BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ MẤT VÙNG KHỨU GIÁC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH CỦA RAU ĐẮNG BIỂN (BACOPA MONNIERI (LINN) WETTST) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực luận văn, nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô đồng nghiệp Đầu tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Thị Nguyệt Hằng TS Nguyễn Thị Lập, hai người thầy ln tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị đồng nghiệp bạn bè công tác Khoa dược lý – sinh hóa - Viện dược liệu Bộ mơn Hóa sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội phối hợp tạo điều kiện giúp thực luận văn Lời cảm ơn cuối xin gửi tới gia đình bạn bè ln quan tâm động viên, giúp đỡ tơi hồn thành nhiệm vụ Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Trần Thị Hương Giang MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh sa sút trí tuệ 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Dịch tễ 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Tiêu chuẩn chuẩn đoán 1.1.5 Nguyên nhân chế bệnh sinh 1.1.6 Thuốc điều trị sa sút trí tuệ 10 1.1.6.1 Nhóm thuốc điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức 10 1.1.6.2 Nhóm điều chỉnh hành vi 12 1.1.7 Hạn chế thuốc điều trị sa sút trí tuệ 13 1.1.7.1 Về hiệu điều trị 13 1.1.7.2 Về tương tác thuốc, tác dụng không mong muốn 14 1.1.8 Một số mơ hình nghiên cứu 15 1.2 Cây rau đắng biển 1.2.1 Đặc điểm thực vật học rau đắng biển 16 1.2.2 Các nghiên cứu hóa học 17 1.2.3 Các nghiên cứu tác dụng dược lý 21 1.2.3.1 Tác dụng dược lý chung 21 1.2.3.2 Tác dụng dược lý chung 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 24 2.1.1 Nguồn gốc 24 2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 24 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 2.1.2.1 Chuột ddY bị suy giảm trí nhớ/nhận thức vùng 25 khứu giác (Olfactory bulbectomy of mice – OBX) 25 2.1.2.2 Tế bào NG 108-15 protein β – amyloid 25-35 26 2.1.3 Hóa chất, thiết bị 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết cồn 95% rau đắng biển chuột suy giảm nhận thức vùng khứu giác thử nghiệm nhận diện vật thể thử nghiệm mê lộ chữ Y 2.2.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ thử nghiệm nhận dạng đồ vật (Object Recognization Test – ORT) 2.2.1.2 28 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian thử nghiệm mê lộ chữ Y 2.2.2 28 30 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh mơ hình gây độc tế bào NG 108-15 protein β – amyloid (Aβ 25-35) in vitro 2.2.2.1 Đánh giá ảnh hưởng cao chiết cồn 95% rau đắng biển tế bào NG 108 – 15 2.2.2.2 32 Thăm dò khả gây độc protein Aβ 25-35 tế bào NG 108 – 15 2.2.2.3 32 33 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh cao chiết cồn rau đắng biển tế bào NG 108 – 15 theo mơ hình gây độc Aβ 25-35 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết cồn 95% 34 36 36 rau đắng biển chuột suy giảm nhận thức vùng khứu giác thử nghiệm nhận diện vật thể thử nghiệm mê lộ chữ Y 3.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ thử nghiệm nhận dạng đồ vật (Object Recognization Test – ORT) 3.1.2 3.2 36 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ khơng gian thử nghiệm mê lộ chữ Y Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh mơ hình 39 gây độc tế bào NG 108-15 protein beta amyloid in vitro 3.2.1 Ảnh hưởng cao chiết cồn từ rau đắng biển lên khả sống sót tế bào thần kinh NG 108 – 15 3.2.2 42 Thăm dò khả gây độc protein Aβ 25-35 tế bào thần kinh NG 108-15 3.2.3 42 44 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh cao chiết cồn rau đắng biển tế bào NG 108 – 15 theo mô hình gây độc βA 25-35 44 CHƯƠNG BÀN LUẬN 46 4.1 Mơ hình nghiên cứu 46 4.1.1 Ngun liệu 46 4.1.2 Động vật thí nghiệm 47 4.1.3 Tế bào thần kinh NG 108-15 protein βA 25-35 49 4.2 Kết nghiên cứu 4.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ thử nghiệm nhận dạng đồ vật (Object Recognization Test – ORT) 4.2.2 50 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ thử nghiệm mê lộ chữ (Y maze test – YM) 52 4.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh rau đắng biển mơ hình gây độc tế bào NG 108-15 protein Aβ 25-35 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACh Acetylcholine AChE Enzym Acetylcholinesterase AD Bệnh Alzheimer (Alzheimer disease) APP Protein tiền chất amyloid (Amyloid precursor protein) Aβ 25-35 Amyloid β-Protein Fragment 25-35 BuChE Butyrylcholinesterase Cs Cộng ddY Dulbecco’s Modified Eagle Medium g dl/kg gam dược liệu/kg thể trọng chuột HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence MAPT Một gen mã hóa protein Tau (Microtubule-Associated Protein Tau) MNT Magnetic resonance tomography (Chụp cộng hưởng từ cắt lớp) NFTs Neurofibillary Tangles (Đám rối thần kinh) NFT Đám rối thần kinh (Neurofibrillary tangle) NMDA N-methyl D-aspartate ORT Object Recognization Test OBX Olfactory Bulbectomy of mice RĐB: Rau Đắng Biển ROESY Rotating frame Overhause Effect SpectroscopY YM Y Maze SOD Superoxide dismutase SPECT Single Photon Emission Computed Tomography: chụp cắt lớp xạ đơn photon SSRIs Selective serotonin reuptake inhibitors (Các chất ức chế tái hấp thu serotonin chọn lọc) SSTT Sa sút trí tuệ βAP β-amyloid peptid ĐẶT VẤN ĐỀ Sa sút trí tuệ nhóm bệnh lý mạn tính tiến triển định nghĩa “sự xuất phát triển rối loạn nhận thức bao gồm suy giảm trí nhớ có triệu chứng: ngôn ngữ, động tác, nhận thức rối loạn việc thực chức hoạt động hàng ngày [2], [20] Theo số nghiên cứu thống kê công bố giới có khoảng 25 triệu người bị sa sút trí tuệ năm 2000 tăng lên 63 triệu vào năm 2030 114 triệu vào năm 2050 Tỷ lệ độ tuổi cụ thể sa sút trí tuệ toàn giới Trong số người sa sút trí tuệ, 60% sống nước phát triển, số tăng lên 71% vào năm 2040 Tỷ lệ tăng số người bị sa sút trí tuệ nước phát triển dự đoán cao khu vực phát triển ba đến bốn lần [24] Có nhiều cơng trình nghiên cứu thực nhằm mục đích tìm phương pháp hiệu để đẩy lùi tượng sa sút trí tuệ Các thuốc điều trị sa sút trí tuệ chủ yếu tân dược kiểm sốt triệu chứng khơng thể ngăn chặn đẩy lùi bệnh Hơn nữa, giá thành thuốc tương đối cao, có tác dụng phụ khơng mong muốn, ỉa chảy, ngủ, buồn nôn, viêm phế quản, phân lỏng, chuột rút…và nhiều tác dụng khác mà chưa biết đến [27] Do đó, nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ điều trị sa sút trí tuệ cần thiết giới quan tâm Ở Việt Nam, rau đắng biển hay gọi rau sam trắng, biết đến ăn khơng phổ biến miền thơn q mà thành phố lớn, dành cho tầng lớp nghèo giàu xã hội Rau đắng biển sử dụng làm thuốc Y học cổ truyền Ấn Độ hàng nhiều thập kỷ qua, để điều trị nhiều rối loạn, đặc biệt rối loạn lo lắng, giảm sút trí tuệ trí nhớ [1] Lồi thực vật bán thị trường châu Âu dạng thực phẩm chức để kích thích trí nhớ Do đó, rau đắng biển đối tượng triển vọng để nghiên cứu làm thuốc điều trị sa sút trí tuệ Thời gian gần nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý rau đắng biển giới thực ngày nhiều Các nghiên cứu tác dụng dược lý Bacopa monnieri (L.) động vật thực thành công quy mô lớn Tuy nhiên Việt Nam nghiên cứu tác dụng dược lý Bacopa monnieri (L.)chưa nhiều, để khẳng định tác dụng dược lý điều trị sa sút trí tuệ phát triển thành sản phẩm thuốc cần có nhiều nghiên cứu cụ thể Với mục đích chúng tơi tham gia thực đề tài: Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ chuột bị vùng khứu giác tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn) wettst) Với mục tiêu cụ thể: - Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ cao chiết cồn 95% rau đắng biển chuột suy giảm nhận thức vùng khứu giác thử nghiệm nhận diện vật thể thử nghiệm mê lộ chữ Y - Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh rau đắng biển mơ hình gây độc tế bào NG 108-15 protein beta amyloid in vitro Kết nghiên cứu đề tài phù hợp với kết nhóm tác giả Nguyễn Thu Hương, Trần Mỹ Tiên (2006) nghiên cứu theo mơ hình mê lộ nước morris chứng minh cao cồn rau đắng biển liều 50, 100 mg/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ đối tượng chuột bị suy giảm trí nhớ tiêm phúc mạc Scopolamin [5] 4.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ thử nghiệm mê lộ chữ (Y maze test – YM) Thử nghiệm mê lộ chữ Y (Y Maze Spontaneous Alternation, Y maze test) thử nghiệm hành vi để đo lường khả sẵn sàng khám phá môi trường động vật gặm nhấm Thử nghiệm triển khai nhằm mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ/ nhận thức hình thành thơng qua q trình học tập làm việc phụ thuộc vị trí khơng gian rau đắng biển chuột bị suy giảm nhận thức vùng khứu giác Trong mơ hình chuột thường có xu hướng thích khám phá nhánh quay trở lại nhánh khám phá trước Nhiều phận não bao gồm hải mã, vách ngăn, vỏ não tham gia vào q trình Đây vùng có dấu hiệu tổn thương nhiều bệnh Alzheimer nói riêng bệnh sa sút trí tuệ nói chung Thử nghiệm mê lộ chữ Y thực qua hai giai đoạn: giai đoạn luyện tập với mục đích cho chuột làm quen với nhánh Y1 nhánh Y2 mở nhánh Y3 đóng, giai đoạn kiểm tra nhánh Y3 mở đóng vai trị nhánh Chuột bình thường có khả nhận diện nhánh Y3 có xu hướng khám phá nhánh nhiều Kết nghiên cứu cho thấy giai đoạn kiểm tra lơ chuột bệnh lý OBX có tỷ lệ thời gian khám phá nhánh Y3 34,99% ± 2,72% thấp lô chuột sinh lý (p < 0,05) xấp xỉ xác suất ngẫu nhiên 33.33% có nghĩa khơng có ưu tiên khám phá nhánh nhánh quen thuộc lô 52 chuột bệnh lý Kết thêm lần cho thấy đề tài thành công áp dụng mơ hình phá hủy vùng khứu giác, phương pháp này, chuột bị suy giảm trí nhớ Mặt khác, tỷ lệ thời gian khám phá nhánh Y3 nhóm chuột OBX sau xử lý với tacrin (44,95 ± 3,53%) cao nhóm bệnh lý (34,99% ± 2,72%) (p0.05), 106.64%, 86.06%, 71,99%, 38.04% (p