BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NÔNG THỊ THANH PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH VÀ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG HỌC TẬP NHẬN THỨC CỦA PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL CHIẾT TỪ CÂY RAU ĐẮNG BIỂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NÔNG THỊ THANH PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH VÀ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG HỌC TẬP NHẬN THỨC CỦA PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL CHIẾT TỪ CÂY RAU ĐẮNG BIỂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Nguyệt Quế TS Phạm Thị Nguyệt Hằng Nơi thực hiện: Phòng Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu _ Số 3B, Quang Trung, Quận Hoàn Kiếm, Hà Nội HÀ NỘI – 2014 i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu, em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới: TS Đỗ Thị Nguyệt Quế - giảng viên môn Dược lực - trường Đại học Dược Hà Nội TS Phạm Thị Nguyệt Hằng - Trưởng phòng Dược lý – Sinh hóa Viện Dược liệu trung ương - người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tạo điều kiện thuận lợi cho em trình nghiên cứu thực đề tài Em xin gửi lời cám ơn đến Tập thể cán phòng Dược lý – Sinh hóa Viện Dược liệu trung ương, nhiệt tình giúp đỡ, bảo thêm cho em nhiều kiến thức quý báu, tạo điều kiện tốt cho em trình thực đề tài Em xin cảm ơn toàn thể thầy giáo, cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, tận tình giảng dạy cho em bạn sinh viên trường suốt năm năm học tập Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2014 Sinh viên Nông Thị Thanh Phương Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ii MỤC LỤC Danh mục từ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình, sơ đồ .v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Một vài khái niệm bệnh Alzheimer chứng sa sút trí tuệ 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại 1.2 Cơ chế bệnh sinh .4 1.2.1 Giả thuyết beta Amyloid 1.2.2 Giả thuyết đám rối thần kinh (Neurofibrillary Tangles - NFTs) .5 1.2.3 Giả thuyết Cholinergic bất thường chất dẫn truyền thần kinh khác 1.2.4 Các chất gây viêm trung gian 1.2.5 Các chế khác 1.3 Các thuốc điều trị Alzheimer 1.3.1 Các nhóm thuốc điều trị Alzheimer 1.3.2 Tacrin 1.3.3 Hạn chế thuốc điều trị Alzheimer 10 1.3.3.1 Về hiệu điều trị 10 1.3.3.2 Về tương tác thuốc, tác dụng không mong muốn 11 1.4 Nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer 12 1.4.1 Nghiên cứu thuốc nhằm làm giảm βAP 12 1.4.2 Nghiên cứu thuốc tác dụng đích khác 14 1.5 Một số mô hình nghiên cứu thuốc tác động lên nhận thức bệnh sa sút trí tuệ .15 1.6 Vài nét Rau đắng biển 17 2.1 Nguyên liệu 21 iii 2.2 Động vật thí nghiệm 21 2.3 Hóa chất, trang thiết bị 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu .22 2.4.1 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh cắn phân đoạn nbutanol chiết từ Rau đắng biển tế bào vỏ não nguyên phát gây độc beta-amyloid 22 2.4.1.1 Phương pháp tách nuôi cấy tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát 22 2.4.1.2 Đánh giá độc tính mẫu thử tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát 23 2.4.1.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh cắn phân đoạn nbutanol chiết từ Rau đắng biển tế bào vỏ não nguyên phát gây độc βA 25-35 24 2.4.2 Đánh giá tác dụng cải thiện khả học tập ghi nhớ in vivo 26 2.4.2.1 Phương pháp gây thiếu máu não cục tam thời theo mơ hình 2VO + hypo 26 2.4.2.2 Thử nghiệm mê lộ nước Morris 26 2.5 Xử lý số liệu 29 3.1 Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh mơ hình gây độc tế bào protein βA25-35 cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển 30 3.1.1 Ảnh hưởng mẫu nghiên cứu khả sống sót tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát 30 3.1.2 Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não nguyên phát khỏi tổn thương protein βA25-35 31 3.2 Tác dụng cải thiện khả học nhớ in vivo thử nghiệm mê lộ nước Morris cắn phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển .32 CHƯƠNG BÀN LUẬN .36 4.1 Về tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh phân đoạn butanol chiết từ Rau đắng biển .36 4.2 Về tác dụng tăng khả học tập trí nhớ in vivo phân đoạn butanol chiết từ Rau đắng biển 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi iv Danh mục từ viết tắt ADAS-Cog Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive (Thang đáng giá nhận thức bệnh Alzheimer) ApoE4 Apolipoprotein E4 APP Amyloid precursor protein (protein tiền chất amyloid) BuOH n-butnol GSK3b glycogen synthase kinase 3b HDL High-density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng cao) ICD 10 International Classification of Diseases 10th (Phân loại bệnh quốc tế lần thứ 10) LDL Low-density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng thấp) NFTs Neurofibrillary Tangles (đám rối thần kinh) NMDA N-methyl-D-aspartate βA25-35 Amyloid β-Protein Fragment 25-35 ( đoạn acid amin β-amyloid peptid chứa 11 acid amin) βAP β-amyloid peptid v Danh mục bảng Trang STT Bảng 1.1 Phân loại chứng sa sút trí tuệ bệnh Alzheimer Bảng 1.2 Các nhóm thuốc điều trị triệu chứng suy giảm nhận thức Bảng 2.1 Phân nhóm thử khả sống sót sau gây độc tế bào 25 βA 25-35 Bảng 2.2 Phân nhóm thí nghiệm điều trị 27 Bảng 3.1 Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ lơ thí 32 nghiệm tập nhìn thấy bến đỗ Bảng 3.2 Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ lơ thí 33 nghiệm tập khơng nhìn thấy bến đỗ Danh mục hình, sơ đồ Trang STT Hình 1.1 Cấu trúc thành phần Saponin bacosid A 18 Hình 2.1 Sơ đồ bước đánh giá khả sống sót tế bào 26 gây độc beta-amyloid Hình 2.2 Sơ đồ qui trình tập mơ hình mê lộ nước Morris 28 Hình 2.3 Mơ hình thí nghiệm mê lộ nước Morris 29 Hình 3.1 Ảnh hưởng phân đoạn n-butanol Rau đắng biển đối 30 với khả sống sót tế bào thần kinh vỏ não sau 24 ni cấy thử thuốc Hình 3.2 Tác dụng bảo vệ tổn thương tế bào thần kinh vỏ não 31 nguyên phát gây βA 25-35 cắn phân đoạn BuOH chiết từ Rau đắng biển Hình 3.3 Tỷ lệ thời gian chuột cung phần tư đích 34 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ĐẶT VẤN ĐỀ Sa sút trí tuệ hậu nhiều bệnh lý thần kinh khác đó, bệnh Alzheimer nguyên nhân phổ biến gây nên chứng sa sút trí tuệ Chứng sa sút trí tuệ gây suy giảm lực nhận thức hành vi bệnh nhân, rút ngắn sống bệnh nhân bệnh tiến triển Căn bệnh vốn coi bệnh tuổi già, nguy sa sút trí tuệ tăng lên theo tuổi Theo báo cáo Tổ chức y tế giới (WHO) năm 2012, khu vực Âu – Mỹ bệnh hay gặp độ tuổi 80-89, châu Á 75-84 tuổi Châu Phi hay gặp độ tuổi 70 -79 [101] Tuy nhiên, độ tuổi mắc bệnh giảm dần [49], [101] Các nhà nghiên cứu ước tính tồn giới có gần 7,7 triệu ca mắc năm Chứng sa sút trí tuệ tăng gánh nặng cho gia đình bệnh nhân, cho hệ thống chăm sóc sức khỏe cho kinh tế hầu hết quốc gia [101] Theo hiệp hội Alzheimer quốc tế, Alzheimer chứng sa sút trí tuệ nguyên nhân gây tử vong đứng thứ Bắc Mỹ Trong năm 2012, nước Mỹ cần tới 15,4 triệu người chăm sóc dành cho bệnh nhân, trị giá 216 tỷ USD [10] Việt Nam chưa có số thống kê đầy đủ Hiện chưa có phương pháp thực có hiệu điều trị chứng sa sút trí tuệ nói chung bệnh Alzheimer nói riêng Các phương pháp điều trị thuốc kết hợp với chăm sóc làm chậm tiến triển bệnh, làm chậm chức nhận thức, hành vi bệnh nhân Hơn nữa, thuốc sử dụng để điều trị suy giảm nhận thức nhiều tác dụng khơng mong muốn gây nhiều độc tính bệnh nhân Các thuốc nghiên cứu, nhiên, chế bệnh sinh phức tạp khiến cho việc nghiên cứu phương pháp điều trị khó khăn toàn diện Hiện nay, xu hướng nghiên cứu thuốc điều trị suy giảm nhận thức từ dược liệu hướng có triển vọng Ở Việt Nam, số nghiên cứu thực để đánh giá tác dụng tăng khả học tập bảo vệ tế bào thần kinh từ dược liệu saponin Sâm Ngọc Linh, Hương Nhu Tía, Củ bình vơi, … Rau Đắng Biển hay gọi Rau sam đắng, tên khoa học Bacopa monnieri (Linn.) Pennell họ Hoa Mõm Chó (Scofulariacea) thuốc sử dụng y học cổ truyền Ấn Độ làm thuốc bổ thần kinh, tăng cường trí nhớ, trị bệnh động kinh [1], [2] Ở Việt Nam, Rau đắng biển mọc hoang dại, sử dụng làm rau ăn dùng vị thuốc điều trị số chứng bệnh y học dân gian Việc nghiên cứu tác dụng trí nhớ, khả học tập Rau Đắng Biển nghiên cứu giới bước đầu nghiên cứu Việt Nam [3], [4] nhiên chưa đầy đủ số lượng chất lượng kết nghiên cứu Do đó, chúng tơi thực đề tài: “ Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh cải thiện khả học tập nhận thức phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển ” Khóa luận nằm đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu tác dụng cải thiện khả học, nhớ bảo vệ tế bào thần kinh Rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn.) Wettst.) theo hướng làm thuốc điều trị Alzheimer” (Phê duyệt QĐ số 769/QĐ-BYT, ngày 13 tháng năm 2012, chủ nghiệm đề tài: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng – Viện dược liệu trung ương.) Mục tiêu nghiên cứu: - Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển tế bào vỏ não nguyên phát bị gây độc protein betaamyloid - Đánh giá tác dụng cải thiện khả học tập nhận thức chuột nhắt trắng bị gây suy giảm trí nhớ thiếu máu não cục tạm thời phân đoạn n-butanol chiết từ Rau đắng biển Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Một vài khái niệm bệnh Alzheimer chứng sa sút trí tuệ 1.1.1 Khái niệm Chứng sa sút trí tuệ (Dementia) định nghĩa suy giảm khả nhận thức giảm khả thực “thành công” hoạt động sinh hoạt ngày [24] Theo phân loại bệnh quốc tế lần thứ 10 - ICD10, “Chứng sa sút trí tuệ (F00F03) hội chứng bệnh não bộ, thường có tính chất mạn tính hay tiến triển, có xáo trộn nhiều chức vỏ não cao hơn, bao gồm trí nhớ, tư duy, định hướng, tính tốn, lực học tập, ngơn ngữ phán xét” Ý thức bệnh nhân không bị Sự suy giảm nhận thức thường kèm xuất trước suy giảm khả kiểm soát cảm xúc, hành vi xã hội, động bệnh nhân Hội chứng sa sút trí tuệ hay gặp bệnh Alzheimer, bệnh mạch máu não bệnh khác nguyên nhân nguyên phát thứ phát ảnh hưởng tới não [102] Trong đó, bệnh Alzheimer nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng 50% - 70% số trường hợp rối loạn chức nhận thức [24], [49] 1.1.2 Phân loại a Phân loại hội chứng sa sút trí tuệ Các rối loạn tạo thành chứng sa sút trí tuệ phân loại xác định sở yếu tố gây bệnh khác đường sinh lý khác Trong số tài liệu, chứng sa sút trí tuệ phân loại thành typ dạng [10], [24], [29], [49] Các typ phổ biến chứng sa sút trí tuệ gồm:  Sa sút trí tuệ bệnh Alzheimer (Dementia in Alzheimer disease)  Sa sút trí tuệ bệnh mạch máu (Vascular dementia)  Sa sút trí tuệ thể Lewy (Lewy body dementia)  Sa sút trí tuệ thùy trán-thái dương, gồm bệnh Pick (Frontotemporal dementia, Pick’s disease)  Sa sút trí tuệ nguyên nhân đảo ngược khác như: nhiễm độc mạn tính (do rượu thuốc), thiếu vitamin, bệnh tâm thần, hormon suy Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 43 Trên giới, số tác giả tiến hành nghiên cứu tác dụng cải thiện khả học tập trí nhớ chuột bị suy giảm trí nhớ số tác nhân khác Tác giả Subhash Dwivedi et al (2012) tiến hành gây suy giảm trí nhớ acid okadaic tiêm vào não thất, điều trị CDRI-08 (chế phẩm chiết xuất Rau đẳng biển Ấn Độ) với liều 40 mg/kg 80mg/kg dùng đường uống, kết cho thấy, điều trị CDRI-08 làm giảm thời gian tiềm tàng giảm chiều dài đường tìm thấy bến đỗ chuột bị gây suy giảm trí nhớ acid okadaic liều 40mg/kg (p