BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NÔNG THỊ THANH PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH VÀ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG HỌC TẬP NHẬN THỨC CỦA PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL CHIẾT TỪ CÂY RAU ĐẮNG BIỂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NÔNG THỊ THANH PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH VÀ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG HỌC TẬP NHẬN THỨC CỦA PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL CHIẾT TỪ CÂY RAU ĐẮNG BIỂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Đỗ Thị Nguyệt Quế 2. TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng Nơi thực hiện: Phòng Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu _ Số 3B, Quang Trung, Quận Hoàn Kiếm, Hà Nội HÀ NỘI – 2014 i LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian học tập và nghiên cứu, em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới: TS. Đỗ Thị Nguyệt Quế - giảng viên bộ môn Dược lực - trường Đại học Dược Hà Nội TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng - Trưởng phòng Dược lý – Sinh hóa Viện Dược liệu trung ương - những người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cám ơn đến Tập thể cán bộ phòng Dược lý – Sinh hóa - Viện Dược liệu trung ương, đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo thêm cho em nhiều kiến thức quý báu, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Em xin cảm ơn toàn thể các thầy giáo, cô giáo của Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tận tình giảng dạy cho em cũng như các bạn sinh viên của trường trong suốt năm năm học tập. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nông Thị Thanh Phương ii MỤC LỤC Danh mục các từ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình, sơ đồ v ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Một vài khái niệm về bệnh Alzheimer và chứng sa sút trí tuệ 3 1.1.1. Khái niệm 3 1.1.2. Phân loại 3 1.2. Cơ chế bệnh sinh 4 1.2.1. Giả thuyết beta Amyloid 4 1.2.2. Giả thuyết đám rối thần kinh (Neurofibrillary Tangles - NFTs) 5 1.2.3. Giả thuyết Cholinergic và những bất thường về các chất dẫn truyền thần kinh khác 5 1.2.4. Các chất gây viêm trung gian 6 1.2.5. Các cơ chế khác 7 1.3. Các thuốc điều trị Alzheimer 8 1.3.1. Các nhóm thuốc điều trị Alzheimer 8 1.3.2. Tacrin 9 1.3.3. Hạn chế của các thuốc điều trị Alzheimer 10 1.3.3.1. Về hiệu quả điều trị 10 1.3.3.2. Về tương tác thuốc, tác dụng không mong muốn 11 1.4. Nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer 12 1.4.1. Nghiên cứu thuốc nhằm làm giảm βAP 12 1.4.2. Nghiên cứu thuốc tác dụng trên các đích khác 14 1.5. Một số mô hình nghiên cứu thuốc tác động lên nhận thức và các bệnh sa sút trí tuệ 15 1.6. Vài nét về cây Rau đắng biển 17 2.1. Nguyên liệu 21 iii 2.2. Động vật thí nghiệm 21 2.3. Hóa chất, trang thiết bị 21 2.4. Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1. Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cắn phân đoạn n- butanol chiết từ Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát gây độc bằng beta-amyloid 22 2.4.1.1. Phương pháp tách và nuôi cấy tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát 22 2.4.1.2. Đánh giá độc tính của mẫu thử trên tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát 23 2.4.1.3. Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cắn phân đoạn n- butanol chiết từ Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát gây độc bằng βA 25-35 24 2.4.2. Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng học tập và ghi nhớ in vivo 26 2.4.2.1. Phương pháp gây thiếu máu não cục bộ tam thời theo mô hình 2VO + hypo 26 2.4.2.2. Thử nghiệm mê lộ nước Morris 26 2.5. Xử lý số liệu 29 3.1. Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trên mô hình gây độc tế bào bằng protein βA25-35 của cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển 30 3.1.1 Ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu đối với khả năng sống sót của tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát 30 3.1.2 Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát khỏi tổn thương bởi protein βA25-35 31 3.2. Tác dụng cải thiện khả năng học và nhớ in vivo bằng thử nghiệm mê lộ nước Morris của cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển 32 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 36 4.1. Về tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của phân đoạn butanol chiết từ Rau đắng biển 36 4.2. Về tác dụng tăng khả học tập và trí nhớ in vivo của phân đoạn butanol chiết từ cây Rau đắng biển 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 iv Danh mục các từ viết tắt ADAS-Cog Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive (Thang đáng giá nhận thức trong bệnh Alzheimer) ApoE4 Apolipoprotein E4 APP Amyloid precursor protein (protein tiền chất amyloid) BuOH n-butnol GSK3b glycogen synthase kinase 3b HDL High-density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng cao) ICD 10 International Classification of Diseases 10 th (Phân loại bệnh quốc tế lần thứ 10) LDL Low-density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng thấp) NFTs Neurofibrillary Tangles (đám rối thần kinh) NMDA N-methyl-D-aspartate βA25-35 Amyloid β-Protein Fragment 25-35 ( đoạn acid amin β-amyloid peptid chứa 11 acid amin) βAP β-amyloid peptid v Danh mục bảng STT Trang 1 Bảng 1.1 Phân loại chứng sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer 4 2 Bảng 1.2 Các nhóm thuốc điều trị triệu chứng suy giảm nhận thức 9 3 Bảng 2.1 Phân nhóm thử khả năng sống sót sau gây độc tế bào bằng βA 25-35 25 4 Bảng 2.2 Phân nhóm thí nghiệm và điều trị 27 5 Bảng 3.1 Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ của các lô thí nghiệm ở bài tập nhìn thấy bến đỗ 32 6 Bảng 3.2 Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ của các lô thí nghiệm ở bài tập không nhìn thấy bến đỗ 33 Danh mục hình, sơ đồ STT Trang 1 Hình 1.1 Cấu trúc các thành phần Saponin chính trong bacosid A 18 2 Hình 2.1 Sơ đồ các bước đánh giá khả năng sống sót trên tế bào gây độc bằng beta-amyloid 26 3 Hình 2.2 Sơ đồ qui trình bài tập trên mô hình mê lộ nước Morris 28 4 Hình 2.3 Mô hình thí nghiệm mê lộ nước Morris 29 5 Hình 3.1 Ảnh hưởng của phân đoạn n-butanol Rau đắng biển đối với khả năng sống sót của tế bào thần kinh vỏ não sau 24 giờ nuôi cấy và thử thuốc 30 6 Hình 3.2 Tác dụng bảo vệ tổn thương tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát gây bởi βA 25-35 của cắn phân đoạn BuOH chiết từ Rau đắng biển 31 7 Hình 3.3 Tỷ lệ thời gian chuột ở cung phần tư đích 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sa sút trí tuệ là hậu quả của nhiều bệnh lý thần kinh khác nhau trong đó, bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất gây nên chứng sa sút trí tuệ. Chứng sa sút trí tuệ gây ra sự suy giảm năng lực nhận thức và hành vi của bệnh nhân, rút ngắn cuộc sống bệnh nhân khi bệnh tiến triển. Căn bệnh này vốn được coi là bệnh tuổi già, do nguy cơ sa sút trí tuệ tăng lên theo tuổi. Theo báo cáo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 2012, ở khu vực Âu – Mỹ bệnh hay gặp nhất ở độ tuổi 80-89, ở châu Á là 75-84 tuổi và ở Châu Phi hay gặp nhất trong độ tuổi 70 -79 [101]. Tuy nhiên, độ tuổi mắc bệnh hiện đang giảm dần [49], [101]. Các nhà nghiên cứu ước tính trên toàn thế giới có gần 7,7 triệu ca mới mắc mỗi năm. Chứng sa sút trí tuệ còn tăng gánh nặng cho gia đình bệnh nhân, cho hệ thống chăm sóc sức khỏe và cho nền kinh tế của hầu hết các quốc gia [101]. Theo hiệp hội Alzheimer quốc tế, Alzheimer và chứng sa sút trí tuệ là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 6 ở Bắc Mỹ. Trong năm 2012, nước Mỹ cần tới 15,4 triệu người chăm sóc dành cho các bệnh nhân, trị giá hơn 216 tỷ USD [10]. Việt Nam hiện chưa có con số thống kê đầy đủ. Hiện chưa có phương pháp nào thực sự có hiệu quả trong điều trị chứng sa sút trí tuệ nói chung và bệnh Alzheimer nói riêng. Các phương pháp điều trị bằng thuốc kết hợp với chăm sóc chỉ có thể làm chậm sự tiến triển của bệnh, làm chậm sự mất chức năng nhận thức, hành vi của bệnh nhân. Hơn nữa, các thuốc đang được sử dụng để điều trị suy giảm nhận thức còn nhiều tác dụng không mong muốn và gây nhiều độc tính trên bệnh nhân. Các thuốc mới đã và đang được nghiên cứu, tuy nhiên, cơ chế bệnh sinh phức tạp cũng khiến cho việc nghiên cứu các phương pháp điều trị khó khăn và kém toàn diện. Hiện nay, xu hướng nghiên cứu thuốc điều trị suy giảm nhận thức từ dược liệu là một hướng có triển vọng. Ở Việt Nam, một số nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá tác dụng tăng khả năng học tập và bảo vệ tế bào thần kinh từ dược liệu như các saponin trong Sâm Ngọc Linh, Hương Nhu Tía, Củ bình vôi, … Rau Đắng Biển hay còn gọi là Rau sam đắng, tên khoa học Bacopa monnieri (Linn.) Pennell họ Hoa Mõm Chó (Scofulariacea) là cây thuốc được sử dụng trong 2 y học cổ truyền Ấn Độ làm thuốc bổ thần kinh, tăng cường trí nhớ, trị bệnh động kinh [1], [2]. Ở Việt Nam, Rau đắng biển mọc hoang dại, được sử dụng làm rau ăn và cũng được dùng như một vị thuốc điều trị một số chứng bệnh trong y học dân gian. Việc nghiên cứu tác dụng trên trí nhớ, khả năng học tập của cây Rau Đắng Biển đã được nghiên cứu trên thế giới và bước đầu được nghiên cứu ở Việt Nam [3], [4] tuy nhiên vẫn chưa được đầy đủ về cả số lượng và chất lượng kết quả nghiên cứu. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh và cải thiện khả năng học tập nhận thức của phân đoạn n-butanol chiết từ cây Rau đắng biển ”. Khóa luận nằm trong đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu tác dụng cải thiện khả năng học, nhớ và bảo vệ tế bào thần kinh của cây Rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn.) Wettst.) theo hướng làm thuốc điều trị Alzheimer” (Phê duyệt QĐ số 769/QĐ-BYT, ngày 13 tháng 3 năm 2012, chủ nghiệm đề tài: TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng – Viện dược liệu trung ương.) Mục tiêu nghiên cứu: - Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của phân đoạn n-butanol chiết từ cây Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát bị gây độc bằng protein beta- amyloid. - Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng học tập nhận thức trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm trí nhớ do thiếu máu não cục bộ tạm thời của phân đoạn n-butanol chiết từ cây Rau đắng biển. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Một vài khái niệm về bệnh Alzheimer và chứng sa sút trí tuệ 1.1.1. Khái niệm Chứng sa sút trí tuệ (Dementia) được định nghĩa là sự suy giảm khả năng nhận thức và giảm khả năng thực hiện “thành công” các hoạt động sinh hoạt hằng ngày [24]. Theo phân loại bệnh quốc tế lần thứ 10 - ICD10, “Chứng sa sút trí tuệ (F00- F03) là một hội chứng do bệnh của não bộ, thường có tính chất mạn tính hay tiến triển, trong đó có sự xáo trộn của nhiều chức năng vỏ não cao hơn, bao gồm cả trí nhớ, tư duy, định hướng, tính toán, năng lực học tập, ngôn ngữ và phán xét”. Ý thức của bệnh nhân không bị mất đi. Sự suy giảm nhận thức thường được đi kèm hoặc xuất hiện trước sự suy giảm khả năng kiểm soát cảm xúc, hành vi xã hội, hoặc động cơ của bệnh nhân. Hội chứng sa sút trí tuệ hay gặp ở bệnh Alzheimer, bệnh mạch máu não và trong các bệnh khác là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ phát ảnh hưởng tới bộ não [102]. Trong đó, bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng 50% - 70% số trường hợp rối loạn chức năng nhận thức [24], [49]. 1.1.2. Phân loại a. Phân loại hội chứng sa sút trí tuệ Các rối loạn tạo thành chứng sa sút trí tuệ được phân loại và xác định trên cơ sở các yếu tố gây bệnh khác nhau và những con đường sinh lý khác nhau. Trong một số tài liệu, chứng sa sút trí tuệ được phân loại thành các typ hoặc các dạng [10], [24], [29], [49]. Các typ phổ biến của chứng sa sút trí tuệ gồm:  Sa sút trí tuệ bệnh Alzheimer (Dementia in Alzheimer disease)  Sa sút trí tuệ bệnh mạch máu (Vascular dementia)  Sa sút trí tuệ do thể Lewy (Lewy body dementia)  Sa sút trí tuệ thùy trán-thái dương, gồm cả bệnh Pick (Frontotemporal dementia, Pick’s disease)  Sa sút trí tuệ do các nguyên nhân có thể đảo ngược khác như: nhiễm độc mạn tính (do rượu hoặc thuốc), thiếu vitamin, bệnh tâm thần, hormon và suy [...]... đáng chú ý khi mang lại lợi ích trong sự tăng cường khả n ng nh n thức tr n bệnh nh n [28], , nhưng thử nghiệm lâm sàng pha 3 của latrepirdin đã thất bại (được công bố tr n clinicaltrials.gov), tuy nhi n các loại thuốc bảo vệ tế bào th n kinh khác v n đang được nghi n cứu 1.5 Một số mô hình nghi n cứu thuốc tác động l n nh n thức và các bệnh sa sút trí tuệ Nghi n cứu các tác dụng l n nh n thức tr n. .. động vật là phương pháp phổ bi n để nghi n cứu tác dụng dược lý của thuốc thuốc tác dụng l n nh n thức và các bệnh gây sa sút trí tuệ Kỹ thuật ph n tích hành vi sử dụng động vật để nghi n cứu những mô hình bệnh ở người và dự đo n các tác dụng của thuốc được sử dụng rộng rãi [80] Tr n thế giới, các mô hình nghi n cứu tác dụng của thuốc tr n khả n ng học tập và trí nhớ được áp dụng phổ bi n dựa tr n khả. .. trường, thêm vào 50µl DMSO vào mỗi giếng để hòa tan tinh thể Đo độ hấp thụ ánh sang ở bước sóng 550nm bằng máy ELISA Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ tế bào sống sót sau nuôi cấy 24 giờ - Dựa vào kết quả định lượng tế bào sống sót, ch n nồng độ mẫu thử thích hợp để tiếp tục đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gây độc bằng beta-amyloid 2.4.1.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào th n kinh của c n ph n đo n n- butanol chiết. .. Mẫu thử: c n ph n đo n n- butanol từ dịch chiết n ớc Rau đắng bi n Bacopa monieri (Linn.) Pennell thu thập ở Nghệ An, do Vi n dược liệu trung ương cung cấp 2.2 Động vật thí nghiệm - Chuột nhắt trắng cung cấp bởi Vi n vệ sinh dịch tễ Trung ương + Chuột dùng cho thí nghiệm đánh giá khả n ng học tập của mẫu nghi n cứu: được nuôi n định ít nhất 1 tu n, đạt đ n trọng lượng 23-25g trước khi ti n hành phẫu thuật... thể h n về những tác dụng dược lý từ những thành ph n trong dịch chiết của cây rau đắng bi n Tác dụng tr n trí nhớ và nh n thức của cây rau đắng bi n đã được nghi n cứu đã có một số kết quả nghi n cứu tr n động vật thí nghiệm [3], [4], [54], [63], [71], [93], [96] và tr n người [66], [82] [83], [90], [91], [92], [94] Những nghi n cứu tr n động vật cho thấy dịch chiết Rau đắng bi n làm giảm thời gian trễ... thống đánh giá tr n máy tính CDR (CDR system) [90], [94] … so với nhóm chứng Cơ chế tác dụng của các thành ph n dịch chiết Rau đắng bi n ở mức độ tế bào và ph n tử v n đang được nghi n cứu Những nghi n cứu tr n chuột suy giảm nh n thức cho thấy dịch chiết Rau đắng bi n có tác dụng l n hệ thống glutamat và hệ cholinergic như: giảm hoạt động của các emzym acetyl cholinesterase trong tất cả các vùng n o... chế tác dụng dược lý của thuốc thử nghiệm Tuy nhi n, những thử nghiệm ph n tích hành vi v n là công cụ không thể thiếu, cùng với những thông tin thu được từ nghi n cứu ph n tử và tế bào được đưa vào thực thành trong nghi n cứu hành vi động vật một cách đầy đủ [80] Cùng với sự phát tri n công nghệ sinh học tế bào và công nghệ sinh học ph n tử, việc ti n hành các mô hình nghi n cứu khác ở mức độ tế bào. .. 2.4.1.1 Phương pháp tách và nuôi cấy tế bào th n kinh vỏ n o nguy n phát Nguy n tắc [17], [60], [61]: Vỏ n o tách từ một cơ thể sống (thường là chuột), xử lý bằng enzym và bi n pháp cơ học nhằm ph n cắt các mô li n kết thu được các tế bào th n kinh và một lượng nhỏ tế bào đệm riêng lẻ Bổ sung chất diệt tế bào đệm mà không làm ảnh hưởng các tế bào th n kinh Nuôi cấy trong môi trường và điều ki n thích hợp... vào tế bào th n kinh và li n kết với NFTs Mức cholesterol cao trong tế bào th n kinh n o có thể làm thay đổi chức n ng màng tế bào, d n đ n hình thành các βAP và các mảng bám Những giả thuyết khác được đề xuất để giải thích bệnh Azheimer bệnh bao gồm sự oxy hóa, rối lo n chức n ng ty thể và những ảnh hưởng của estrogen ở phụ n sau m n kinh Rối lo n chức n ng của ty thể có thể làm gi n đo n quá trình... trường, thêm vào 50µl DMSO vào mỗi giếng để hòa tan tinh thể Đo độ hấp thụ bằng đo quang ở bước sóng 550nm bằng máy ELISA Thí nghiệm lặp lại 3 l n trong cùng điều ki n nghi n cứu Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ tế bào sống sót của nhóm thử so với nhóm chứng 26 Hình 2.1 Các bước đánh giá khả n ng sống sót tr n tế bào gây độc bằng βA 25-35 2.4.2 Đánh giá tác dụng cải thi n khả n ng học tập và ghi nhớ in vivo 2.4.2.1 . Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NÔNG THỊ THANH PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH VÀ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG HỌC TẬP NHẬN THỨC CỦA PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL CHIẾT TỪ CÂY RAU ĐẮNG. - Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của phân đoạn n-butanol chiết từ cây Rau đắng biển trên tế bào vỏ não nguyên phát bị gây độc bằng protein beta- amyloid. - Đánh giá tác dụng cải thiện. lượng và chất lượng kết quả nghiên cứu. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh và cải thiện khả năng học tập nhận thức của phân đoạn n-butanol chiết từ cây