CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. XÂY ĐỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
3.1.1.Tính chuyên biệt của cặp mồi phái hiện Clostridium perfringens bằng phương pháp PCR
Tính chuyên biệt của cặp mồi phát hiện C. perfringens là khả năng bắt cặp ehuyên biệt cùa các cặp mồi. Khảo sát được thực hiện trên các chủng vi sinh vật khác nhau gồm: C. perfringens, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Campylobaeter, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Shigella sonnei, Clostridium botulinum. Kết quả khảo sát được tình bày ở Hình 8.
Kết quả ở Hình 8 cho thấy từ giếng 2 - 5 phản ứng PCR cho sản phẩm khuếch đại 283bp với khuôn DNA của các chủng C. perfringens. Các chủng vi sinh vật không
44
phải C. perfringen đều không cho tín hiệu khuếch đại với 2 cặp mồi trên. Như vậy, cặp mồi PL là chuyên biệt đối với C. perfringen.
3.1.2.Khảo sát các điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR
Để xác định các điều kiện thích hợp cho phản ứng PCR phát hiện C. Perfringen, chúng tôi tiến hành khảo sát sự thay đổi các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng như nồng độ MgP2+P, nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp.
3.1.2.1.Xác định nồng độ Mg2+ tối ưu
Trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi PL để phát hiện C. Perfringen, nồng độ MgP2+P là yếu tố quyết định việc bất cặp giữa mồi và khuôn DNA và hoạt động kéo đài của Taq DNA polymerase. Nếu nồng độ độ MgP2+P quá cao se không cho sản phẩm khuếch đại hoặc cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Ngược lại, nếu nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ không cho hoặc cho quá ít sản phẩm khuếch đại và không thể phát hiện được khi điện đi. Vì vậy, để xác định nồng độ MgP2+P tối ưu cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ trong khoảng 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0mM. Kết quả khảo sát này được minh họa ở Bảng 4 và Hình 9.
Kết quả ở Bảng 4 và Hình 9 cho thấy nồng độ MgP2+P từ 1,5 mM -4,0mM đều cho kết quả khuếch đại dương tính. Tuy nhiên, qua nhiều lần khảo sát, chúng tôi thấy nồng độ MgP2+P l,5mM ổn định nên nồng độ này được chọn cho các khảo sát tiếp theo.
45 3.1.2.2.Xác định nồng độ mồi tối ưu
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ tối ưu của cặp mồi PL cho phản ứng PCR.
Nồng độ này thay đổi từ 1,5 - 9,0pmol/phản ứng. Kết quả phản ứng PCR được trình bày ở Bảng 5 và Hình l0.
Kết quả ở Bảng 5 và Hình 10 cho thấy phản ứng khuếch đại dương tính đối với nồng độ mồi từ 1,5 - 9,0pmol. Tuy nhiên, tín hiệu sản phẩm có độ dài 283bp rõ nét ở nồng độ mồi 6,0pmol và đây cũng là nồng độ luôn cho kết quả ổn định qua nhiều lần khảo sát. Do đổ, chúng tôi chọn nồng độ này là nồng độ thích hợp cho phản ứng PGR.
Như vậy, các nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện C. perfringens là 6,0pmol cho mỗi mồi PL.
Bảng 5. Nồng độ mồi trong phản ứng PCR
46 3.1.2.3.Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu
Nhiệt độ bắt cặp là yếu tố quan trọng quyết định phản ứng PCR. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp khác nhau trong phản ứng PCR phát hiện C.
perfringens. Các nhiệt độ được chọn khảo sát là 48, 50, 52, 55, 58, 60, 62°C. Kết quả được thể hiện ở Hình 11.
Ở các nhiệt độ bắt cặp 48°C, 50°C, 52°C, 62°C phản ứng PCR đều cho kết quả âm tính. Ngược lại, ở các nhiệt độ 55°C, 58°C, 60°C phản ứng PCR đều cho kết quả dương tính. Tuy nhiên qua khảo sát, chúng tôi thấy ở nhiệt độ 55°C luôn cho các tín hiệu khuếch đại rõ đẹp. Do đó, chúng tôi chọn nhiệt độ này là nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR phát hiện C. perfringens.
Như vậy, chúng tôi có thể đưa ra kết luận về các thành phần và điều kiện phản ứng PCR phát hiện C. perfringens như sau:
- Nhiệt độ và thời gian các bước ương mỗi chu kì: 94°C trong 30 giây, 55°C trong 40 giây, 72°C trong 45 giây. số chu kì được lập lại là 35.
- Nồng độ mỗi mồi PL là 6pmol/phản ứng.
- Nồng độ MgP2+P thích hợp là 1,5mM/phản ứng.
47
3.1.3.Thời gian tăng sinh cần thiết đề phát hiện C. perfringens trong thực phẩm bằng phản ứng PCR
Để đánh giá khả năng phát hiện C. perfringens và ảnh hưởng (nếu có) của chất nền thực phẩm lên phản ứng PCR, phương pháp phát hiện C. perfringens được thực hiện trên những mẫu thực phẩm gây nhiễm ở mức 50 -100 tế bào/l0g mẫu. Nuôi tăng sinh trong tủ ấm ở 37°C, sau mỗi 2 giờ thu và xử lí dịch mẫu để làm khuôn DNA cho phản ứng PCR. Kết quả các phản ứng PCR theo thời gian nuôi tăng sinh được minh họa ở Bảng 6 và Hình 12.
Bảng 6. Thời gian tăng sinh tối thiểu phất hiện C. perfringens trong mẫu
Kết quả ở Bảng 6 và Hình 12 cho thấy bằng phương pháp PCR ta có thể phát hiện C. perfringens sớm nhất sau 18 giờ nuôi cấy.
48
3.1.4.Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện C. perfringens
Độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện C. perfringens chính là số tế bào C.
perfringens nhỏ nhất trong 1 phản ứng mà phương pháp này có thể phát hiện được.
Thí nghiệm được thực hiện với phản ứng PCR trên từng độ pha loãng đã được xác định mật độ tế bào của chủng C. perfringens. Kết quả khảo sát được thể hiện ở Bảng 7 và Hình 13.
Bảng 7. Kết quả khảo sát độ nhạy phát hiện C. perfringens bằng phương pháp PCR
49
3.1.5.Quy trình PCR phát hiện C. perfringens trên mẫu thực phẩm
Dựa vào kết quả các thí nghiệm trên, chúng tôi đề nghị qui trình phát hiện C.
perfringens trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR như sau:
- Chuẩn bị mẫu:
Cân l0g (l0ml) mẫu thực phẩm vào bao PE vô trùng, bổ sung 90ml Saline Pepton Water (SPW). Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu STOMACHER trong 30 giây. Hút lml dịch đồng nhất trên vào ống nghiệm chứa sẩn lOml môi trường Thioglycolate vô trùng. Ủ tăng sinh ở 37°C qua đêm. Hút 1ml dịch tăng sinh vào eppendorf l,5ml, li tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối. Loại bỏ dịch trong bên trên, rửa tế bào bằng lml nước cất vô trùng. Tiếp tục li tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần nước thu sinh khối. Huyền phự húa sinh khối tế bào trong 100àl TE. Xử lớ nhiệt 100°C trong l0 phút. Để nguội, li tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ các mảnh màng tế bào, thu dịch trong bên trên làm khuôn cho phản ứng PCR.
- Thực hiện phản ứng PCR:
Phản ứng PCR được thực hiện với thể tớch 25àl trong eppendorf 0,5ml hoặc 0,2ml gồm các thành phần như Bảng 8.
50
Bảng 8. Thành phần sử dụng trong phản ứng PCR phát hiện C. Perfringens
Phản ứng PCR được thực hiện theo chương trình khuếch đại: biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút; phản ứng PCR gồm 35 chu kì, mỗi chu kì gồm 3 bước: 94°C trong 30 giây, 55°C trong 40 giây, 72Cc trong 45 giây. Sau phản ứng, sản phẩm PCR được giữ ở 72°C trong 10 phút để các đoạn DNA chưa tổng hợp hoàn chỉnh sẽ được tiếp tục tổng hợp để hoàn tất chiều đài. Sản phẩm khuếch đại được giữ ổn định ở 4°C cho đến khi điện di phân tích sản phẩm.
- Phân tích sản phẩm khuyếch đại:
Sản phẩm sau khi khuếch đại được điện đi trong gel agarose 1,2% ở điện thế 110V trong 30 phút. Sau khi điện đi, sản phẩm được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide trong 10 phứt, rửa lại bằng nước rồi quan sát dưới tía uv có bước sóng 312nm.
-Xử lí kết quả:
+ Nếu xuất hiện vạch tương đương với 283bp như vạch chuẩn thì kết luận phản ứng PCR là dương tính.
+ Nếu không xuất hiện vạch hoặc vạch có kích thước khác với 283bp thì kết luận
51 phản ứng PCR là âm tính.
Các bước của quy trình phát hiện C. perfringens trong thực phẩm được tóm tắt ở Hình 14.
Vậy tổng thời gian cho toàn bộ quy trình phát hiện c. peiýringens khoảng 24 giơ;
gồm khoảng 20 giờ tăng sinh, 4 giờ thực hiện phản ứng PCR và xem kết quả, kể từ khi nhận mẫu cho đến khỉ cho kết quả. So với phương pháp nuôi cấy truyền thống phải cần ít nhất từ 3 - 5 ngày thì phương pháp PCR phát hiện C. perfringens trong thực phẩm cho kết quả nhanh hơn.
52