1.6.KĨ THUÂT PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM
1.6.1.Nguyên tắc của kĩ thuật PCR [3], [4]
PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích ĐNA ban đầu. Phương pháp này cho phép nhân số lượng bản sao của khuôn thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu. Hiện nay, kĩ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm.
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy được vạch DNA sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Vậy để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo cặp mồi chuyên biệt. Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen.
Phản ứng PCR nhân bản sao DNA là một chuỗi gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước (Hình 4).
22
- Bước 1: (biến tính, denaturation): được thực hiện ở nhiệt độ cao để hai mạch của DNA bị biến tính và tách thành mạch đơn. Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn TRmR của phân tử, thông thường là ở 94 - 95°C trong vòng 30 - 60 giây.
- Bước 2: (lai, anealation): các cặp mồi bắt cặp vào khuôn. Trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp hơn TRmR của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn.
Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70°C tùy thuộc vào TRmR
của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây.
- Bước 3: (tổng hợp, elongation): ĐNA polymerase xúc tác việc tổng hợp DNA bằng cách hình thành mạch mới bổ sung với mạch khuôn. Ở bước này, nhiệt độ được tăng đến 72°c giúp cho DNA polymerase tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Trong phản ứng PCR, một chu kì gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần. Mỗi chu kỳ làm táng gấp đôi số lượng bản sao. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Sau 30 - 40 chu kì, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng l0P6P bản sao.
Sau phản ứng PCR, mẫu được điện di trong gel agarose và được nhuộm bằng ethidium bromide. Vạch DNA mục tiêu được phát hiện bằng cách soi dưới tia UV ở bước sóng 312nm.
1.6.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng PCR [3], [4]
- DNA bản mẫu
23
Phản ứng PCR không đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu, có thể thực hiện trên DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần. Mặc dù vậy, để đạt được kết quả tối ưu, cần sử dụng DNA bản mẫu có độ tinh sạch cao. Ngoài ra, nồng độ DNA sử dụng ương mỗi phản ứng thường rất thấp để tránh tình trạng nhân bản sao không chuyên biệt (khuếch đại kí sinh).
- DNA polymerase
Đây là enzym có vai trò trong việc kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ mồi ban đầu. Do phải hoạt động trong giai đoạn biến tính ở nhiệt độ cao nên yêu cầu trước tiên đối với enzym là phải chịu được nhiệt độ. Hiện nay, có rất nhiều loại DNA polymerase được sử dụng rộng rãi trên thị trường nhưng việc sử dụng loại enzym nào, với nồng độ bao nhiêu sẽ tùy thuộc vào yêu cầu của từng phản ứng và hoạt tính của enzym đó. DNA polymerase thường được dùng nhất là Taq DNA polymerase. Enzym này được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus và có khả năng chịu được nhiệt độ cao.
- Mồi và nhiệt độ bắt cặp của mồi
Đối với phương pháp PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.
Do đó, cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Trình tự nucleotide của mồi được lựa chọn sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược cũng như không có sự tự bắt cặp bên trong bản thân mồi, hình thành các cấu trúc kẹp tóc. Thành phần các nucleotide trong mồi phải cân bằng nhau. Nhiệt độ bắt cặp (TRmR) giữa 2 mồi không quá chênh lệch. Ngoài ra, kích thước của các mồi không quá lớn, thường vào khoảng 20 - 30 base.
- Các thành phần khác
+ dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate): là một hỗn hợp gồm 4 loại nucleotide dATP, dGTP, đCTP và dTTP. dNTP cung cấp năng lượng cho phản ứng PCR nhờ các nối phosphate giàu năng lượng và được gắn vào đầu 3'- OH của nucleotide trong mồi bằng liên kết phosphodiester. Nồng độ dNTP sử dụng tùy thuộc vào điều kiện phản ứng chung nhưng nếu sử dụng ở nồng độ cao dễ dẫn đến hiện
24 tượng khuếch đại kí sinh.
+ Dung dịch đệm và MgClR2
Dung dịch đệm thường đi kèm với Taq DNA polymerase, tạo sự ổn định hoạt động của enzym.
Ion MgP2+P cũng là một trong những thành phần ảnh hưởng tới kết quả phản ứng PCR. ở một nồng độ tối ưu, lon này làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu và tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP. Nếu nồng độ MgP2+P quá thấp (< 0,5mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq DNA polymerase bị ức chế.
+ Số lượng chu kì phản ứng: sau một số chu kì nhất định, các thành phần ương phản ứng bị phân hủy hay bị cạn kiệt, các sản phẩm phụ hình thành gây ức chế phản ứng và các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà tự bắt cặp với nhau, dẫn đến tình trạng hiệu quả khuếch đại giảm. Vì vậy, để thu được kết quả cao cần thực hiện phản ứng không quá 40 chu kì.
+ Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng: để đảm bảo tính ổn định về nhiệt độ giữa các lần khảo sát nên sử dụng cùng một loại thiết bị và dụng cụ. Đồng thời, để tránh các trường hợp ngoại nhiễm, cần sử dụng tất cả các dụng cụ mới cho phản ứng PCR.
1.6.3.Ưu và nhược điểm cua phương pháp PCR trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm
So với các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm khác, phương pháp PCR có một số ưu điểm như:
- Thời gian cho kết quả nhanh
- Có thể phát hiện được các vi sinh vật khó nuôi cấy
- Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn trường hợp huyết thanh học, không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp.
- Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
- Cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của vi sinh vật
25 gây bệnh hoặc gây ngộ độc.
Mặc dù vậy, phương pháp PCR vẫn còn một số nhược điểm như:
- Hoạt tính của Taq DNA polymerase có thể bị ức chế bởi thành phần phức tạp của mẫu thực phẩm.
- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy tăng sinh làm giàu để có được mật độ vi sinh vật đủ để phát hiện bằng phương pháp PCR.
- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết.