Trên cơ sở các điều kiện tối ƣu hóa trên các thiết bị GC-MS và HPLC-PAD, đề tài tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp với thực hiện xử lý mẫu như quy trình đã tối ƣu và phân tích trên cả 2 thiết bị là HPLC-PAD và GC-MS.
3.3.1 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp khi phân tích trên HPLC-PAD 3.3.1.1 Độ lặp lại của thiết bị
Với một hệ máy có độ nhạy cao thì sự ổn định và lặp lại đóng vai trò quan trọng
gồm cả độ lặp về tỷ lệ diện tích pic và thời gian lưu. Bảng 3.17 chỉ ra độ lặp lại của các điều kiện tối ưu đã chọn về diện tích pic và thời gian lưu. Dung dịch chuẩn để khảo sát độ lặp có nồng độ 10 ppm mỗi AP. Mỗi dung dịch đƣợc bơm 3 lần lên hệ thống để xác định độ lặp diện tích pic và thời gian lưu.
Bảng 3.17: Độ lặp lại trên thiết bị HPLC-PAD
OP NP
T (phút) S T (phút) S
Lần 1 11,20 1452185 14,42 976604
Lần 2 11,42 1492851 14,61 985512
Lần 3 11,35 1405672 14,55 961216
TB 11,3 1450.236,0 14,5 974444,0
S 0,1 43622,2 0,1 12291,2
% RSD 1,0 3,0 0,7 1,3
Nhận xét: RSD của thời gian lưu và diện tích pic đều nhỏ hơn 5%, cho thấy thiết bị có độ lặp lại tốt.
3.3.1.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Trong sắc ký, người ta thường dựa vào tín hiệu của pic sắc ký trên nhiễu nền (S/N) để xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng. Nếu pic sắc ký cho S/N xấp xỉ 3 đƣợc coi là giới hạn phát hiện và xấp xỉ 10 đƣợc coi là giới hạn định lƣợng.
Để xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng trên HPLC, chúng tôi tiến hành pha các dung dịch chuẩn chứa nồng độ của NP, OP với nồng độ lần lƣợt là 0,1; 0,2;
0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l, bơm lên HPLC và tiến hành xác định giá trị S/N nhƣ sau:
Bảng 3.18: Khảo sát tín hiệu trên nhiễu (S/N) trên HPLC
Nồng độ (mg/l) NP OP
0,1 1,3 1,5
0,2 2,1 2,4
0,5 3,1 3,8
1,0 6,8 8,5
1,5 9,3 12,4
2,0 15,6 20,8
Nhận xét: Kết quả phân tích cho thấy, giới hạn phát hiện trên thiết bị của NP, OP là 0,5 mg/l và giới hạn định lƣợng là 1,5 mg/l.
3.3.1.3 Đường chuẩn
Lập đường chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phương pháp phân tích. Từ đường chuẩn ta có thể biết được khoảng tuyến tính của chất phân tích. từ đó đƣa ra nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Các dung dịch dùng để dựng đường chuẩn được pha loãng đến 5 ml bằng ACN từ các dung dịch chuẩn làm việc.
Nồng độ các dung dịch này đƣợc thể hiện trong Bảng 3.19. Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên hệ sắc ký, diện tích pic sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.
Bảng 3.19: Các dung dịch dựng đường chuẩn Thể tích chuẩn làm
việc (100 mg/l) (àl)
Thể tích cuối cùng của ACN
Nồng độ OP (mg/l)
Nồng độ NP (mg/l)
Chuẩn 1 50 5 ml 1 1
Chuẩn 2 100 5 ml 2 2
Chuẩn 3 250 5 ml 5 5
Chuẩn 4 500 5 ml 10 10
Chuẩn 5 750 5 ml 15 15
Chuẩn 6 1000 5 ml 20 20
Bảng 3.20: Diện tích pic của các điểm chuẩn
Chuẩn Diện tích OP Diện tích NP
Chuẩn 1 198828 143375
Chuẩn 2 349061 222160
Chuẩn 3 770745 532372
Chuẩn 4 1452185 976604
Chuẩn 5 2185555 1461110
Chuẩn 6 2898041 1923240
OP
Y = 12053.7+148191*X R^2 = 0.9999 W: Equal
0 5 10 15 20
ppm 0
500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000
Area
Y = 15631.3+120650*X R^2 = 0.9997 W: EqualNP
0 5 10 15 20
ppm 0
500000 1000000 1500000 2000000 2500000
Area
Hình 3.8: Đường chuẩn của OP và NP Các phương trình đường chuẩn trên thiết bị thu được như sau:
Bảng 3.21: Phương trình đường chuẩn các AP trên HPLC
Các AP Phương trình đường chuẩn Hệ số R2
OP Y = 12053,7 + 148191X 0,9999
NP Y = 15631,3 + 120650X 0,9997
Nhận xét: Đường chuẩn của OP, NP có hệ số tương quan R2 lần lượt là 0,9999 và 0,9998. Đối với phương pháp sắc ký, thông thường R2≥0,995 là đạt yêu cầu. Kết quả cho thấy trong phạm vi dựng đường chuẩn NP, OP có tính tuyến tính cao.
3.3.1.4 Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL)
Trên cở sở giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của thiết bị, để xác định giới hạn định lượng của phương pháp, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên mẫu giả nhƣ trong mục 2.3.3, với lƣợng cỏc AP đƣợc thờm vào mẫu là 150 àl dung dịch chuẩn làm việc AP 500 mg/l và lƣợng cỏc APEO đƣợc thờm trờn mẫu là 100 àl dung dịch chuẩn là việc APEO 500 mg/l để kết quả đo đƣợc xấp xỉ LOQ. Tiến hành xử lý 7 lần và tính toán kết quả nhƣ trong 3.2.4. Tính toán giá trị trung bình của kết quả thu đƣợc.
Để khẳng định kết quả trung bình là giới hạn định lượng của phương pháp, theo ISO/TS 13530:2009, giới hạn định lượng của phương pháp (MQL).
MQL ≥ N xSxt 10
Ở độ tin cậy 95 %, số thí nghiệm N = 7, t = 2.44
Bảng 3.22: Giới hạn định lượng của phương pháp
Lần TN OP NP OPEO NPEO
mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg Lần 1 1,25 25,06 1,32 26,42 1,64 16,40 1,86 18,63 Lần 2 1,42 28,46 1,52 30,48 1,40 13,99 1,59 15,92 Lần 3 1,50 29,96 1,30 26,00 1,81 18,05 1,49 14,92 Lần 4 1,32 26,44 1,58 31,68 1,65 16,49 1,38 13,76 Lần 5 1,68 33,64 1,20 24,04 1,66 16,57 1,45 14,53 Lần 6 1,53 30,56 1,43 28,56 1,84 18,41 1,48 14,83 Lần 7 1,43 28,66 1,63 32,58 1,72 17,23 1,83 18,26
TB 28,97 28,54 16,73 15,84
S 2,81 3,19 1,44 1,90
N xSxt
10 25,97 29,50 13,35 17,52
MQL 29,0 29,5 16,7 17,5
3.3.1.5 Đánh giá độ chụm của phương pháp
Độ lặp:
Để đánh giá độ lặp của phương pháp, tiến hành chuẩn bị mẫu giả như trong mục 2.3.3 với hàm lƣợng NP, OP lần lƣợt là 50; 120 và 300 mg/kg; (cho 250; 600; 1500 àl dung dịch chuẩn làm việc AP (500mg/l) lên 2,5 g vải chuẩn) và mẫu giả có hàm lƣợng APEO là 25; 60; 150 mg/kg (cho 125; 300; 750 àl dung dịch chuẩn làm việc APEO 500 mg/l lên 2,5 g vải chuẩn) để đạt đƣợc nồng độ phân tích cho các AP, APEO phân tách thành AP đo trên thiết bị ở các dải làm việc của đường chuẩn và tiến hành xử lý nhƣ mẫu thật với 5 lần thí nghiệm. Tính toán giá trị trung bình của kết quả thu đƣợc (mg/kg) theo 3.2.4 từ kết quả theo đường chuẩn (mg/l). Kết quả được thể hiện trong các Bảng 3.23; 3.24 và 3.25.
Bảng 3.23: Độ lặp của phương pháp trên HPLC ở khoảng thấp
Lần TN OP NP OPEO NPEO
mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg Lần 1 2,332 46,64 2,394 47,88 2,099 20,99 2,338 23,38 Lần 2 2,451 49,02 2,369 47,38 2,082 20,82 2,118 21,18 Lần 3 2,376 47,52 2,356 47,12 2,021 20,21 2,214 22,14 Lần 4 2,360 47,20 2,440 48,80 2,228 22,28 2,078 20,78 Lần 5 2,490 49,80 2,569 51,38 1,949 19,49 2,027 20,27
TB 48,0 48,5 20,8 21,6
S 1,32 1,73 1,03 1,10
RSD (%) 2,8 3,6 5,0 5,1
Bảng 3.24: Độ lặp của phương pháp trên HPLC ở khoảng giữa
Lần TN OP NP OPEO NPEO
mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg Lần 1 5,798 115,96 5,936 118,72 4,809 48,09 4,755 47,55 Lần 2 5,890 117,80 6,079 121,58 4,957 49,57 5,087 50,87 Lần 3 5,816 116,32 6,180 123,60 4,776 47,76 5,091 50,91 Lần 4 5,993 119,86 5,697 113,94 4,819 48,19 4,786 47,86 Lần 5 6,007 120,14 5,807 116,14 5,007 50,07 5,025 50,25
TB 118,0 118,8 48,7 49,5
S 1,94 3,92 1,02 1,65
RSD (%) 1,6 3,3 2,1 3,3
Bảng 3.25: Độ lặp của phương pháp trên HPLC ở khoảng cao
Lần TN OP NP OPEO NPEO
mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg Lần 1 14,40 287,96 14,11 282,16 12,56 125,57 12,70 127,02 Lần 2 14,21 284,16 14,48 289,62 12,15 121,48 12,85 128,49 Lần 3 13,34 266,76 14,13 282,68 12,62 126,20 13,39 133,90 Lần 4 14,11 282,26 14,81 296,10 12,17 121,72 12,35 123,48 Lần 5 14,64 292,84 14,69 293,72 13,48 134,81 12,40 124,00
TB 282,8 288,9 126,0 127,4
S 9,83 6,32 5,40 3,76
RSD (%) 3,5 2,2 4,3 2,9
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối –RSD của phương pháp ở khoảng thấp trên HPLC là 2,8-5,1%; ở khoảng giữa là 1,6-3,3 %; ở khoảng cao là 2,5-4,3 %. Theo AOAC, ở cỡ nồng độ 10-5 (khoảng thấp), RSD ≤ 7,3 %; ở cỡ nồng độ 10-4 (khoảng giữa và khoảng cao), RSD ≤ 5,3 %. So với giá trị này, độ lặp của phương pháp đạt yêu
Độ lặp lại:
Để đánh giá độ lặp của phương pháp, tiến hành chuẩn bị mẫu giả như trong mục 2.3.3 với hàm lƣợng cỏc AP là 120 mg/kg (cho 600 àl dung dịch chuẩn làm việc AP (500 mg/l)lên 2,5 g vải chuẩn) và mẫu giả có hàm lƣợng các APEO là 60 mg/kg (cho 3000 àl dung dịch chuẩn làm việc APEO (500 mg/l) lờn 2,5 g vải chuẩn) và tiến hành xử lý nhƣ mẫu thật với 2 mẻ khác nhau, mỗi mẻ 5 lần thí nghiệm. Tính toán giá trị trung bình của kết quả thu được (mg/kg) theo 3.2.4 từ kết quả theo đường chuẩn (mg/l). Kết quả đƣợc thể hiện trong Bảng 3.26.
Bảng 3.26: Độ lặp lại của phương pháp trên HPLC
Lần TN OP (mg/kg) NP (mg/kg) OPEO (mg/kg) NPEO (mg/kg) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 1 Mẻ 2 Lần 1 115,96 118,90 118,72 116,56 48,09 49,99 47,55 50,74 Lần 2 117,80 115,90 121,58 121,12 49,57 48,66 50,87 48,61 Lần 3 116,32 117,74 123,60 118,12 47,76 47,05 50,91 47,39 Lần 4 119,86 116,30 113,94 114,40 48,19 49,30 47,86 51,67 Lần 5 120,14 117,66 116,14 108,78 50,07 50,84 50,25 49,89 TB 118,0 117,3 118,8 115,8 48,7 49,2 49,5 49,7
117,7 117,3 49,0 49,6
S 1,94 1,21 3,92 4,62 1,02 1,43 1,65 1,52
1,57 4,34 1,19 1,58
RSD (%) 1,6 1,0 3,3 4,0 2,1 2,9 3,3 3,1
1,3 3,7 2,4 3,2
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của từng mẻ thí nghiệm cho các chất là từ 1,0-4,0 % và giữa các mẻ thí nghiệm là 1,3-3,7%. Theo AOAC ở cỡ nồng độ 10-4, RSD ≤ 5,3 %. So với giá trị này, độ lặp của phương pháp đạt yêu cầu.
Tuy nhiên, độ lệch chuẩn tương đối chỉ cho biết sự gần nhau của các giá trị giữa 2 mẻ thực nghiệm mà không cho biết sự khác nhau giữa 2 mẻ có ý nghĩa thống kê hay không [2]. Để kiểm tra điều này, chúng tôi sử dụng chuẩn Student với
tthực nghiệm = N S S
X X
2 2 2 1
2 1
Nếu tthực nghiệm < ttra bảng thì sự sai khác giữa 2 mẻ thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê; nếu tthực nghiệm > ttra bảng thì sự sai khác giữa 2 mẻ thí nghiệm có ý nghĩa thống kê.
Bảng 3.27: Kiểm tra thống kê kết quả 2 mẻ thí nghiệm
OP NP OPEO NPEO
X1 118,0 118,8 48,7 49,5
S1 1,94 3,92 1,02 1,65
X2 117,3 115,8 49,2 49,7
S2 1,21 4,62 1,43 1,52
tthực nghiệm 0,20 0,33 0,19 0,06
Ở độ tin cậy 95 %, số thí nghiệm là 10, ttra bảng = 2,31. Nhƣ vậy, tthực_nghiệm <
ttra_bảng chứng tỏ sự sai khác giữa 2 mẻ thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê.
3.3.1.6 Đánh giá độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp phá mẫu là một trong những đại lượng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phương pháp. Độ đúng của phương pháp được đánh giá qua độ thu hồi ở 3 khoảng làm việc của đường chuẩn. Tiến hành thêm trên mẫu giả để có hàm lƣợng của NP, OP lần lƣợt là 50; 120 và 300 mg/kg; (cho 250; 600; 1500 àl dung dịch chuẩn làm việc AP (500mg/l) lên 2,5 g vải chuẩn) và mẫu giả có hàm lƣợng APEO là 25; 60; 150 mg/kg (cho 125; 300; 750 àl dung dịch chuẩn làm việc APEO 500 mg/l lên 2,5 g vải chuẩn) để đạt đƣợc nồng độ phân tích cho các AP, APEO phân tách thành AP đo trên thiết bị ở các dải làm việc của đường chuẩn và tiến hành xử lý như mẫu thật với 5 lần thí nghiệm. Tính toán hàm lƣợng trên mẫu (mg/kg) theo 3.2.4 từ kết quả theo đường chuẩn (mg/l). Chia giá trị tính được này cho hàm lượng thêm trên mẫu
Bảng 3.28: Độ đúng ở khoảng thấp trên HPLC
Lần TN OP NP OPEO NPEO
mg/kg % mg/kg % mg/kg % mg/kg %
Lần 1 46,64 93,3 47,88 95,8 20,99 84,0 23,38 93,5 Lần 2 49,02 98,0 47,38 94,8 20,82 83,3 21,18 84,7 Lần 3 47,52 95,0 47,12 94,2 20,21 80,8 22,14 88,6 Lần 4 47,20 94,4 48,80 97,6 22,28 89,1 20,78 83,1 Lần 5 49,80 99,6 51,38 102,8 19,49 78,0 20,27 81,1
TB 96,0 97,0 83,2 86,4
Bảng 3.29: Độ đúng ở khoảng giữa trên HPLC
Lần TN OP NP OPEO NPEO
mg/kg % mg/kg % mg/kg % mg/kg %
Lần 1 115,96 96,6 118,72 98,9 48,09 80,2 47,55 79,3 Lần 2 117,80 98,2 121,58 101,3 49,57 82,6 50,87 84,8 Lần 3 116,32 96,9 123,60 103,0 47,76 79,6 50,91 84,9 Lần 4 119,86 99,9 113,94 95,0 48,19 80,3 47,86 79,8 Lần 5 120,14 100,1 116,14 96,8 50,07 83,5 50,25 83,8
TB 98,3 99,0 81,2 82,5
Bảng 3.30: Độ đúng ở khoảng cao trên HPLC
Lần TN OP NP OPEO NPEO
mg/kg % mg/kg % mg/kg % mg/kg %
Lần 1 287,96 96,0 282,16 94,1 125,57 83,7 127,02 84,7 Lần 2 284,16 94,7 289,62 96,5 121,48 81,0 128,49 85,7 Lần 3 266,76 88,9 282,68 94,2 126,20 84,1 133,90 89,3 Lần 4 282,26 94,1 296,10 98,7 121,72 81,1 123,48 82,3 Lần 5 292,84 97,6 293,72 97,9 134,81 89,9 124,00 82,7
TB 94,3 96,3 84,0 84,9
Nhận xét: Độ thu hồi của OP, NP, OPEO, NPEO ở khoảng nồng độ thấp lần lƣợt là 96,0 %; 97,0 %; 82,3 %; 86,4%; ở khoảng nồng độ giữa lần lƣợt là 98,3 %; 99,0 %;
81,2 %; 82,5 %; ở khoảng nồng độ cao lần lƣợt là: 94,3 %; 96,3 %; 84,0 %; 84,9 %.
Theo AOAC, ở cỡ nồng độ 10-5 (khoảng thấp), độ đúng phải từ 80-110 %; ở cỡ nồng độ 10-4 (khoảng giữa và khoảng cao), độ đúng phải từ 90-107 %. So với kết quả thực nghiệm, độ đúng của NP, OP đạt yêu cầu của một phương pháp phân tích, độ đúng của NPEO, OPEO ở nồng độ giữa và cao chƣa đạt yêu cầu của phép phân tích.
Chúng tôi tiến hành đánh giá độ thu hồi của phương pháp với NPEO và OPEO xem có mắc sai số hệ thống không. Nếu phương pháp không mắc sai số hệ thống, kết quả phân tích không đạt yêu cầu, nếu phương pháp mắc sai số hệ thống thì sử dụng giá trị hiệu chỉnh trong tính toán kết quả phân tích cho NPEO và OPEO.
Để kiểm tra điều này. sử dụng chuẩn Student với độ tin cậy 95 %. Nếu
tthực_nghiệm > ttra bảng thì kết quả phải đƣợc hiệu chỉnh với hệ số thu hồi; nếu tthực nghiệm ≤ ttra_bảng thì phương pháp mắc sai số ngẫu nhiên. Với tthực nghiệm được tính như
sau:
tthực nghiệm = S
R| 100
|
x N
R là độ thu hồi trung bình, S là độ lệch chuẩn, N là số thí nghiệm. Kết quả đƣợc thể hiện trong Bảng 3.31.
Bảng 3.31: Đánh giá tính có nghĩa của hệ số thu hồi
OPEO (%) NPEO (%)
Khoảng thấp
R 83,2 86,4
S 4,1 4,9
tthực nghiệm 9,1 6,2
Khoảng giữa
R 81,2 82,5
S 1,7 2,8
tthực nghiệm 24,6 14,2
R 84,0 84,9
Ở độ tin cậy 95%, số thí nghiệm là 5 ttra bảng = 2,77. Nhƣ vậy tthực nghiệm đề lớn hơn ttra bảng nên phương pháp mắc sai số hệ thống, cần hiệu chỉnh kết quả bằng cách chia cho hệ số thu hồi.
Khi đó, hàm lƣợng của các APEO đƣợc tính theo công thức sau:
CAPEO =
R m
C C
10
100 50 5 ) 1 2 3 (
Trong đó, R là độ thu hồi của mẫu kiểm soát (QC) thử nghiệm cùng mẻ với mẫu, thính theo %.
3.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp khi phân tích trên GC-MS 3.3.2.1 Độ lặp của thiết bị
Để đánh giá độ lặp lại của thết bị GC-MS, tiến hành pha dung dịch chuẩn có nồng độ 10 ppm cho mỗi AP và nồng độ nội chuẩn 1 mg/l. Mỗi dung dịch đƣợc bơm 3 lên GC-MS để xác định độ lặp tỷ lệ diện tích pic giữa chất chuẩn và nội chuẩn cùng thời gian lưu.
Bảng 3.32: Độ lặp lại của thiết bị GC-MS
Nội chuẩn OP NP
T (phút)
Diện tích
T (phút)
Diện tích
Tỷ lệ diện tích
T (phút)
Diện tích
Tỷ lệ diện
tích Lần 1 12,38 96617 9,99 164500 19,18 10,79-
11,56 142125 14,78 Lần 2 12,38 3750 10,01 97094 20,44 10,79-
11,55 52018 15,16 Lần 3 12,37 5288 10,00 109483 20,70 10,80-
11,59 74395 14,07
TB 12,38 10,00 20,11 10,79-
11,57 14,67
%
RSD 0,05 0,10 4,04 0,05-
0,2 3,78
Nhận xét: % RSD của các diện tích pic và thời gian lưu của các lần lặp lại đều dưới 5%. Vì vậy, kết luận được hệ sắc ký đã chọn có độ lặp lại tốt, phù hợp phép phân tích. Hình 3.3-2 thể hiện sắc đồ khảo sát độ lặp lại trên hệ GC-MS.
RT: 6.01 - 17.72
8 10 12 14 16
Time (min) 20
40 60 80 100 20 40 60 80 100
Relative Abundance
20 40 60 80
100 9.99
11.00 11.08 12.38
6.11 6.92 9.35 9.81 12.58 14.97 16.22 17.61
10.01
11.00
11.08 12.38
6.54 7.35 7.96 9.81 13.38 14.75 15.89 17.14
10.00
10.95 11.00 12.37
6.52 7.01 7.75 8.51 9.75 12.85 15.34 16.04 16.76
NL:
7.29E4 TIC MS Ngay-1
NL:
3.95E4 TIC MS ngay2
NL:
4.57E4 TIC MS ngay3
Hình 3.9: Độ lặp lại của thiết bị GC-MS
3.3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Khảo sát giới hạn phát hiện của thiết bị bằng việc xác định tín hiệu trên nhiễu của pic của các AP. Tại nồng độ cho tín hiệu trên nhiễu (S/N) ~ 3 đƣợc xác định là giới hạn phát hiện của thiết bị. Do sự khác nhau về dạng pic (OP là pic đơn, NP là pic đa) nên S/N của OP và NP đƣợc xác định khác nhau. S/N của OP đƣợc xác định theo cách theo chiều cao của pic sắc ký so với chiều cao của nền. S/N của NP đƣợc xác định theo
O P
O P
O P
NP
N P
N P
Bảng 3.33: Khảo sát tín hiệu trên nhiễu (S/N) trên GC-MS
Nồng độ (mg/l) OP NP
0,01 0,7 /
0,02 1,6 0,6
0,05 3,1 1,4
0,10 4,8 2,6
0,25 10,5 7,1
0,5 20,8 12,8
1,0 46,2 20,6
Nhận xét: Giới hạn phát hiện của OP, NP trên GC-MS là 0,05 và 0,1 mg/l; Giới hạn định lƣợng là 0,25 và 0,5 mg/l.
3.3.2.3 Đường chuẩn
Pha các dung dịch dùng để dựng đường chuẩn trong 5 ml n-hexan từ các dung dịch chuẩn làm việc. Nồng độ các dung dịch này đƣợc thể hiện trong Bảng 3.34. Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên hệ sắc ký, tỷ lệ diện tích pic so với nội chuẩn sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.
Bảng 3.34: Các dung dịch dựng đường chuẩn Chuẩn làm việc
50 mg/l OP và 100 mg/l NP (àl)
Nội chuẩn
(àl)
Định mức với n-hexan
Nồng độ OP (mg/l)
Nồng độ NP (mg/l)
Chuẩn 1 25 100 5 ml 0,25 0,5
Chuẩn 2 50 100 5 ml 0,5 1,0
Chuẩn 3 100 100 5 ml 1,0 2,0
Chuẩn 4 200 100 5 ml 2,0 4,0
Chuẩn 5 500 100 5 ml 5,0 10,0
Chuẩn 6 1000 100 5 ml 10,0 20,0
Bảng 3.35: Diện tích pic trên cho các điểm chuẩn
Dung dịch chuẩn
Diện tích nội chuẩn
OP NP
Diện tích Tỷ lệ so với
nội chuẩn Diện tích Tỷ lệ so với nội chuẩn
Chuẩn 1 11814 2102 0,18 8913 0,75
Chuẩn 2 9375 4579 0,49 13662 1,46
Chuẩn 3 27131 37738 1,39 100187 3,69
Chuẩn 4 8172 35425 4,33 62909 7,70
Chuẩn 5 7552 104521 13,84 152129 20,14
Chuẩn 6 10488 303496 28,94 426843 40,70
OP
Y = -0.597246+2.90987*X R^2 = 0.9999 W: Equal
0 2 4 6 8 10
ppm 0
5 10 15 20 25 30
Area Ratio
NP
Y = -0.173613+2.04465*X R^2 = 0.9996 W: Equal
0 5 10 15 20
ppm 0
10 20 30 40
Area Ratio
Hình 3.10: Đường chuẩn của NP, OP trên GC-MS
Phương trình đường chuẩn của OP, NP trên GC-MS và hệ số tương quan được thể hiện trong Bảng 3.36.
Bảng 3.36: Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan của các AP trên GC- MS
Các AP Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan R2
OP Y = -0,597 + 2,91X 0,9999
NP Y = -0,174 + 2,045X 0,9996
Nhận xét: Đường chuẩn của OP, NP có hệ số tương quan R2 lần lượt là 0,9999 và 0,9996. Đối với phương pháp sắc ký, thông thường R2≥0,995 là đạt yêu cầu. Kết quả cho thấy trong phạm vi dựng đường chuẩn NP, OP có tính tuyến tính cao.
3.3.2.4 Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL)
Trên cở sở giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của thiết bị, để xác định giới hạn định lượng của phương pháp, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên mẫu giả nhƣ trong mục 2.3.3, với lƣợng các AP đƣợc thêm vào mẫu là 125 ml dung dịch chuẩn làm việc AP (50 mg/l OP và 100 mg/l NP) và lƣợng các APEO đƣợc thêm trên mẫu là 150 ml dung dịch chuẩn làm việc APEO (50 mg/l OPEO và 100 mg/l NPEO) để kết quả đo đƣợc xấp xỉ LOQ. Tiến hành xử lý 7 lần và tính toán kết quả nhƣ trong 3.2.4. Để khẳng định kết quả trung bình là giới hạn định lượng của phương pháp, theo ISO/TS 13530:2009, giới hạn định lượng của phương pháp (MQL) phải:
MQL ≥ N xSxt 10
Ở độ tin cậy 95 %, số thí nghiệm N = 7, t = 2,44 Kết quả giới hạn định lượng của phương pháp như sau:
Bảng 3.37: Giới hạn định lượng của phương pháp trên GC-MS Lần
TN
OP NP OPEO NPEO
mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg Lần 1 0,26 2,63 0,48 4,80 0,32 3,23 0,55 5,53 Lần 2 0,26 2,55 0,53 5,25 0,23 2,30 0,47 4,65 Lần 3 0,27 2,68 0,48 4,80 0,23 2,26 0,61 6,05 Lần 4 0,26 2,58 0,51 5,13 0,24 2,38 0,56 5,63 Lần 5 0,24 2,38 0,46 4,58 0,25 2,46 0,58 5,78 Lần 6 0,21 2,13 0,50 5,03 0,19 1,90 0,50 5,03 Lần 7 0,22 2,24 0,48 4,76 0,32 3,15 0,65 6,54
TB 2,47 4,91 2,54 5,61
S 0,22 0,24 0,47 0,62
N xSxt
10 2,0 2,21 4,39 5,74
MQL 2,5 4,9 4,4 5,7
Nhận xét: Giới hạn định lượng của phương pháp với OP, NP, OPEO, NPEO lần lƣợt là 2,5; 4,9; 5,0; 6,6 mg/kg. Giới hạn này là hoàn toàn phù hợp để xác định tính hợp chuẩn của sản phẩm dệt may.
3.3.2.5 Đánh giá độ chụm của phương pháp
Độ lặp:
Để đánh giá độ lặp của phương pháp, tiến hành chuẩn bị mẫu giả như trong mục 2.3.3 với hàm lƣợng OP lần lƣợt là 20; 50 và 100 mg/kg; NP lần lƣợt là 40; 100 và 200 mg/kg (cho 100; 250; 500 àl dung dịch chuẩn làm việc AP (500 mg/l với OP và 1000 mg/l với NP) lên 2,5 g vải chuẩn) và mẫu giả có hàm lƣợng OPEO là 20; 50; 100 mg/kg; NPEO là 40; 100; 200 mg/kg (cho 100; 250; 500 àl dung dịch chuẩn làm việc APEO (500 mg/l với OPEO và 1000 mg/l với NPEO) lên 2,5 g vải chuẩn) để đạt đƣợc nồng độ phân tích cho các AP, APEO phân tách thành AP đo trên thiết bị ở các dải làm việc của đường chuẩn và tiến hành xử lý như mẫu thật với 5 lần thí nghiệm. Tính toán giá trị trung bình của kết quả thu được (mg/kg) theo 3.2.4 từ kết quả theo đường chuẩn (mg/l). Kết quả đƣợc thể hiện trong các Bảng 3.38; 3.39; 3.40.
Bảng 3.38: Độ lặp của phương pháp ở khoảng thấp trên GC-MS
Lần TN OP NP OPEO NPEO
mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg mg/l mg/kg Lần 1 1,96 19,64 3,39 33,94 1,64 16,42 3,92 39,21 Lần 2 1,93 19,25 3,95 39,46 1,69 16,90 3,34 33,35 Lần 3 1,93 19,29 3,90 39,02 1,77 17,74 3,43 34,28 Lần 4 1,89 18,87 3,87 38,68 1,55 15,51 3,59 35,89 Lần 5 1,88 18,76 3,88 38,78 1,69 16,92 3,40 34,01
TB 19,16 37,98 16,70 35,35