+ Cột tách: Cột tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định hiệu quả tách của quá trình. Để chọn đƣợc một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp nhất ta phải dựa trên những đặc điểm nhƣ: độ phân cực của chất phân tích, chất phân tích được pha trong môi trường như thế nào thì mới quyết định chọn pha tĩnh phù hợp. Chất phân tích ở đây là các akylphenol không phân cực nên cần lựa chọn pha tĩnh có bản chất gần giống nhƣ chất phân tích [1]. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, đề tài lựa chọn cột pha đảo C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 àm) để tỏch và định lƣợng các alkylphenol.
+ Van bơm mẫu, thể tích bơm mẫu: Trên thực tế một trong những khó khăn của phép tách sắc ký là: sự doãng chân pic dẫn đến hiện tƣợng chồng pic, trong đó thể tích bơm mẫu vào cột cũng là một nguyên nhân gây ra hiện tƣợng này; nếu vòng mẫu quá dài, lƣợng mẫu bơm vào cột quá lớn sẽ dẫn đến hiện tƣợng doãng pic càng lớn, các pic càng chồng lên nhau trong khi tách [1]. Đó là do lƣợng mẫu quá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng một phần mẫu vào cột tách trước, một phần ra sau dẫn đến trong quá trình tách trên cột sẽ có một phần chất phân tích ra trước và một phần ra sau gây ra hiện tượng doãng chân pic. Nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn, ví dụ nếu sai số của van bơm mẫu là 0,05l, khi bơm thể tích mẫu là 1l thì sai số sẽ là 5%, còn nếu thể tích mẫu bơm là 50l thì sai số là 0,1%. Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều rất phổ biến, do đó, chúng tôi lựa chọn loại van này và thể tích mẫu bơm là 10l.
+ Detector: detector là một bộ phận có vai trò theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký chảy ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích. Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì vậy detector UV – VIS thường được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu
[1]. Hiện nay mảng diot–photo–array phát triển, chúng có vai trò nhƣ một detector UV – VIS, nhưng chúng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bước sóng khác nhau ở cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV-VIS. Tuy nhiên, dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tôi quyết định chọn detector PAD để phát hiện các chất phân tích.
+ Bước sóng hấp thụ cực đại của các AP: trong nghiên cứu này đề tài lựa chọn phân tích NP, OP và NPEO, OPEO sau khi đã phân tách thành NP, OP tương ứng.
Chúng có cấu tạo rất giống nhau. Chỉ khác nhau là nhóm nonyl- và octyl- liên kết với phenol ở vị trí số 4, vì vậy bước sóng hấp thụ quang của NP, OP này đều giống nhau, ở 225 nm. Dải phổ hấp thụ của NP, OP đƣợc quét trên detector PAD từ 200 nm đến 600 nm, bước sóng 225 nm là đỉnh hấp thụ cực đại của các AP.
Chuan-ACN-H2O-15%-900ul2 #2870 RT:9.56 AV:1 NL:6.11E5 microAU
200 250 300 350 400 450 500 550 600
wavelength (nm) 0
50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000 550000 600000
uAU
224.00
278.00
360.00
342.00 378.00 421.00 439.00 483.00 511.00 555.00 576.00
Hình 3.1: Phổ UV-VIS của alkylphenol
+ Khảo sát và lựa chọn thành phần pha động phù hợp: thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động có thể ảnh hưởng tới những vấn đề sau của sự tách sắc ký của các chất:
- Độ chọn lọc của hệ pha - Thời gian lưu của các chất
Các chất phân tích là các chất kém phân cực, pha tĩnh đƣợc chọn cũng là cột pha đảo, kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải thì mới có thể tách các chất phân tích. Với việc chỉ phân tích NP, OP nên đề tài chọn chế độ chạy đẳng dòng và tiến hành khảo sát các hệ dung môi: MeOH-H2O, ACN-H2O.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn nồng độ 10 mg/l của NP, OP, tiến hành bơm 10 àl lờn hệ thống HPLC, nhiệt độ cột là 35 oC, tốc độ dũng 800 àl/phỳt, chạy đẳng dũng trong 30 phút với các hệ dung môi của ACN-H2O là ACN 100%; ACN/H2O: 90/10%;
ACN/H2O: 85/15%; ACN/H2O: 80/20%; ACN/H2O: 70/30%. Và các hệ dung môi của metanol là MeOH 100%; MeOH/H2O: 90/10%; MeOH/H2O: 80/20%; MeOH/H2O:
70/30%. Kết quả thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.2; 3.3.
RT:0.00 - 30.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Time (min) 0
50000 100000 0 100000 200000 0 100000 200000
uAU
0 200000 400000 0 200000
6.67 7.52
0.04 1.65 8.17 8.82 18.32 21.52 23.37
5.09 7.85
9.82
5.97 10.53
3.72 4.79
0.93 11.54 15.21 16.8718.29 21.84 23.44 24.63 25.87
11.20
14.56
1.63 2.59 4.13 6.38 7.15 8.69 11.77 15.0916.93 13.08
17.66
3.83 4.01 13.65 17.24 18.17
2.53 19.20
0.40 5.27 7.82 9.25 12.64 21.89 23.43 25.29 26.97
21.65 21.81
3.30 22.57
3.18 3.72 4.61 7.14 8.49 11.93 14.22 17.46 19.36 23.67 28.94 30.00 NL:
3.55E5 Channel A UV Chuan-ACN NL:
4.32E5 Channel A UV chuan-acn- h2o-10%
NL:
2.83E5 Channel A UV chuan-acn- h2o-15%
NL:
2.63E5 Channel A UV chuan-acn- h2o-20%
NL:
1.16E5 Channel A UV chuan-acn- h2o-30%
Hình 3.2: Khảo sát hệ dung môi pha động với ACN/H2O
O P
O P
OP O
P
O P
N P
N P N
P
N P
RT:0.00 - 30.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Time (min) 0
50000 0 20000 40000 60000 80000 -50000 0 50000
uAU
0 100000 200000
300000 5.96
6.43
5.59 7.42 0.04 2.94
8.33 10.62 0.28 2.81 4.58
16.00 16.18 22.7322.90 23.49 16.59
23.90 17.58
6.06 6.88 7.00 27.40
5.66 27.58
24.48 18.17
4.60 7.768.46 10.16 12.61 21.91
2.79 3.90 1.10 1.27
2.85 3.32
NL:
3.09E5 Channel A UV Chuan- MeOH
NL:
7.85E4 Channel A UV chuan-me- h2o-10%
NL:
8.04E4 Channel A UV chuan-me- h2o-20%-2
NL:
6.20E4 Channel A UV chuan-me- h2o-30%
Hình 3.3: Khảo sát hệ dung môi pha động với MeOH/H2O Bảng 3.1: Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động
Hệ dung môi Thời gian lưu OP (phút) Thời gian lưu NP (phút)
ACN 100%; 6,67 7,52
ACN/H2O: 90/10% 7,85 9,82
ACN/H2O: 85/15% 11,20 14,56
ACN/H2O: 80/20% 13,08 11,66
ACN/H2O: 70/30% 21,65 Chƣa ra pic
MeOH 100% 5,96 6,43
MeOH/H2O: 90/10% 8,33 10,62
MeOH/H2O: 80/20% 16,00 22,73
MeOH/H2O: 70/30% Chƣa ra pic Chƣa ra pic
O P
O P
O P N
P
N P
N P
nhƣng chƣa tách khỏi nhau; với hệ dung môi của ACN/H2O: 90/10% hoặc MeOH/H2O: 90/10% các pic đã tách rõ khỏi nhau nhƣng lại bị trùng chân; Các hệ dung môi ACN/H2O: 70/30% hoặc MeOH/H2O: 70/30% các chất phân tích chƣa ra hết trong thời gian khảo sát; các hệ dung môi ACN/H2O: 85/15%; ACN/H2O: 80/20%;
MeOH/H2O: 80/20% các pic đã tách riêng hoàn toàn. Trong đó hệ dung môi ACN/H2O: 85/15% cho lợi nhất về thời gian phân tích. Vì vậy đề tài lựa chọn hệ dung môi này cho các nghiên cứu tiếp theo và giảm thời gian chạy mẫu xuống còn 20 phút.
Nhƣ vậy, qua khảo sát, lựa chọn các điều kiện tối ƣu cho phân tích các NP, OP trên thiết bị HPLC, đề tài đã chọn đƣợc các điều kiện tối ƣu nhƣ Bảng 3.2:
Bảng 3.2: Các điều kiện tối ƣu trên HPLC
Cột tỏch Cột pha đảo C18 (30 m x 4,6 mm x 5 àm)
Detector PAD
Bước sóng hấp thụ cực đại 225 nm Thể tớch van bơm mẫu 10àL
Nhiệt độ cột 350C
Pha động Đẳng dòng ACN/H2O: 85/15% trong 20 phút
3.1.2 Các điều kiện tối ưu trên GC-MS
+ Cột tách: theo các tài liệu tham khảo [14], [16], [17], để phân tích các AP thường sử dụng cột mao quản có độ phân cực kém trên thiết bị GC-MS. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, đề tài lựa chọn cột mao quản DB-5MS với các thông số nhƣ sau:
- Bản chất pha tĩnh: Metylpolisiloxan với 5% phenyl - Chiều dài cột: 30 m
- Đường kính trong 0,25 mm - Độ dày lớp phim: 0,25 àm - Nhiệt độ tối đa: 325oC.
+ Nhiệt độ cổng bơm mẫu, nhiệt độ detector, kiểu bơm mẫu:
Các thông số nhiệt độ cổng bơm mẫu, nhiệt độ detector, kiểu bơm là những thông số cần đƣợc lựa chọn thích hợp để máy vận hành ổn định và thu đƣợc kết quả tốt.
Nhiệt độ cổng bơm mẫu thông thuờng có thể chọn từ 220-250˚C. Do các AP có nhiệt độ bay hơi cao nên nhiệt độ cổng bơm mẫu đƣợc đặt ở 250˚C nhằm đảm bảo điều kiện hóa hơi toàn bộ mẫu.
Detector MS chịu đuợc nhiệt độ cao từ 250˚C- 400˚C và để cho detector hoạt động ổn định thì nhiệt độ đặt thuờng cao hơn nhiệt độ cao nhất của chương trình nhiệt lò cột từ 5˚C-20˚C. Do cột DB-5MS có khả năng chịu đuợc nhiệt độ tối đa là 325˚C nên để đảm bảo tuổi thọ cột đồng thời cũng phù hợp với đối tuợng phân tích chuơng trình nhiệt lò cột thường ở mức tối đa từ 270˚C-280˚C. Vì vậy nhiệt độ detector đựợc chọn là 280˚C. Ở nhiệt độ này các chất phân tích sẽ hóa hơi hoàn toàn, không đọng lại trên detector làm giảm độ nhạy của detector.
Ngoài ra, đối tuợng mẫu có hàm luợng AP thấp nên kiểu bơm không chia dòng đƣợc lựa chọn.
+ Khảo sát chương trình nhiệt độ cột tách: Việc chỉ phát hiện 2 hợp chất là NP, OP và nội chuẩn nên chương trình nhiệt độ cột tách sẽ tương đối đơn giản. Chương trình nhiệt độ: 80 oC trong 0,5 phút; 30 oC/phút đến 180 oC, giữ 2 phút; 10 oC/phút đến 200 oC, giữ 1 phút; 20 oC/phút đến 280 oC, giữ 5 phút. Tổng thời gian phân tích là 18 phút.
+ Khảo sát tốc độ khí mang: tốc độ khí mang có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả tách và số đĩa lý thuyết của quá trình tách. Sự thay đổi tốc độ dòng sẽ làm thay đổi áp suất, thời gian lưu và diện tích pic. Dựa vào tài liệu hướng dẫn sử dụng thiết bị và các tài liệu tham khảo đề tài đã lƣa chọn khảo sát tốc độ khí mang He ở 0,6; 0,8; 1,0 và 1,2 ml/phút. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3 và Hình 3.4.
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát tốc độ dòng khí
TT OP NP
t S t S
0,6 ml 10,99 986723 11,72-12,49 1425994
0,8 ml 10,50 998033 11,29-12,0 1442194
1,0 ml 10,10 946643 10,93-11,67 1240914
1,2 ml 9,78 816623 10,66-11,40 956797
RT:0.00 - 18.02
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Time (min) 0
50 100 0 50 100 0 50 100
Relative Abundance
0 50
100 10.99
12.29
12.39 14.19 16.86 9.56
5.74 7.84 5.04
10.50
11.86
11.96 15.57 16.46 5.52 6.26 7.92 10.28
10.10
11.14 11.22
15.83
14.39 17.35
13.57 6.10 8.19
5.52 8.91
9.78
11.26
11.35 13.91 15.77 17.08 5.12 7.26 8.65
NL:
5.64E5 TIC MS AP-0,6ml-min
NL:
4.48E5 TIC MS ap-0,8ml-min
NL:
5.14E5 TIC MS ap-1ml-min
NL:
4.67E5 TIC MS ap-1,2ml-min
Hình 3.4: Sắc đồ khảo sát tốc độ dòng khí He
Nhận xét: Khi thay đổi tốc độ khí mang (từ 0,6-1,2 ml/phút), sự chênh lệch về thời gian lưu tăng lên không nhiều. Điều này có thể được giải thích là do trong sắc ký khí pha động (khí mang) chỉ đóng vai trò cơ học nên không làm thay đổi đáng kể khả năng tách chất, sự tách chất đƣợc quyết định chủ yếu do pha tĩnh. Do yêu cầu phân
N P
N P
N P
N P
O P
O P
O P
O P
tích và vận hành máy chúng tôi chọn tốc độ khí mang 1,0 ml/phút để đảm bảo sự tách chất tốt mà không làm doãng pic sắc ký cho các nghiên cứu tiếp theo.
+ Lựa chọn thể tích bơm mẫu: Trong sắc ký khí, thể tích bơm mẫu ảnh hưởng đến nhiều yếu tố nhƣ sự cân đối của pic sắc ký, sai số, độ nhạy của phép phân tích, tuổi thọ cột…Nếu thể tích bơm mẫu quá nhỏ, có thể gây sai số lớn khi bơm bằng tay và giảm độ nhạy. Còn nếu thể tích bơm mẫu quá lớn sẽ gây doãng pic, giảm tuổi thọ của cột. Dựa vào tài liệu hướng dẫn sử dụng của thiết bị và các tài liệu tham khảo, đề tài lựa chọn thể tớch bơm mẫu là 1àl.
+ Lựa chọn chất nội chuẩn: Với sắc ký khí, dung môi cuối cùng để phân tích thường là các dung môi hữu cơ, chúng rất dễ bay hơi, vì vậy lượng chất phân tích trong dung môi cuối cùng có thể thay đổi. Hơn nữa, quá trình bơm mẫu bằng tay cũng dẫn đến những sai số nhất định về thể tích mẫu đƣợc bơm lên hệ thống. Vì vậy trong sắc ký khí, người ta thường sử dụng các chất nội chuẩn để loại bỏ ảnh hưởng của thể tích dung môi đến nồng độ chất phân tích.
Các chất nội chuẩn đƣợc sử dụng là các chất có tính chất gần giống với chất phân tích, nhưng không có trong mẫu phân tích. Với các NP trong thương mại chỉ có 4- nonylphenol với nonyl- mạch nhánh đƣợc sử dụng. Với OP chỉ có 4-tert-octylphenol đƣợc sản xuất và sử dụng. Do đó đề tài lựa chọn 4-n-nonylphenol (với nonyl- mạch thẳng) làm nội chuẩn cho phân tích NP, OP.
+ Lựa chọn số khối các chất để định danh và định lượng:
Nguyên tắc chung của phương pháp khối phổ là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e. Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận thu đƣợc phổ khối lƣợng. Tùy thuộc vào cấu trúc phân tử của các chất mà hình thành các ion phân tử có cấu trúc khác nhau.
Với cấu trúc phân tử của 4-tert-octylphenol (khối lƣợng phân tử 220) có thể có các quá trình bắn phá nhƣ Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Cơ chế tạo thành phổ khối của OP
(CH ) C-CH - → [(CH3)3C-CH2-C(CH3)2-C6H4-OH]+ m/z = 206
Với cấu trúc phân tử của nonylphenol (khối lƣợng phân tử 220), do là hỗn hợp của nhiều đồng phân với sự phân nhánh của nhóm nonyl nên sự phân mảnh có thể xảy ra nhƣ Bảng 3.5.
Bảng 3.5: Cơ chế tạo phổ khối của NP
C9H19-C6H4-OH
→ [C9H19-C6H4-OH]+ m/z = 220
→ [C7H14-C6H4-OH]+ m/z = 191
→ [C6H12-C6H4-OH]+ m/z = 177
→ [C5H10-C6H4-OH]+ m/z = 163
→ [C4H8-C6H4-OH]+ m/z = 149
→ [C3H6-C6H4-OH]+ m/z = 135
→ [C2H4-C6H4-OH]+ m/z = 121
→ [CH2-C6H4-OH]+ m/z = 107
Với nội chuẩn n-nonylphenol (khối lƣợng phân tử 220) thì sự phân mảnh nhƣ Bảng 3.6.
Bảng 3.6: Cơ chế tạo phổ khối của n-NP
n-C9H19-C6H4-OH → [C9H19-C6H4-OH]+ m/z = 220
→ [CH2-C6H4-OH]+ m/z = 107
Các Hình 3.5; 3.6; 3.7 dưới đây là phổ khối khi bắn phá OP, NP, n-NP dưới điều kiện tối ƣu theo khuyến nghị của nhà sản xuất.
AP-2 #425 RT: 10.10 AV: 1 NL: 6.69E5 T: + c Full ms [50.00-400.00]
50 100 150 200 250 300 350 400
m/z 0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
Relative Abundance
135.05
106.99
206.06 91.03
77.03
189.03
147.11 234.91 249.95 280.71 311.79 343.27 393.20
Hình 3.5: Phổ MS của OP
50 100 150 200 250 300 350 400
m/z 0
50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100
Relative Abundance
0 50 100 0 50 100 0 50
100 121.03
162.95
107.05 219.98 251.78 348.08 391.60
135.00
107.07 147.10 220.07 250.03 317.74 362.54 134.98
106.96 149.00 219.94 280.73 346.56 374.22 121.00 149.11
191.06 220.09
91.02 302.67 330.21 375.07
135.06 121.01 162.88
91.07 220.42 252.15 324.41 396.67
149.01 107.04
162.89
219.77
90.92 250.98 338.72 371.28
135.06
106.90 163.12 219.88 251.80 312.68 366.99 149.01
107.03
95.13 206.90 265.38 317.02 384.07
NL: 5.74E3
AP-1ml-min#497 RT: 10.97 AV: 1 T: + c Full ms [50.00-400.00]
NL: 3.05E4
AP-1ml-min#507 RT: 11.09 AV: 1 T: + c Full ms [50.00-400.00]
NL: 2.54E4
AP-1ml-min#517 RT: 11.21 AV: 1 T: + c Full ms [50.00-400.00]
NL: 1.09E4
AP-1ml-min#523 RT: 11.28 AV: 1 T: + c Full ms [50.00-400.00]
NL: 7.62E3
AP-1ml-min#531 RT: 11.38 AV: 1 T: + c Full ms [50.00-400.00]
NL: 2.04E4
AP-1ml-min#538 RT: 11.46 AV: 1 T: + c Full ms [50.00-400.00]
NL: 5.22E4
AP-1ml-min#544 RT: 11.54 AV: 1 T: + c Full ms [50.00-400.00]
NL: 1.82E4
AP-1ml-min#551 RT: 11.62 AV: 1 T: + c Full ms [50.00-400.00]
Hình 3.6: Phổ MS của hỗn hợp NP
1-NP3 #624 RT:12.50 AV: 1 SB:41 12.52-12.71 , 12.20-12.47 NL:2.69E4 T: + c Full ms [50.00-400.00]
50 100 150 200 250 300 350 400
m/z 0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
Relative Abundance
107.06
220.01
76.84 207.02
130.92 149.86 252.03 281.54 329.13 354.14
Hình 3.7: Phổ MS của n-NP
Với phổ khối lƣợng của các chất mục tiêu nhƣ trên, đề tài tiến hành lựa chọn các ion đặc trƣng để định danh và định lƣợng của các hợp chất nhƣ ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7: Lựa chọn các ion để định danh và định lƣợng
Chất phân tích Mảnh đặc trƣng (m/z)
OP 135, 107, 206
NP 121, 135, 149, 163, 177, 191, 220, 107
n-NP 107, 220
Nhƣ vậy, với việc khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ƣu cho phân tích các AP trên GC-MS, kết quả thu đƣợc đƣợc trình bày ở Bảng 3.8.
Bảng 3.8: Các điều kiện tối ƣu trên GC-MS Cột tỏch DB-5MS, 30 m x 0,25 mm x 0,25 àm Nhiệt độ cổng bơm mẫu 250oC
Nhiệt độ MS 280oC
Tốc độ dòng He 1 ml/phút Thể tớch bơm mẫu 1 àl
Kiểu bơm mẫu Không chia dòng
Nội chuẩn cho định lƣợng n-NP Các ion định
danh, định lƣợng
OP 135, 107, 206
NP 121, 135, 149, 163, 177, 191, 220, 107 n-NP 107, 220
Chương trình nhiệt độ
80 oC trong 0,5 phút; 30 oC/phút đến 180 oC, giữ 2 phút; 10 oC/phút đến 200 oC, giữ 1 phút; 20 oC/phút đến 280 oC, giữ 5 phút