phương pháp trở thành phương pháp thức cho việc xét nghiệm C perfringens thực phẩm 10 3.2.XÁC NHẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ PHÂN TÍCH C PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM 3.2.1.Phân lập định danh chủng C perfringens thực phẩm Để có chủng C perfringens dùng cho việc xác nhận hiệu lực phương pháp PCR để xét nghiệm c perfringens, chứng tiến hành phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu thực phẩm nguồn nước sông Sài Gòn Mẫu thực phẩm khô mực, cá lưỡi trâu, cá cơm, cá vàng , mắm (mắm nêm, mắm cá sặc, mắm tôm, nước mắm ), thu từ chợ Tân Phú (Thủ Đức), chợ Bình Hưng Hòa (Bình Chánh), chợ Tam Bình (Thủ Đức) nước thu từ nguồn nước sông Sài Gòn Từ 40 mẫu thực phẩm, nước sông Sài Gòn phân lập 20 chủng (Bảng 9) có đặc trưng hình thái khuẩn lạc c perýringens môi trường ISA (Hình 15A) Các chủng khẳng định thử nghiệm khả lên men lactose sinh axit, tính di động, thử nghiệm nitratase, gelatine Kết thử nghiệm cho phép khẳng định 20 chủng phân lập C perfringens - Thử nghiệm khả lên men sữa: sau lên men ương môi trường ironmilk, sữa bị đông tụ axit sinh lên men lactose C perfringens (Hình 15B) - Khả di động: môi trường thạch mềm, C perfringens mọc theo đường cấy mà không mọc lan môi trường xung quanh Như vậy, C perfringens khả hăng di động (Hình 15C) 52 A Khuẩn lạc C perfringens môi trường ISA; B Khả lên men lactose đông tụ sữa; C Tính không di động; D Khả khử nitrate; E Khả làm tan gelatin 1, Không có C perfringens; Chửng C perfringens phân lập - Khả khử nitrate: thêm sulphanilamide N-napthylenediamine vào môi trường nitrate broth có vi khuẩn mọc, môi trường chuyển sang màu đỏ hồng Như vậy, C perfringens có khả khử nitrate thành nitrite (Hình 15D) - Khả thủy giải gelatine: sau 1-3 ngày nuôi môi trường gelatin, vi khuẩn làm tan chảy môi trường Vậy C perfringens có khả thủy giải gelatin (Hình 15E) 53 54 This image cannot currently be displayed Bảng Kết phân lập chủng c perýrỉngens loại thực phẩm 55 3.2.2.Giới hạn phát C perfringens mẫu thực phẩm Gây nhiễm mẫu thực phẩm xác định âm tính với c perỷrỉngens cách huyền phù tế bào C perfringens cho mật độ vi khuẩn đạt 0,1 - 5, – l0, l1 -20, 21 - 50 GFU/g mẫu ủ 37°C điều kiện kị khí Sau 24 nuôi cấy, lấy lml canh khuẩn để xử lí phân tích để xác định giới hạn phát mẫu thực phẩm phương pháp PCR Kết trình bày Bảng l0 Hình 16 Bảng 10 Giới hạn phát C perfringens loại mẫu thực phẩm 56 - 6: Gia vị gây nhiễm; 7-11: Đồ hộp gây nhiễm 1: Thang DNA l00bp; 2,7: 0CFU/g; 3, 8: 1- 5CFU/g; 4, 9: - 10CFU/g; 5, l0: 11 - 20CFU/g; 6, 11: 21 - 50CFU/g Kết Bảng l0 Hình 16 cho thấy sau 24 tăng sinh, phương pháp PCR cho kết dương tính tất mẫu thực phẩm gây nhiễm với mật độ - 5CFU/g Kết phù hợp với kết phân tích phương pháp nuôi cấy Các mật độ gây nhiễm từ -10CFU/g hay cao hơn, phương pháp nuôi cấy phương pháp PCR cho cho kết dương tính loại mẫu thực phẩm gây nhiễm Kết khảo sát cho thấy phương pháp PCR có nhiều ưu điểm phương pháp nuôi cấy như: giới hạn phát tương đương phương pháp nuôi c, thời gian cho kết lại ngắn 57 3.2.3.Xác định thông số kĩ thuật tương đối phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy Các thông số kĩ thuật phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đánh giá dựa 20 mẫu thực phẩm thuộc nhóm: sữa, thịt, rau quả, gia vị âm tính với C perdfringens gây nhiễm với mật độ - 10CFU/g Mẫu gây nhiễm 58 phân tích đồng thời phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy Kết phân tích trình bày Bảng 11 Từ kết Bảng 11 tóm tắt mối tương quan kết phân tích phương pháp PCR nuôi cấy Bảng 12 Bảng 12 Mối tương quan kết phân tích phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy truyền thống PA (positive agreement): kết đồng dương tính (phương pháp PCR +; phương pháp nuôi cấy +) NA (negative agreement): kết đồng âm tính (phương pháp PCR -; phương pháp nuôi cấy -) NU (negative deviation): độ lệch âm (phương pháp PCR -; phương pháp nuôi cấy+) PD (positive deviation): độ lệch dương (phương pháp PCR +; phương pháp nuôi cấy -) Từ liệu Bảng 12, thông số kĩ thuật tương đối phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy đước tính toán sau: 59 Các thông số kĩ thuật cho thấy phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy cho kết tương đồng chấp nhận Với 20 mẫu âm tính 20 mẫu gây nhiễm khảo sát, độ xác tương đối 97,5%, độ đặc hiệu tương đối 100%, độ nhạy tương đối 94,1% Hai phương pháp có độ lệch âm 0%, độ lệch dương 5,8% Giá tri x2< 3,84 cho thấy khác biệt phân tích C P P perfringens thực phẩm phương pháp PCR hay phương pháp nuôi cấy Trường hợp có kết không tương đồng phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy (đối với mẫu sữa chua Vinamilk) hay cho độ lệch âm (đối với mẫu sữa đặc có đường, sữa tươi, bột canh) độ pH thành phần sữa thấp, số chất ức chế ương bột canh làm ức chế phản ứng PCR hay ảnh hưởng đến tăng sinh vi sinh vật nên hàm lượng DNA chưa đủ để phát phương pháp PCR Như kết luận phương pháp PCR để phát C perfringens thực phẩm hoàn toàn thay phương pháp nuôi cấy truyền thống Tuy nhiên, phương pháp PCR có ưu điểm phương pháp nuôi cấy truyền thống có thời gian phân tích ngắn 60 3.3.ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PGR ĐỂ KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM C PERFRINGENS TRÊN MẪU THỰC TẾ Khảo sát nhằm mục đích áp dụng phương pháp PCR vào việc phân tích C perfringens thực phẩm, đối chiếu lại kết phương pháp PCR phường pháp truyền thống số lượng mẫu phân tích nhiều Đồng thời, qua đánh giá tình hình nhiễm C perfringens loại thực phẩm lưu hành địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh Khảo sát thực 52 mẫu thực phẩm thu từ chợ, siêu thị sở sản xuất địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh, tập trang vào loại thực phẩm đóng hộp chế biến sẵn từ thịt, hải sản Mỗi mẫu tiến hành phân tích phượng pháp PCR phương pháp nuôi cấy Kết thể Bảng 13 Kết Bảng 13 cho thấy diện C perfringens mẫu thực phẩm lưu hành Tp Hồ Chí Minh thíp Trong tổng số 52 mẫu khảo sát, phát hiên mẫu nhiễm C perfringens, chủ yếu mắm khô Mặt khác, kết cho thấy khả phát C perfringens thực phẩm phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy khảo sát tương đương Tuy nhiên, kết sơ bộ, để có kết luận xác đầy đủ tần suất xuất C perfringens thực phẩm cần có khảo sát diện rộng với kế hoạch lấy mẫu qui mô lớn 61 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN C perfringens vi sinh vật kị khí thường gây vụ ngộ độc có liên quan đến loại đồ hộp thực phẩm chế biến sẩn Với mục đích thiết lập qui trình phát C perfringens thực phẩm kĩ thuật PCR ứng dụng mẫu thực tế, khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên phản ứng PCR sử dụng cặp mồi PL để phát C perfringens thực phẩm Kết thu từ việc khảo sát qui trinh phát C perfringens kĩ thuật PCR sau: - Gặp mồi PL có tính chuyên biệt cao chủng C perfringens - Các điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR để phát C perfringens 6pml mồi/phản ứng, l,5mMMg2+/phản ứng nhiệt độ bắt cặp 55°C P P - Việc phát C perfringens mẫu gây nhiễm (patê gan, gia vị) thành công với thời gian tăng sinh cần thiết 18 - Độ nhạy phản ứng PCR tế bào/phản ứng - Giới hạn phát phương pháp PCR - 5CFU/g mẫu Giới hạn tương đương với phương pháp nuôi cấy - Các thông số kĩ thuật so với phương pháp nuôi cấy sau: độ xác tương đối 97,5%, độ đặc hiệu tương đối 100%, độ nhạy tương đối 94,1%, độ lệch dưdng 5,8%, độ lệch âm 0% - Thời gian cho kết phân tích phương pháp PCR nhanh, sau ngày Trong đó, phương pháp nuôi cấy cho kết sau 3-5 ngày Đây ưu điểm phương pháp PCR - Kết khảo sát diện C perfringens mẫu thực phẩm lưu hành địa bàn TP Hồ Chí Minh phương pháp PGR phượng pháp nuôi cấy cho thấy có 8/52 mẫu phát nhiễm C perfringens Hai phương pháp cho kết 63 thống với KIẾN NGHỊ Để qui trình ứng dụng vào thực tiễn, đưa số kiến nghị sau: - Thực việc xác nhận hiệu lực thứ cấp để phương pháp PCR phát C perfringens thực phẩm có đủ sở khoa học để áp dụng vào đời sống - Khảo sát diện C perfringens thực phẩm diện rộng với số lượng mẫu phân tích lớn để có kết luận xác tỉ lệ nhiễm C perfringens loại thực phẩm lựu hành thị trường 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO CÁC TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 1.Trần Bình (chủ biên) 1999 Bài giảng Vi sinh Y học Bộ môn Vi sinh Y học Trung tâm đào tạo bồi dưỡng cán y tế Thành phố Hồ Chí Minh 2.Lê Huy Chính (Chủ biên) Vi sinh Y học Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà Nội Nhà xuất Y học 3.Hồ Huỳnh Thùy Dương 1997 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục 4.Trần Linh Thước 2002 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm Nhà xuất Giáo dục CÁC TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 5.Collins, Lyne 1995 Microbiological Methods 7th ed Buttenvorth P P 6.E Augustynowicz, A Gzyl and J Slusarczyk Detection of enterotoxigenic Clostriđium perfringens with a duplex PCR J Med Microbiol Patrick Voi 54 7.Patrick Fach and Michel R Popoff 1997 Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in food and fecal samples with a duplex PCR and the slide latex agglutination test Applied and Enviromental Microbiology lournal Vol 63 No 11 8.W Andrews 1992 Manual of food quality control Rev L Microbiological analysis FAO foođ and nutrient paper Rome 9.Clostridium perfringens http ://www edu/course/fsc/84Q/lect-18 pdf 10.Clostridium perfringens http://www.vetmet.ucdavis.edu/PHR/PHR150/15003c7.pdf 11.Clostridium perfringens EnteTotoxin Http://wwwl.umn.edu/eoh/hazardssite/perfringens/perfmetabolic html 12.Clostridium 65 Http://www.hsc.wvu,edu/micro/đental2001/chavon/toxtext.pdf 13.Nordval validation (2004) Http://www.nmkl.org/NordVaỵValidationprotocol20Q4-01-01 doc 14.AOAC International Methods Committee Guidelines for Qualitative and Quantitative Microbiological Methods of Analysis (2001) http://aoac.org/vmeth/MicrobiolọgyGuidelines112700.html 15.Food poisoning htpp://www.chclibrary.org/micromed/00048630.html L6 Ciostridium perfringens Genotyping htpp://microvet arizona.edu/research/ClostridiumWeb/genotyping htm 17.Ciostridia: Sporeforming Anaerobic bacilli htpp://www.md.huji.ac.il/microbiology/book/chl8.html 18.Clostridium perfringens ELISA kít Kít for the detection of Clostridium perfringens in culture supernatants http://www.bioxxom/Perfringens.htm 19.C perfringens enterotoxin test http://www.techlabine.com/pdfs/CPINS_l pdf 20.Clostridium botulinum http://www.sciencenet.com.au/frames/profiles/possitive/families/bacillac/profile html 66 [...]... thời gian thực hiện của phương pháp này ngắn hơn các phương pháp khác Ngoài ra, phương pháp này không đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu cao Vì thế, hiện nay các kĩ thuật sinh học phân tử đặc biệt là kĩ thuật PCR đang được khuyến khích sử đụng rộng rãi trong việc phát hiện C perfringens trong thực phẩm 1.6.KĨ THUÂT PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM 1.6.1.Nguyên tắc của kĩ thuật PCR [3],... nhiễm, cần sử dụng tất cả các dụng cụ mới cho phản ứng PCR 1.6.3.Ưu và nhược điểm cua phương pháp PCR trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm So với các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm khác, phương pháp PCR có một số ưu điểm như: - Thời gian cho kết quả nhanh - Có thể phát hiện được các vi sinh vật khó nuôi cấy - Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn trường... phép sự hiện diện của vi khuẩn C 17 perfringens trong một số mặt hàng thực phẩm là rất thấp và thậm chí không cho phép sự hiện diện của vi khuẩn này Bảng 2 Tiêu chuẩn C perfringens cho phép trong thực phẩm, Bộ Y tế 4/1998 18 1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN C .PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM 1.5.1.Phương pháp nuôi cấy [4], [8] Các phương pháp nuôi cấy truyền thống để xét nghiệm C perfringens được xây dựng dựa... đã thành công trong việc phát hiện vi khuẩn C perfringens tạo độc tố đường ruột trong thực phẩm bằng kĩ thuật PCR 'Trong phần nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng đồng thời hai cặp mồi (PL3, PL7) và (P145, P146) để phát hiện sự hiện diện của hai gen pỉc mã hóa cho độc tố alpha phospholipase C và gen cpe mã hóa cho độc tố đường ruột Cả hai gen này đều nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn C Perfringens 1.5.4.So... chủ yếu gây ra ngộ độc thực phẩm do Clostridium Clostridium thường nhiễm vào các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng như thịt, sữa, cá làm cho thực phẩm có màu đen và gây ra mùi khó chịu Ngoài ra, trong quá trình tăng trưởng, vi khuẩn tạo và tiết ra độc tố gây độc cho người Ví dụ, C botulinum gây ngộ độc thịt, C perfringens gây hoại thư sinh hơi và nhiễm độc thực phẩm Hiện nay, Clostridium là nhóm vi khuẩn... ĐỘC THỰC PHẨM Ngộ độc thực phẩm là khái niệm chung để chỉ các triệu chứng gây ra do sử dụng thực phẩm bị nhiễm khuẩn, virut, chất độc từ môi trường hoặc chất độc tự nhiên có trong bản thân thực phẩm [15] Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra ở nhiều người, gây ra những triệu chứng giống nhau sau khi tiêu thụ thực phẩm Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhau tùy thuộc vào khả năng đáp ứng với độc tố và thể... beta, epsilon, iota và độc tố đường ruột Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng một kháng thể đơn dòng liên kết đặc trưng Với độc tố của tế bào vi khuẩn 1.5.3 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) [6], [7] Việc phát hiện C perfringens trong thực phẩm thường tập trung vào phát hiện gen tạo độc tố đường ruột vì đây là tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm Năm 1997, Patrick Fach và Michel R Popoff... dẫn đến hậu quả là các phân tử nhỏ trong tế bào chất bị thoát ra ngoài gây gián đoạn nhanh chóng quá trình trao đổi chất bên trong tế bào Mặt khác, do sự mất cân bằng trong tính thấm của tế bào, nước vào trong tế bào nhiều hơn gây ra hiện tượng vỡ tế bào (Hình 3) 1.4.3.Các chỉ tiêu về c perfringens trong thực phẩm [4] Giới hạn cho phép của C perfringens trong thực phẩm được qui định bởi Bộ Y tế (Bảng... nhiều nhất Trong hầu hết các trường hợp, Clostridium đều là tác nhân gây bệnh cơ hội, chúng thường gây bệnh khi đã có các vi khuẩn khác xâm nhiễm mở đường 1.3.ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 1.3.1.Lịch sử phát hiện [2], [10] Vào cuối những năm 1890, hai nhà khoa học F.w Andrewes và E Klein đã phát hiện ra vi khuẩn Clostridium welchii (hiện nay được gọi là Clostridium perfringens) trong thức... kĩ thuật PCR [3], [4] PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích ĐNA ban đầu Phương pháp này cho phép nhân số lượng bản sao của khuôn thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu Hiện nay, kĩ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm Tất cả các DNA polymerase ... 41 T 2.2.18 .Ứng dụng quy trình PCR để phát C perfringens mẫu T thực phẩm 42 T CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 T T 3.1.XÂY T ĐỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS. .. thiết đề phát C perfringens thực T phẩm phản ứng PCR 47 T 3.1.4.Khảo sát độ nhạy phản ứng PCR phát C perfringens 48 T T 3.1.5 .Quy trình PCR phát C perfringens mẫu thực phẩm 49... rãi việc phát C perfringens thực phẩm 1.6.KĨ THUÂT PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM 1.6.1.Nguyên tắc kĩ thuật PCR [3], [4] PCR (Polymerase Chain Reaction) phương pháp in