BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐINH ĐẠI ĐỘ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN SA SÚT TRÍ NHỚ THỰC NGHIỆM CỦA l-TETRAHYDROPALMATIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ***************** ĐINH ĐẠI ĐỘ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN SA SÚT TRÍ NHỚ THỰC NGHIỆM CỦA l-TETRAHYDROPALMATIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. TS. Nguyễn Hoàng Anh 2. TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng Nơi thực hiện: - Khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu - Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Bằng tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới: - TS. Nguyễn Hoàng Anh - Phó giám đốc Trung tâm DI & ADR Quốc gia, Giảng viên Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội. - TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng - Trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu. Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập thể khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu, đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo thêm cho em nhiều kiến thức quý báu, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thu Hằng và DS. Phạm Đức Vịnh, Giảng viên Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội đã có những góp ý quý báu và nhiệt tình giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong Ban giám hiệu Nhà trường, các phòng ban, các bộ môn của Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường. Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, những người bạn đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2015 Sinh viên Đinh Đại Độ MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cương về bệnh Alzheimer và chứng sa sút trí tuệ 3 1.1.1. Các khái niệm 3 1.1.2. Dịch tễ bệnh Alzheimer 4 1.1.3. Nguyên nhân gây bệnh 5 1.1.3.1. Các kiểu gen gây ra cơ địa dễ bị bệnh Alzheimer 5 1.1.3.2. Các yếu tố biểu sinh (Epigenetic factors) 6 1.1.3.3. Các yếu tố tác động khác 6 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh 7 1.2. Thuốc điều trị 7 1.2.1. Thuốc điều trị các tổn thương thuộc nhận thức 9 1.2.1.1. Thuốc ức chế enzym acetylcholinesterase 9 1.2.1.2. Thuốc ức chế receptor NMDA (N-methyl-D-aspartat): Memantin 11 1.2.1.3. Vitamin E, selegilin và các thuốc khác 11 1.2.2. Một số thuốc điều trị các triệu chứng không thuộc nhận thức 12 1.2.2.1. Thuốc chống trầm cảm 12 1.2.2.2. Thuốc an thần 13 1.2.2.3. Thuốc giải lo âu 13 1.2.2.4. Thuốc duy trì tâm trạng ổn định 14 1.2.3. Hướng điều trị trong tương lai 14 1.2.3.1. Ngăn cản hình thành amyloid bất thường 14 1.2.3.2. Phá hủy các mảng amyloid đã hình thành 14 1.2.3.3. Tạo tổ chức mới 14 1.3. Tác dụng dược lý của l-THP 15 1.3.1. Cấu trúc hóa học 15 1.3.2. Một số kết quả nghiên cứu về tác dụng dược lý của l-THP. 15 1.3.2.1. Tác dụng ức chế thần kinh trung ương 15 1.3.2.2. Tác dụng giải lo âu 15 1.3.2.3. Tác dụng an thần 16 1.3.2.4. Ảnh hưởng trên hoạt động tự nhiên 16 1.3.2.5. Tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro và cải thiện sa sút trí nhớ của l-tetrahydropalmatin 17 1.4. Ứng dụng l- tetrahydropalmatin trong điều trị 17 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Nguyên liệu 18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2. Hóa chất, thiết bị 18 2.1.2.1. Hóa chất 18 2.1.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị 18 2.1.3. Động vật thí nghiệm 20 2.1.4. Chuẩn bị thuốc thử, hóa chất 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Các thí nghiệm trong nghiên cứu và điều kiện nghiên cứu 20 2.2.2. Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ in vivo bằng test mê lộ nước Morris 21 2.2.2.1. Phương pháp gây sa sút trí nhớ 21 2.2.2.2.Test mê lộ nước Morris 22 2.2.3. Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ bằng test nhận diện đồ vật 23 2.2.4. Đánh giá khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase ex vivo 25 2.2.5. Đánh giá khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro 26 2.2.6. Liều lượng sử dụng trong nghiên cứu 27 2.3. Xử lý số liệu 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1. Tác dụng cải thiện khả năng học tập và nghi nhớ in vivo bằng test mê lộ nước Morris của l-tetrahydropalmatin. 28 3.1.1. Bài tập nhìn thấy bến đỗ 28 3.1.2. Bài tập không nhìn thấy bến đỗ 28 3.1.3. Bài tập không có bến đỗ 30 3.2. Tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ bằng test nhận diện đồ vật 31 3.3. Khả năng ức chế enzym acetylcholineserase ex vivo của l-tetrahydropalmatin 33 3.4. Khả năng ức chế enzym acetylcholineserase in vitro của l-tetrahydropalmatin 34 3.5. Bàn luận 36 3.5.1. Về áp dụng mô hình gây suy suy giảm trí nhớ bằng phương pháp thắt 2 động mạch cảnh và rút máu đuôi chuột 38 3.5.2. Về việc lựa chọn mô hình test MWM và ORT 39 3.5.3. Về tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ của l-THP 40 3.5.4. Về khả năng ức chế AChE ex vivo và in vitro của l-THP 41 3.5.5. So sánh kết quả nghiên cứu về l-THP với các alcaloid có cấu trúc tương tự 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO % ức chế DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACCI Acetylcholine iodid ACh Acetylcholin AChE Acetylcholinesterase ApoE Apolipoprotein APP Amyloid precursor protein (protein tiền chất amyloid) Aβ β amyloid BuChE Butyrylcholinerterase DTNB Acid 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ) GABA Gamma amino butyric acid l-THP l-tetrahydropalmatin MAO-B Monoamino oxidase B MWM Morris Water Maze (Mê lộ nước Morris) NMDA N-methyl-D-aspartat NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs (các thuốc chống viêm không steroid) ORT Object Recognization Test (Thử nghiệm nhận diện đồ vật) SSRI Serotonin selective reuptake inhibitors (Ức chế tái thu hồi chọn lọc serotonin) WHO World health organization (Tổ chức Y tế thế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Một số hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm 18 2.2 Phân lô nghiên cứu đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ in vivo 22 3.1 Tác dụng ex vivo của l-THP và tacrin đối với hoạt độ enzym AChE 33 3.2 Tác dụng ức chế in vitro enzym AChE của l-THP và tacrin 34 3.3 Giá trị IC 50 và các thông số khác của các mẫu nghiên cứu 35 3.4 Giá trị IC 50 của một số thuốc có cấu trúc tương tự l-THP 43 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Sơ đồ bệnh sinh của Alzheimer 8 2.1 Sơ đồ hệ thống mê lộ nước Morris 19 2.2 Dụng cụ của thí nghiệm nhận diện đồ vật 19 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20 2.4 Sơ đồ phẫu thuật chuột trong thí nghiệm gây thiếu máu não cục bộ tạm thời 21 2.5 Sơ đồ qui trình bài tập trên test mê lộ nước Morris 22 2.6 Sơ đồ thiết kế test nhận diện đồ vật 24 3.1 Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ở bài tập nhìn thấy bến đỗ của các lô thí nghiệm 28 3.2 Sự thay đổi về thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ở bài tập không nhìn thấy bến đỗ của các lô thí nghiệm 29 3.3 Tỷ lệ % thời gian chuột ở cung phần tư đích trong bài tập không có bến đỗ của các lô thí nghiệm 30 3.4 Thời gian khám phá vật thể của các lô thí nghiệm ở giai đoạn mẫu 31 3.5 Tỷ lệ thời gian khám phá vật thể O3 của các lô thí nghiệm ở giai đoạn kiểm tra 32 3.6 Tác dụng ức chế enzym AChE phụ thuộc vào nồng độ của l- THP và chất đối chiếu tacrin 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sa sút trí tuệ nói chung và bệnh Alzheimer (Alzheimer’s Disease) nói riêng hiện nay là mối quan tâm hàng đầu của các nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở Việt Nam, trong bối cảnh tuổi thọ trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh này ngày càng nhiều. Sa sút trí tuệ thật sự là một thảm họa đối với người cao tuổi, gây sa sút trí nhớ và nhiều lĩnh vực nhận thức khác, kèm theo với những rối loạn về hành vi, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng hoạt động hàng ngày và chất lượng sống của bệnh nhân [7], [13]. Hiện chưa có phương pháp nào thực sự có hiệu quả trong điều trị chứng sa sút trí tuệ nói chung và bệnh Alzheimer nói riêng. Các phương pháp điều trị bằng thuốc kết hợp với chăm sóc chỉ có thể làm chậm sự tiến triển của bệnh, làm chậm sự mất chức năng nhận thức, hành vi của bệnh nhân. Hơn nữa, các thuốc đang được sử dụng để điều trị bệnh lý này hiện có khá nhiều tác dụng không mong muốn, giá thành cao trở thành gánh nặng kinh tế cho bệnh nhân khi có nhu cầu điều trị lâu dài. Các thuốc hóa dược mới đã và đang được nghiên cứu, tuy nhiên, với cơ chế bệnh sinh phức tạp khiến việc nghiên cứu các phương pháp điều trị còn gặp nhiều khó khăn. Do vậy, xu hướng nghiên cứu phát triển thuốc điều trị suy giảm nhận thức có nguồn gốc từ dược liệu là một hướng có triển vọng, bổ sung cho các biện pháp hóa dược hiện tại. l-tetrahydropalmatin (l-THP) là 1 alcaloid được tìm thấy ở nhiều loài thực vật khác nhau, chủ yếu thuộc chi Corydalis (Yan Hu Suo) [36] và chi Stephania Lour. [23]. Theo Ngô Đại Quang (1999), tác dụng dược lý của l-THP được nghiên cứu từ thời Pháp thuộc và đã được áp dụng điều trị từ năm 1944 cho các trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng. Tác dụng dược lý nổi bật nhất của l-THP là tác dụng an thần, gây ngủ nhưng có độc tính thấp, dung nạp tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý cho người bệnh [10]. Một số kết quả công bố gần đây cho thấy tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) in vitro của dịch chiết một số loài thuộc chi Stephania Lour. [2], [5], [6], [8], [11], [12]. Hơn nữa, l-THP và một số alcaloid có cấu trúc hóa học tương tự như palmatin, berberin, pseudoberberin có tác dụng ức [...]... tài: Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ thực nghiệm của l- tetrahydropalmatin với hai mục tiêu: 1 Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ của l-THP trên mô hình động vật gây suy giảm trí nhớ bằng thắt động mạch cảnh và rút máu đuôi chuột 2 Đánh giá khả năng ức chế hoạt tính enzym AChE ex vivo và in vitro của l-THP 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. 1 Đại cƣơng về bệnh Alzheimer và chứng sa sút trí. .. sử dụng mê lộ nước Morris (để nghiên cứu tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ của l-THP trên chuột với các mức liều 5 mg/kg và 10 mg/kg, trong đó tác nhân gây suy giảm trí nhớ là methamphetamin (10 mg/kg) Kết quả cho thấy ở liều 10 mg/kg, l-THP có tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ rõ rệt, tuy nhiên tác dụng này không thể hiện ở mức liều 5 mg/kg Kết quả này gợi ý rằng tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ. .. sulfat cũng thể hiện tác dụng chống co giật gây ra bởi corazol và thể hiện tác dụng giảm đau ở mức liều 30 mg/kg [20] 1. 3.2.5 Tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro và cải thiện sa sút trí nhớ của l -tetrahydropalmatin Theo kết quả nghiên cứu của Hung TM và cộng sự, l-THP có tác dụng ức chế AChE in vitro với giá trị IC50 là 41, 3 µM (giá trị IC50 của chất đối chiếu tacrin là 0 ,17 µM) [32], [33]... gian làm thực nghiệm được duy trì ở mức thấp nhất có thể nhìn thấy (khoảng 12 0 lux) Hai nghiên cứu còn lại cũng được tiến hành ở điều kiện ánh sáng tối thiểu tương tự khi xử lý mẫu và khi đo độ hấp thụ quang 2.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ in vivo bằng test mê lộ nước Morris 2.2.2 .1 Phương pháp gây sa sút trí nhớ Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện kỹ thuật gây sa sút trí nhớ bằng... tác dụng gây độc tế bào [17 ] 1. 2.3.3 Tạo tổ chức mới - Sinh tế bào thần kinh (stem cell) - Cấy ghép thần kinh [17 ] 15 1. 3 Tác dụng dƣợc lý của l -tetrahydropalmatin 1. 3 .1 Cấu trúc hóa học - Công thức phân tử: C21H25NO4 - Tên khoa học: 5,8 ,13 ,13 a-tetrahydro-2,3,9 ,10 -tetramethoxy-6H-dibenzo[a,g] quinolizin - Tên khác: rotundin, gindarin, caseanin, hyndarin [1] 1. 3.2 Một số kết quả nghiên cứu về tác dụng. .. giây Chuột sẽ nhớ lại vị trí của bến đỗ và có xu hướng bơi lâu hơn tại góc phần tư của mê lộ đặt bến đỗ ở những bài tập trước Camera sẽ ghi lại và phân tích thời gian chuột bơi ở mỗi góc phần tư của mê lộ 2.2.3 Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ bằng test nhận diện đồ vật Nguyên tắc: Các lô chuột sau khi đã được điều trị với thuốc (mẫu thử) sẽ được đánh giá khả năng cải thiện trí tạm thời (short... triệu chứng của bệnh từ nhẹ đến nặng, giúp cải thiện một phần về nhận thức và chức năng trong vòng 12 - 24 tuần Lợi ích điều trị thường kéo dài trên 1 năm trừ dopenezil có thể duy trì hiệu quả đến ít nhất 2 năm [4], [17 ], [18 ] Có một số bằng chứng cho thấy các thuốc kháng AChE còn có lợi cho bệnh nhân sa sút trí tuệ thuộc mạch, sa sút trí tuệ hỗn hợp, sa sút trí tuệ thể Lewy Với bệnh nhân sa sút trí tuệ... tác dụng cải tác dụng cải cứu khả khả năng thiện sa sút thiện sa sút năng ức ức chế trí nhớ in trí nhớ in chế enzym enzym vivo bằng vivo bằng AChE ex AChE in test MWM test ORT vivo vitro Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 21 Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành trong phòng riêng biệt, yên tĩnh, tại khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Thời gian tiến hành thí nghiệm trong khoảng từ 7h30’ -18 h... có tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ và khả năng học tập trên động vật thực nghiệm [11 ], [28], [33], [40], [43], [44], [54], mở ra triển vọng bổ sung chỉ định mới trên lâm sàng của nhóm thuốc này Cũng cần nhấn mạnh rằng đây là nhóm thuốc mà nguồn dược liệu để chiết xuất rất sẵn có ở Việt Nam với giá thành sản xuất tương đối rẻ Để góp phần nghiên cứu tác dụng này của l-THP, chúng tôi tiến hành đề thực. .. là tác dụng chống rối loạn hoảng sợ tương tự chất đối chiếu clomipramin 25 mg/kg khi sử dụng liều lặp lại 21 ngày và tác dụng này không xuất hiện khi sử dụng liều đơn l-THP [15 ], [16 ] Tại các mức liều thể hiện tác dụng giải lo âu (0 ,1 mg/kg đến 1 mg/kg), l-THP không làm ảnh hưởng tới khả năng hoạt động tự nhiên, khả năng khám phá của 16 chuột (mô hình môi trường mở) đồng thời không thể hiện tác dụng . của l-THP, chúng tôi tiến hành đề thực hiện đề tài: Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ thực nghiệm của l- tetrahydropalmatin với hai mục tiêu: 1. Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút. tác dụng dược lý của l-THP. 15 1. 3.2 .1. Tác dụng ức chế thần kinh trung ương 15 1. 3.2.2. Tác dụng giải lo âu 15 1. 3.2.3. Tác dụng an thần 16 1. 3.2.4. Ảnh hưởng trên hoạt động tự nhiên 16 1. 3.2.5 2.2 .1. Các thí nghiệm trong nghiên cứu và điều kiện nghiên cứu 20 2.2.2. Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ in vivo bằng test mê lộ nước Morris 21 2.2.2 .1. Phương pháp gây sa sút trí nhớ