3.2.1.Phân lập và định danh các chủng C. perfringens trong thực phẩm
Để có các chủng C. perfringens dùng cho việc xác nhận hiệu lực phương pháp PCR để xét nghiệm c. perfringens, chứng tôi tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn này từ các mẫu thực phẩm và nguồn nước sông Sài Gòn. Mẫu thực phẩm khô như mực, cá lưỡi trâu, cá cơm, cá chỉ vàng..., mắm (mắm nêm, mắm cá sặc, mắm tôm, nước mắm...), được thu từ các chợ Tân Phú (Thủ Đức), chợ Bình Hưng Hòa (Bình Chánh), chợ Tam Bình (Thủ Đức) và nước thu từ nguồn nước sông Sài Gòn.
Từ 40 mẫu thực phẩm, nước sông Sài Gòn chúng tôi đã phân lập được 20 chủng (Bảng 9) có đặc trưng hình thái khuẩn lạc của c perýringens trên môi trường ISA (Hình 15A). Các chủng này được khẳng định bằng các thử nghiệm như khả năng lên men lactose sinh axit, tính di động, thử nghiệm nitratase, gelatine. Kết quả thử nghiệm cho phép khẳng định cả 20 chủng đã phân lập đều là C. perfringens
- Thử nghiệm khả năng lên men sữa: sau 2 giờ lên men ương môi trường iron- milk, sữa bị đông tụ do axit sinh ra bởi sự lên men lactose của C. perfringens (Hình 15B).
- Khả năng di động: trên môi trường thạch mềm, C. perfringens mọc theo đường cấy mà không mọc lan ra môi trường xung quanh. Như vậy, C. perfringens không có khả hăng di động (Hình 15C).
53
A. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường ISA; B. Khả năng lên men lactose và đông tụ sữa; C. Tính không di động; D. Khả năng khử nitrate; E. Khả năng làm tan gelatin
1, Không có C. perfringens; 2. Chửng C. perfringens phân lập
- Khả năng khử nitrate: khi thêm sulphanilamide và N-napthylenediamine vào môi trường nitrate broth đã có vi khuẩn mọc, môi trường chuyển sang màu đỏ hồng.
Như vậy, C. perfringens có khả năng khử nitrate thành nitrite (Hình 15D).
- Khả năng thủy giải gelatine: sau 1-3 ngày nuôi cây trên môi trường gelatin, vi khuẩn làm tan chảy môi trường. Vậy C. perfringens có khả năng thủy giải gelatin (Hình 15E).
54
55
Bảng 9. Kết quả phân lập chủng c. perýrỉngens trong các loại thực phẩm.
This image cannot currently be displayed.
56
3.2.2.Giới hạn phát hiện của C. perfringens trên mẫu thực phẩm
Gây nhiễm mẫu thực phẩm đã được xác định là âm tính với c. perỷrỉngens bằng cách huyền phù tế bào C. perfringens sao cho mật độ của vi khuẩn đạt 0,1 - 5, 6 – l0, l1 -20, 21 - 50 GFU/g mẫu ủ ở 37°C trong điều kiện kị khí. Sau mỗi 24 giờ nuôi cấy, lấy lml canh khuẩn để xử lí và phân tích để xác định giới hạn phát hiện trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR. Kết quả được trình bày ở Bảng l0 và Hình 16.
Bảng 10. Giới hạn phát hiện C. perfringens trên các loại mẫu thực phẩm
57
1 - 6: Gia vị gây nhiễm; 7-11: Đồ hộp gây nhiễm
1: Thang DNA l00bp; 2,7: 0CFU/g; 3, 8: 1- 5CFU/g; 4, 9: 6 - 10CFU/g; 5, l0:
11 - 20CFU/g; 6, 11: 21 - 50CFU/g.
Kết quả trên Bảng l0 và Hình 16 cho thấy sau 24 giờ tăng sinh, phương pháp PCR cho kết quả dương tính trên tất cả các mẫu thực phẩm được gây nhiễm với mật độ 1 - 5CFU/g. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích bằng phương pháp nuôi cấy. Các mật độ gây nhiễm từ 5 -10CFU/g hay cao hơn, phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR đều cho cho kết quả dương tính trên cả 2 loại mẫu thực phẩm gây nhiễm. Kết quả khảo sát này cho thấy phương pháp PCR có nhiều ưu điểm hơn phương pháp nuôi cấy như: giới hạn phát hiện tương đương phương pháp nuôi c, thời gian cho kết quả lại ngắn hơn.
58
3.2.3.Xác định các thông số kĩ thuật tương đối của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy
Các thông số kĩ thuật của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy được đánh giá dựa trên 20 mẫu thực phẩm thuộc các nhóm: sữa, thịt, rau quả, gia vị... âm tính với C. perdfringens và được gây nhiễm với mật độ 5 - 10CFU/g. Mẫu gây nhiễm
59
được phân tích đồng thời bằng phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy. Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 11. Từ kết quả trên Bảng 11 có thể tóm tắt mối tương quan giữa các kết quả khi phân tích bằng phương pháp PCR và nuôi cấy như trên Bảng 12.
Bảng 12. Mối tương quan giữa các kết quả khi phân tích bằng phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy truyền thống
PA (positive agreement): kết quả đồng dương tính (phương pháp PCR +; phương pháp nuôi cấy +)
NA (negative agreement): kết quả đồng âm tính (phương pháp PCR -; phương pháp nuôi cấy -)
NU (negative deviation): độ lệch âm (phương pháp PCR -; phương pháp nuôi cấy+)
PD (positive deviation): độ lệch dương (phương pháp PCR +; phương pháp nuôi cấy -)
Từ các dữ liệu ở Bảng 12, các thông số kĩ thuật tương đối giữa phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy đước tính toán như sau:
60
Các thông số kĩ thuật trên cho thấy phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy cho kết quả tương đồng có thể chấp nhận được. Với 20 mẫu âm tính và 20 mẫu được gây nhiễm đã khảo sát, độ chính xác tương đối là 97,5%, độ đặc hiệu tương đối là 100%, độ nhạy tương đối là 94,1%. Hai phương pháp có độ lệch âm là 0%, độ lệch dương là 5,8%. Giá tri xP2P< 3,84 cho thấy không có sự khác biệt khi phân tích C.
perfringens trong thực phẩm bằng phương pháp PCR hay phương pháp nuôi cấy.
Trường hợp có kết quả không tương đồng giữa phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy (đối với mẫu sữa chua Vinamilk) hay cho độ lệch âm (đối với mẫu sữa đặc có đường, sữa tươi, bột canh) có thể là do độ pH trong thành phần sữa thấp, do một số chất ức chế ương bột canh làm ức chế phản ứng PCR hay ảnh hưởng đến sự tăng sinh của vi sinh vật nên hàm lượng DNA chưa đủ để phát hiện bằng phương pháp PCR.
Như vậy có thể kết luận là phương pháp PCR để phát hiện C. perfringens trong thực phẩm hoàn toàn có thể thay thế được phương pháp nuôi cấy truyền thống. Tuy nhiên, phương pháp PCR có ưu điểm hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống do có thời gian phân tích ngắn hơn.
61
3.3. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PGR ĐỂ KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM C.
PERFRINGENS TRÊN M ẪU THỰC TẾ
Khảo sát này nhằm mục đích áp dụng phương pháp PCR vào việc phân tích C.
perfringens trong thực phẩm, đối chiếu lại kết quả của phương pháp PCR và phường pháp truyền thống trên số lượng mẫu phân tích nhiều hơn. Đồng thời, qua đó có thể đánh giá tình hình nhiễm C. perfringens trong các loại thực phẩm đang lưu hành trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh.
Khảo sát này được thực hiện trên 52 mẫu thực phẩm thu từ chợ, siêu thị và các cơ sở sản xuất trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh, tập trang vào các loại thực phẩm đóng hộp hoặc chế biến sẵn từ thịt, hải sản. Mỗi mẫu được tiến hành phân tích bằng cả phượng pháp PCR và phương pháp nuôi cấy. Kết quả được thể hiện ở Bảng 13.
Kết quả trên Bảng 13 cho thấy sự hiện diện của C. perfringens trong các mẫu thực phẩm lưu hành ở Tp. Hồ Chí Minh là rất thíp. Trong tổng số 52 mẫu khảo sát, chỉ phát hiên được 8 mẫu nhiễm C. perfringens, chủ yếu trên mắm và khô. Mặt khác, kết quả trên cũng cho thấy khả năng phát hiện C. perfringens trong thực phẩm bằng phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy trong khảo sát trên là tương đương nhau.
Tuy nhiên, đây chỉ là kết quả sơ bộ, để có kết luận chính xác và đầy đủ hơn về tần suất xuất hiện C. perfringens trong thực phẩm cần có sự khảo sát trên diện rộng với kế hoạch lấy mẫu trên qui mô lớn hơn.
62
63