MỤC LỤC CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở người 3 1.1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới 3 1.1.2. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt Nam 7 1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người. 8 1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli 8 1.2.2. Klebsiella pneumoniae 9 1.2.3. Salmonella sp 10 1.2.4. Proteus mirabilis 12 1.2.5. Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaece 12 1.3.Phương pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh 13 1.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát hiện vi khuẩn 13 1.3.2. Phương pháp sử dụng sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn 14 1.3.2.1.Kỹ thuật PCR 14 1.3.2.2. Kỹ thuật PCR đa mồi (PCR đa mồi) 16 1.3.3. Tách chiết ADN sử dụng công nghệ loại bỏ ADN người 17 1.3.3.1. Sự cần thiết của công nghệ loại bỏ ADN người trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn huyết 17 1.3.3.2. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người ”làm giàu” ADN vi khuẩn …………………………………………………………………………….18 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20 2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 21 2.3.1. Các hoá chất, sinh phẩm 21 2.3.2. Các máy và thiết bị chính 21 2.4.1.Sơ đồ nghiên cứu 22 2.4.2. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồi 23 2.4.3. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu 26 2.4.4. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm 27 2.4.5. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ 28 2.4.6. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi 28 2.4.8. Giải trình tự gen 30 2.4.9. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi 31 2.4.10. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN 34 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh 34 3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻ 34 3.1.3.Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh 35 3.1.3.1. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ Enterobacteriaceae 36 3.1.3.2. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella 37 3.1.3.3. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K. pneumoniae 38 3.1.3.4. Kết quả xác định trình tự gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilis 39 3.1.3.5. Kết quả xác định trình tự gen S-uidA của vi khuẩn E. coli 40 3.1.4. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae 42 3.1.5.Kết quả PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân gây bệnh 43 3.1.6. Đánh giá hiệu quả và tính ứng dụng của phương pháp trên panel chuẩn dương ……………………………………………………………………………….44 3.1.6.1. Độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu chứng âm và chuẩn dương 44 3.2. THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ LOẠI BỎ ADN NGƯỜI KẾT HỢP ‘’LÀM GIÀU’’ ADN VI KHUẨN 47 3.2.1. So sánh hiệu suất tách và chất lượng ADN cũng như khả năng loại bỏ ADN người bằng các dung môi khác nhau 47 3.2.2. Kết quả so sánh nồng độ ADN tách chiết bằng phương pháp thông thường so với phương pháp phá bạch cầu làm giàu ADN vi khuẩn 48 3.2.3. Kết quả realtime PCR định lượng nồng độ ADN so sánh các phương pháp tách chiết.……………………………………………………………………………… 50 3.2.3.1. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp tách ADN không qua xử lý. 50 3.2.3.2. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp sử dụng kit thương mại MolYsis 50 3.2.3.3.Kiểm chứng hàm lượng ADN vi khuẩn thu nhận sau khi xử lý bằng dung môi phá bạch cầu 52 3.3. KẾT QUẢ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình.1 Các giai đoạn tổng hợp của phản ứng PCR 15 Hình 2. Mô hình thí nghiệm thực hiện quá trình tối ưu hóa PCR đa mồi 22 Hình 3. Mô hình nghiên cứu thiết lập phương pháp loại bỏ ADN người 23 Hình.4. Hình ảnh mô phỏng cho quá trình thiết kế mồi phát hiện vi khuẩn gây bệnh24 Hình 5. Hình ảnh mô phỏng kết quả điện di các sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh 26 Hình.6.Kết quả PCR các mồi đơn trên ADN mẫu được tách chiết từ mẫu chuẩn dương trong điều kiện PCR chuẩn 35 Hình.7. Hình ảnh phổ sắc ký đọc theo trình tự đoạn gen đặc trưng cho họ Enterobacteriaceae 36 Hình 8. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn Salmonella sp 37 Hình 9. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn K. pneumoniae 38 Hình 10. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn Proteus mirabilis 39 Hình 11. Kết quả giải trình tự đoạn gen S-uidA đặc trưng cho vi khuẩn E. coli 41 Hình 12. Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội chuẩn 42 Hình 13. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae 43 Hình 14. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi trên ADN tác nhân gây bệnh khác 45 Hình 15. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của PCR đa mồi trên các mẫu chuẩn dương…………………………………………………………………………….46 Hình16. Kết quả realtime PCR mồi betaglobin định lượng nồng độ ADN 50 Hình 17: Hiệu quả loại ADN người (thông qua tồn dư beta globin) giữa các Kit (SHPT108@dehuman ADN), Kit MolYsis 51 Hình.18. Kết quả PCR mồi đơn E. coli-SuidA trên ADN được xử lý bằng dung môi SHPT108@dehumanDNA 52 Hình. 19. Sơ đồ so sánh kết quả PCR đa mồi và cấy máu 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 1 . Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17 nghiên cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu Á) 4 Bảng 2. Danh mục các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng 3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng.4. Trình tự mồi trong phản ứng PCR đa mồi phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh 25 Bảng 5. Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp 32 Bảng 6. Kết quả đo OD các mẫu ADN sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 7. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu bộ mồi Ent/beta và EPKS thiết kế trên các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae và ADN khác 44 Bảng8: Hàm lượng và chất lượng ADN thu nhận từ 1ml máu ngoại vi chứa vi khuẩn E.coli 48 Bảng 9. Kết quả đo OD các ADN tách chiết từ mẫu máu có vi khuẩn sử dụng các phương pháp tách chiết 49 Bảng 10. So sánh kết quả nuôi cấy và PCR đa mồi trên mẫu nhiễm khuẩn huyết………………………………………………………………………………… 53 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic aldA Aldehyde dehydrogenase A Bộ mồi EPKS Gồm các gen đích phát hiện vi khuẩn E. coli, Proteus mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella. sp bp base pair dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DTCS Dye Terminator Cycle Sequencing EBV Epstain BarrEpptabar virus HBV Hepatis B virus HSV Herpes simplex Virus kDa Kilodalton M100 Ladder marker 100 M50 Ladder Marker 50 bp MCLB1 Manmanlian cellular lysis Buffer 1 NKH Nhiễm khuẩn huyết OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Pol polymerase SD Standard Deviation Se Độ nhạy Sp Độ đặc hiệu X Giá trị trung bình 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm trùng là một bệnh lý thường gặp, trong đó nhiễm trùng đường máu (nhiễm khuẩn huyết) gây biến chứng và nguy cơ tử vong cao nhất. Có nhiều căn nguyên khác nhau gây ra bệnh lý nhiễm trùng như vi khuẩn, kí sinh trùng và nấm. Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Việt Nam cũng như trên thế giới chỉ ra rằng tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn trong đó nhiều nhất là các loài thuộc họ Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella. sp và Staphylococcus aureus. Việc xác định căn nguyên gây nhiễm khuẩn là cần thiết cho việc chỉ định đúng kháng sinh trong điều trị. Cho đến nay cấy khuẩn vẫn là phương pháp được áp dụng thường quy trong chẩn đoán các mầm bệnh gây nhiễm trùng. Tuy nhiên phương pháp kinh điển này đang thể hiện một số điểm yếu trong chẩn đoán, đó là i) thời gian cấy khuẩn dài (từ 18-72h). Trong khoảng thời gian này tình trạng của bệnh nhân có thể chuyển sang một pha mới nguy hiểm hơn, ii) các quy trình cấy khuẩn không được tối ưu cho nuôi cấy mọi vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn yếm khí cộng thêm việc xử lý kháng sinh phổ rộng trước đó cũng gây áp lực áp chế sự hình thành khuẩn lạc sau nuôi cấy, iii) Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết đòi hỏi một lượng máu lớn sẽ là thách thức đối với bệnh nhân nhi sơ sinh hoặc người cao tuổi. Do đó, việc triển khai những kỹ thuật chẩn đoán mới bổ trợ cho phương pháp cấy khuẩn kinh điển là điều cần làm. Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) không còn là điều mới mẻ trong sinh học phân tử, tuy nhiên ứng dụng của nó trong chẩn đoán, đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh gây nhiễm trùng vẫn dừng ở mức tiềm năng là vì: i)Mỗi một phản ứng PCR chỉ xác định được 01 loài vi sinh vật, trong khi đó nếu số cặp mồi quá nhiều trong một phản ứng (PCR đa mồi) chúng có thể triệt tiêu lẫn nhau làm giảm độ nhạy kỹ thuật của phản ứng. ii) Các chất ức chế vốn có trong bệnh phẩm hoặc bản thân lượng dư thừa ADN người trong bệnh phẩm cũng là những tác nhân kìm hãm phản ứng PCR; iii) Ngoài ra, do tính chất bảo tồn tiến hóa giữa các loài, một tỷ lệ nhất định các vật chất di truyền của vi khuẩn sẽ được bảo tồn và có trình tự gần giống một phần bộ gen của sinh vật bậc cao (trong đó có con 2 người) vì thế nếu đoạn mồi được thiết kế hướng vào các khu vực bảo tồn này, hiện tượng bắt chéo của mồi vào ADN gen người sẽ diễn ra gây nên dương tính giả. Để giảm thiểu các nguy cơ nói trên, trong nhiều trường hợp việc tách và loại bỏ ADN người trước khi thực hiện phản ứng PCR là cần thiết. Vì vậy trong khuôn khổ luận văn này tôi tiến hành tối ưu hóa các tham số nhằm xây dựng một quy trình PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae. Quy trình không chỉ hướng tới thiết lập phản ứng PCR đa mồi phát hiện đặc hiệu cho các vi sinh vật thuộc họ này mà còn cần thiết lập một phương pháp loại bỏ ADN người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn ở mức độ chấp nhận được. Do vậy để nâng cao chất lượng chẩn đoán các mầm bệnh vi sinh gây bệnh, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi” với các mục tiêu như sau: a) Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp, Proteus mirabilis) gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi và thiết lập công nghệ loại bỏ ADN người. b) Bước đầu đánh giá giá trị của PCR đa mồi trong phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây nhiễm khuẩn huyết trong thực hành tại Bệnh viện 108. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở người 1.1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một trong những bệnh lý được quan tâm bởi tỷ lệ mắc bệnh, tử vong cao. Một trong những nguyên nhân gây tử vong cao đó là do các vi khuẩn đa kháng kháng sinh. Triệu chứng lâm sàng của NKH không đặc hiệu và không khẳng định, thường chỉ biểu hiện rõ trong giai đoạn trễ. Các marker sinh học - đặc biệt là các cytokin có vai trò quan trọng, giúp phát hiện và đánh giá mức độ nặng của tình trạng viêm, phân biệt tác nhân là vi khuẩn, góp phần giúp thầy thuốc chẩn đoán và điều trị kịp thời NKH trong giai đoạn “giờ vàng”, rút ngắn thời gian nằm viện và giảm tỉ lệ tử vong của bệnh nhân. NKH có xu hướng gia tăng và do các nguyên nhân xác định. Trong đó, bệnh lý nhiễm trùng đường hô hấp luôn là nguyên nhân phổ biến dẫn tới NKH hay sôc nhiễm khuẩn [30]. Nhìn chung, nhiễm trùng đường hô hấp chiếm khoảng một nửa số ca NKH. Ngoài ra, còn có các nguyên nhân khác như nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn ổ bụng. Với các nguyên nhân gây bệnh khác nhau nhưng việc sử dụng kháng sinh sớm là điều tiên quyết trong điều trị khỏi bệnh cho bệnh nhân. Nghiên cứu của Houck PM ở những bệnh nhân viêm phổi và bệnh nhân NKH chỉ ra rằng việc sử dụng kháng sinh chậm trễ trong điều trị kháng sinh nguy cơ dẫn tới tử vong tăng lên đáng kể. Đặc biệt với nhiễm khuẩn, nguy cơ tử vong tăng lên khoảng 10% trong mỗi giờ chậm trễ [21]. Song song với việc sử dụng kháng sinh sớm thì việc lựa chọn kháng sinh thích hợp cũng rất quan trọng. Cùng với đó, việc điều trị kháng sinh hiện nay nếu chờ đợi dựa vào kết quả cấy máu thì quá lâu nên nhiều khi các bác sỹ lâm sàng buộc phải điều trị bệnh nhân theo kinh nghiệm tích lũy. Như vậy mặt tích cực là sử dụng kháng sinh sớm nhưng lại trở nên gặp khó khăn trong việc lựa chọn sử dụng kháng sinh thích hợp để điều trị. Do vậy, nhờ sự phát triển của nền sinh học phân tử hiện đại, [...]... sp và Enterobacteriaceae khác là những tác nhân hàng đầu gây bệnh lý NKH 1.1.2 Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Vi t Nam Tại Vi t Nam, đã có nhiều nghiên cứu về các căn nguyên vi sinh vật gây bệnh ở người trên các thể bệnh khác nhau như vi m tiết niệu, nhiễm trùng vết mổ, NKH Nhìn chung các vi khuẩn gây bệnh rất đa dạng, tuy nhiên các loài vi khuẩn thường gặp gây bệnh. .. các sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh Hình a: là bộ mồi nội chuẩn Ent xác định họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội chuẩn betaglobin; Hình b là bộ mồi phát hiện một số tác nhân vi khuẩn cụ thể thuộc họ Enterobacteriaceae 2.4.3 Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu Chúng tôi tham khảo tài liệu của Sambrook J và cs năm 1989 [36], quy trình tách như sau: - Chủng vi sinh -... sp…Những vi khuẩn này thường gây bệnh đường ruột mà ít khi là tác nhân gây NKH [20] 12 1.3 .Phương pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh 1.3.1 Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát hiện vi khuẩn a Xét nghiệm trực tiếp - Nhuộm Gram: nói chung, theo phương pháp thông thường, xét nghiệm trực tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thường ít giá trị trong vi c xác định căn nguyên gây bệnh vì lẫn nhiều loại vi khuẩn. .. khoảng 1500 nucleotid, ít thay đổi và phổ biến trong các loài vi khuẩn cho phép xác định có họ vi khuẩn này hay không trong một mẫu bệnh phẩm Do vậy, trong đề tài này chúng tôi thiết kế một cặp mồi bắt trình tự bảo tồn của khu vực 16S rRNA phát hiện các tác nhân vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae Tương tự với các loài vi khuẩn khác thuộc họ này qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi sử dụng gen... aeruginosa (9,87%) và hầu hết các vi khuẩn này là vi khuẩn đa kháng thuốc, chúng kháng lại với đa số các kháng sinh thường dùng trong bệnh vi n [6] Như vậy, không chỉ ở trên thế giới mà cả ở Vi t Nam, dịch tễ học các căn nguyên chính gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất, mức độ gây hại lớn vẫn tập trung vào nhóm vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae Điều này cho... vi khuẩn trong máu ở mức 100-1000CFU/ml [2], [25] Trong khi đó một phản ứng PCR sử dụng ADN thu nhận từ Kit tách Qiagen, chỉ có thể phát hiện được ribosomal 16S DNA vi khuẩn nếu mật độ của chúng vượt quá ngưỡng 500 CFU/ml Vì thế với 17 trường hợp bệnh nhân nhiễm khuẩn nhập vi n có mật độ vi khuẩn trong máu quá thấp dưới ngưỡng phát hiện, khi đó phương pháp này sẽ không thể phát hiện được, gây nên hiện. .. có trình tự tương ứng: (A) (B) Hình.4 Hình ảnh mô phỏng cho quá trình thiết kế mồi phát hiện vi khuẩn gây bệnh (A) Hình ảnh blast trình tự mồi với các trình tự gen của vi khuẩn E coli đã công bố trên ngân hàng gen (B) - Sơ đồ thiết kế mồi K pneumoniae sử dụng phần mềm Vector NTI 11.0 Các cặp mồi đặc hiệu cho phát hiện các vi khuẩn trong đề tài được sử dụng cho phản ứng PCR nhân các đoạn gen đích có trình. .. Bệnh vi n, vi c chẩn đoán xác định chính xác và nhanh chóng chúng là vi c làm rất cần thiết 1.2 Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người Enterobacteriaceae là các chi vi khuẩn đường ruột Gram âm có hình que, chiều dài điển hình từ 1 μm đến 5 μm kị khí không nghiêm ngặt, lên men đường thành acid lactic Hầu hết chúng khử nitrat thành nitrit, ngoại trừ một số vi khuẩn. .. là vi khuẩn cơ hội thường gây vi m tiết niệu, đây cũng được xác định là một cửa vào gây NKH trong trường hợp nhiễm trùng đường niệu nặng, có tổn thương Do vậy, vi c xác định vi khuẩn này sớm giúp ích cho vi c điều trị cho bệnh nhân 1.2.5 Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaece Ngoài các vi khuẩn kể tên trên như E coli, K pneumoniae, Samonella sp, Proteus sp còn có các vi khuẩn khác thuộc họ. .. đơn lẻ phát hiện một tác nhân vi khuẩn gây bệnh, như vậy giá thành sẽ cao Để tăng cường khả năng chẩn đoán và vượt qua những thiếu sót của PCR, Chamberlain và cộng sự là những người đầu tiên mô tả, phát triển kỹ thuật PCR đa mồi vào năm 1988 Trong kỹ thuật PCR đa mồi, nhiều gen đích được khuếch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng Kỹ thuật PCR đa mồi tiết kiệm thời gian, công . các tham số nhằm xây dựng một quy trình PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae. Quy trình không chỉ hướng tới thiết lập phản ứng PCR đa mồi phát hiện đặc. sinh gây bệnh, chúng tôi đề xuất đề tài Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi với các mục tiêu như sau: a) Xây. trưng cho vi khuẩn E. coli 41 Hình 12. Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội chuẩn 42 Hình 13. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae