XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT
8. Sắc kí khí - phổ hồng ngoại (Gc - IR/S) [36]
8.1. Nguyên tắc của phương pháp
Việc sử dụng các kĩ th u ậ t sắc kí cho hỗn hợp cần tách là lợi khí phân tích quan trọng. Các cấu tử cần tách được phân loại bằng thời gian lưu giữ của chúng, nhưng những kĩ th u ật khác có thể sử dụng để hỗ trợ cho việc nhận biết. Phép đo phố hồng ngoại (IR/S) có k h ả năng tìm được các nhóm chức nào đã có mặt trong các cấu tử cần tách.
536
8.2. Thiết b ị
Tổ hợp sắc kí khí với phép đo phổ hồng ngoại bao gồm cả việc cho qua các dung dịch trong luồng khí m ang xuyên qua tế bào (lỗ nhỏ). Khí hồng ngoại được nung nóng được đ ặ t trong phổ kế biến đổi Fourier quét nhanh.
8 .3 Ể ứng dụng
Phép đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier — sắc kí khí được sử dụng trong phép phân tích các vật liệu sinh học như các hương liệu, để xác định các tỉ lệ và bản chất cấu tử, phân tích các dung môi nhằm xác định độ sạch và th àn h phần của chúng và để xác định các sản phẩm có được khi các chất chịu sự phân huỷ bằng nhiệt.
Trong phần này các kiến thức có liên quan là: sắc kí khí (các nguyên tắc và th iết bị, các phương pháp sắc kí và ứng dụng), phép đo phổ hồng ngoại và phổ Raman, các nguyên tắc và th iết bị ứng dụng phép đo phổ hồng ngoại và phổ Raman.
8.4. Các nguyên tắc
Kĩ th u ậ t sắc kí đã được ứng dụng để tách các hỗn hợp nhiều cấu tử. Tuy nhiên, việc n h ận dạng các phần tách ra bởi thời gian ghi n h ậ n nó riêng lẻ thường không được rõ ràng. Phép đo phổ hồng ngoại là rấ t hữu hiệu và là kĩ th u ậ t linh hoạt (đa năng) để n h ận dạng các nhóm chức. N hững th iết bị mới có sử dụng biến đổi Fourier được vi tính hoá tạo ra các thông báo đặc biệt đã được tổ hợp sẵn với các sắc kí đồ sử dụng các vạch chuyển hoá nhiệt và tế bào khí, làm cho sự ghi n h ận nhanh và nhận biết được các hợp chất còn chưa biết dễ dàng hơn.
8 .5 ề Thiết b ị
Việc chọn sắc k í k h í đòi hỏi m ột yêu cầu là: Các cấu tử cần p h ả i b ay hơi đ ủ để cho q u a cột sắc k í và có sự kh ác nhau rõ tro n g các tín h c h ấ t để p h â n giải được bởi p h a tĩn h . Trong trư ờ n g hợp đơn g iản , p h ải có sự k h ác n h a u một vài độ trong điểm sôi đ ủ là m được sự tách. T ấ t cả các v ấn đề n h ư nhiều cột các p h a tĩn h , các c h ấ t k h í và chương tr ìn h hoá n h iệ t độ được mô tả tro n g sắc k í k h í đều có th ể được đáp ứng cho việc sử d ụ n g với Gc — FT/IR.
Việc lự a chọn cột là r ấ t quan trọng. Độ n h ạy lớn của các hệ FT/IR và n h ữ n g sự cải tiến trong sự ghi n h ậ n cho phép sử dụng các cột m ao q u ản ; chúng tạo ra các pic nhọn.
Thường d ù n g cột silica có chiều dài là 30m, đường kính chảy ra 0,3m m được tẩ m bằng một lớp p h a tĩn h có bề dày ] (im.
P ha tĩn h không phân cực (ví dụ silicon), tách được các hợp chất chủ vếu p h ù hợp với các điểm sôi của chúng là đặc biệt bổ ích.
Vì lò sắc k í k h í thường được lập trìn h cho các n h iệt độ khá cao, có khi đến 400°c, cần p hải làm sao cho p h a tĩn h phải bền và không “chảy m áu ” vào detector hoặc phổ kế. Các cột ở đó pha tĩn h được liên k ế t hoá học với th à n h cột sẽ làm giảm thiểu các v ấn để rắc rối.
P hép đo phổ hồng ngoại thường được tiến h à n h ở áp suất k h í quyển k h ác h ẳ n với phép đo phổ khôi lượng (ở áp su ất rất th ấ p , cỡ 1 0 -6 — 10-7mmHg). Đ iều này cho phép chuyển trực tiếp các cấu tử tá c h r a giữa sắc kí k hí đồ và phổ k ế IR qua một ống n h iệ t đơn g iản n h ư một bê m ặt chung (phân giới). Điểu này được chỉ ra sơ đồ trê n h ìn h 17.1.
538
M áy sắc kí khí
Các detector sắc kí k h í n h ư d etecto r ion hoá ngọn lửa (FID) rấ t nhạy. Ngược lại, phổ k ế hồng ngoại có độ nhạy th ấ p hơn nhiều. Dòng khí vì vậy thư ờng tác h ra ở trê n lối ra của cột sao cho g ần 90% đi đến phổ k ế và chỉ có 10% đi đến FID. P h ầ n cơ bản được tru v ề n q u a bề m ặ t ch ung thư ờng là một ông n h iệ t ngắn, thư ờng ỏ bộ p h ậ n trơ của mao q u ả n sắc kí k hí vào phổ k ế FT/IR. Để n h ậ n được th ô n g tin cực đ ại th ì cần p hải làm được hai điều: Hoặc là m ẫu cần p h ả i được cô đặc b ằn g cách đông tụ vào m ặ t bề m ặ t lạnh: hoặc b ằn g sự h ấp th ụ vào m ột ch ấ t rắ n h o ạt động, hoặc n ếu m ẫu v ẫ n còn là k h í th ì cần được vào m ột bình có th ể tích nhỏ hoặc m ột ông d ẫ n sáng, nó cho bước sóng dài để làm tối th iể u sự h ấp th ụ của bức xạ IR.
c ả 2 cách n ày đều có những ưu điểm riêng. M ẫu đã được đông tụ cho phổ thường n h ậ n được bởi sự lấy m ẫu IR theo quy đ ịn h (lớp mỏng, lớp ép KBr, m àng mỏng). Phô p h a hơi sẽ có sự khác n h a u rõ hơn vì rằ n g sự tương tác giữa các p h ân tử ít hơn.
đặc b iệt là liên k ế t hiđro có th ể xảy ra. Tuy nhiên, m ẫu hơi có sẵ n và chuyển động n h a n h từ bình và th ậm chí có thé được thu lại cho việc ng h iên cứu tiếp theo.
8.6. ứ n g d ụ n g
Sắc k í k h í đồ (chrom otogram ) n h ậ n được từ vài microlit của hỗn hợp gồm 12 cấu tử được chỉ ra ở h ìn h 17.2.
Hinh 17.2. sắc kí khí đồ của một hỗn hđp chưa biết gồm 12 câu tử [36]
C ũng n h ư phổ hồng ngoại n h ậ n được bằng phương pháp ch u ẩ n bị m ẫu n h ư quy định, các dải h ấp th ụ IR p h ù hợp với các tầ n sô* dao động đặc trư n g của nhóm chức riêng. P hổ pha hơi k hông cho th ấ y các hiệu ứng tạo liên k ế t hiđro mạnh như sự mở rộng của pic kéo dài —OH ở gần V = 3600cm-1.
540
cm-1
Hình 17.3. Phổ IR của pic 1
Pic 1 tương ứng có ít hơn 1% của mẫu chung (hình 17.3), cho ta các vân phổ cỡ tầ n số nhóm đặc trư n g đối với:
(i) vân hiđroxyl tự do ở 3600cm -1, chỉ ra có rượu.
(ii) v ân C -H b éo ở 2 9 0 0 — 3 0 0 c n r \ giả th iế t có các hợp ch ất béo.
(iii) vân C - 0 ở gần 1050cm-1 xác n h ậ n có rượu.
Máy tín h cho b iết rằ n g hợp c h ấ t này là 2—m etyl propanol (isobutanol).
Hỗn hợp của các este có th ể được đặc trư n g bằng sự cho thấy b ăn g h ấp th ụ có liên q u a n đến pic - C O - ở gần 1700cm-1 và hỗn hợp của các hợp c h ấ t thơm được chọn ghi n h ậ n bởi các pic rộng - C H - ở gần ngay ở 3000cm -1. Bằng cách xâv dựng sự p h ụ thuộc của v ân hấp th ụ của pic riên g trong phô hoặc tích p h â n của vân ch ung IR trê n cả khoảng, th ì sắc kí khí IR có th ể n h ậ n được, nó chỉ ra mỗi cấu tử có độ n h ạy phổ IR bao nhiêu.
Ví dụ, một m ẫu cây h ú n g q u ế làm thuốc được chiết b ằn g dung môi. Dịch chiết sa u đó được tiêm vào phô kê GC, có cột mao q u ản dài õOm vói lớp p h ủ m etyl silico n được duy trì ở 40°c.
sá c kí khí đồ cho th ấ y có 7 pic cơ b ản và hơn 20 pic phụ. Mỗi một pic chính cho ta một phổ IR rõ, chúng được xác n h ậ n là eucalyptol. estragol. eugenol và linalool cộng với các te rp e n và c in n am at khác n h au . N hiều cấu tử chính cũng đã được xác định. P hép đo sắc kí k h í - phổ khôi lượng (GC - MS) xem ở [36].
9.1. Nguyên tắc của phương pháp
Các cấu tử của hỗn hợp sau k hi được tách b ằn g sắc kí lỏng (Lc) có th ể được n h ậ n biết và xác định định lượng b ằn g phép đo phổ khối lượng (MS).
9.2. Thiết b ị
Việc di chuyển của p h a lỏng động k hi cho các chất phân tích chuyển đến phổ k ế khôi lượng có gặp nhữ ng khó k h ă n và sự sắp xếp bề m ặ t ch u n g là giới hạn.
9.3. ứng dụng
Phép p h ân tích các hỗn hợp dược phẩm và chất thuốc thì sự n h ậ n biết các phương thức giảm chất lượng bằng cách sử dụng đồng vị được đ án h dấu và tách, phân tích các peptit có sử dụng các phương pháp ion hoá mềm là đặc trư ng của ứng dụng Lc - MS.
Trong p h ầ n này có các lĩnh vực kiên thức có liên quan là sắc kí lỏng cao áp (mô hình, phương pháp và ứng dụng) và phép đo phổ khôi lượng.
9.4. Các nguyên tác
P h ạm vi rộng lớn của các k iểu sắc kí lỏng rấ t có giá trị và việc tách có th ể đ ạ t được b ằn g các phương pháp đã mô tả trong mục p h â n tích sắc kí. Vì rằ n g n h ữ n g pha động lỏng có khi có chứa các m uôi vô cơ nên vấn đề khó k h ă n n h ấ t là làm th ế nào để chuyển được cấu tử cần tách của c h ấ t p h ân tích đến phổ kế khối lượng m à không có sự cản trở của dung môi.
Các v ậ t liệu có khôi lượng p h â n tử tương đôi cao đã được tách ra b ằ n g sắc kí lỏng và do đó các phương pháp lon hoá tạo ra sự p h â n m ản h ít hơn trong phổ k ế khôi lượng còn p h ải được sử dụng.