PHẦN III.NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. P HƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. Phương pháp phân tích các thành phần hóa học
3.3.2.3. Phương pháp phân tích axit amin
a. Xác định axit amin tổng số
Sử dụng phương pháp (B.P.Pleshkov. 1968) [15].
* Nguyên lý: Dùng phản ứng màu của dung dịch ninhydrin tác dụng với axit amin trong lá chè.
Phản ứng:
Ninhydrin + axit amin Sản phẩm trung gian Hợp chất màu tím Dixetooxyhidrinden (không có nitơ + NH3)
Hợp chất màu tím do:
Ninhydrin + Dixetooxyhidrinden (không có nitơ) + hợp chất nitơ (NH3) enol (0,1ml)
* Dụng cụ, hóa chất:
- Hóa chất:
+ Cồn etylic 50%
+ Axit axetic
+ Ninhydrin (pha 3g trong 100mlcồn etylic 960 sau đó thêm 4 gam axit axetic lắc mạnh cho tan
+ Axit glutamic tinh khiết - Dụng cụ:
+ Máy so màu Coorning hoặc ERMA + Nồi đun cách thủy + Bình cầu đáy bằng cao cổ dung tích 50ml + Máy lắc
+ Ống nghiệm có nắp đậy hoặc lọc có nút + Bình định mức 40ml
Tăng Thị Phụng CHTP 07-09 51 + Pipet, micropipet + Phễu lọc chân không + Giấy sắc ký loại What-man
* Phương pháp tiến hành:
Cân 1gam chè khô đã nghiền nhỏ qua sàng 0,5mm cho vào bình dung tích 50ml. Rót nước đun sôi khoảng 40ml. Đặt bình trong nồi đun cách thủy trong thời gian 1giờ. Lấy bình ra để nguội, lọc qua phễu lọc có hút chân không. Lấy dung dịch chè trong suốt cho vào bình định mức, thêm nước cất đến vạch 50ml.
Dùng micropipet lấy 0,5ml chấm lên giấy sắc ký loại chậm. Chấm mẫu theo một đường xoáy chôn ốc. Để khô và nhuộm màu bằng cách phun dung dịch ninhydrin 0,2%. Để khô sẽ xuất hiện các vệt axit amin màu xanh tím.
Sau khi phun, để khô, cắt nhỏ các vệt axit min rồi ngâm trong rượu 50%. Đặt ống nghiệm vào máy lắc 15 phút để tách hết axit amin ra. Sau đó lọc dịch và rót vào cuvet 1cm đo ở bước sóng 580 (tương đương với kính lọc màu xanh).
Làm mẫu đối chứng ta lấy mảnh giấy sắc ký trắng cắt thành từng mảnh cho vào ống nghiệm bổ sung 5ml cồn etylic pha loãng 50% có nút hoặc nắp đậy. Thao tác giống như mẫu nghiên cứu. Sau khi đo được mật độ quang học mẫu nghiên cứu là E1 so với hoạt độ quang học của mẫu tiêu chuẩn là 1mg/l- 20mg/l chấm trên giấy sắc ký và các thao tác tiến hành giống như mẫu nghiên cứu. Từ đó xây dựng đồ thị chuẩn của axit glutamic với nồng độ hoạt động quang học của nó tính theo hàm số y= a.x+b. Lập thành bảng tính sẵn để tra nồng độ axit glutamic chuẩn.
Cách tính hàm lượng axit amin:
Sau khi đã đo được E1 của mẫu nghiên cứu và E2 của mẫu tiêu chuẩn ta tính hàm lượng axit amin theo % chất khô với công thức sau đây:
X = γ × E1 × V2 × V E2 × V1 × G
Tăng Thị Phụng CHTP 07-09 52 Trong đó:
- γ: Nồng độ axit glutamic tiêu chuẩn (mg/ml) - E1: Độ hoạt động quang học của mẫu nghiên cứu - E2: Độ hoạt động quang học của mẫu tiêu chuẩn - V1: Số ml dung dịch chè xanh chấm trên giấy sắc ký - V2: Số ml dung dịch axit amin chiết được
- V: Số ml dung dịch chè toàn bộ đã pha - G: Khối lượng khô của mẫu (mg) b. Phân tích axit amin thành phần:
Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
* Dụng cụ, hóa chất:
- Hóa chất:
+ Sử dụng 2 loại dung môi: A (1,36 gam Natriaxetat trinitrat + 500ml nước + 90àl trietylamin, pH=7,2 + 1,5ml trihydrofura) và B (1,36 gam Natriaxetat trinitrat + 100ml nước , pH=7,2 + 200ml metanol+200ml axetolnitril)
+ Chất ổn định pH là Borat pH=10,2
+ Sử dụng 2 dẫn xuất: OPA (O-Phthal aldehyde) và FMOC (3mercaptopropionic)
- Dụng cụ:
Máy Agilent 110 Serries HPLC của hãng Aligent Technologies
* Phương pháp tiến hành:
- Xử lý mẫu: Cân 0,5 gam chè khô đã nghiền nhỏ qua sàng 0,5mm cho vào bình dung tích 50ml. Rót 40ml nước đun sôi. Đặt bình trong nồi đun cách thủy trong thời gian 30 phút. Lấy bình ra để nguội, lọc qua phễu lọc có hút chân không được dung dịch chè trong. Dung dịch chè trong định mức bằng
Tăng Thị Phụng CHTP 07-09 53 nước cất lên 50ml. Lấy dịch phân tích đưa đi ly tâm ta được mẫu đông khô.
Mẫu đụng khụ được bổ sung 1àl nước cất và bơm vào hệ thống HPLC.
- Chế độ chạy HPLC:
+ Chạy 2 dẫn xuất trước cột là OPA.Reagent và FMOC.Reagent (O- Phtal aldehyde và 3mercaptopropionic) 10mg/ml.
+ Bơm 1àl dịch mẫu vào HPLC. Hệ thống chạy với tốc độ dũng 0,45ml/phút, chạy với gradient nồng độ đi từ 100% A đến 100% B trong vòng 18 phút. Detecto sử dụng loại MWD1A với bước sóng λ=338nm.
- Kết quả:
Trong đó:
- X: hàm lượng axit amin (%)
- A (Amount): Nồng độ sau khi so với chất chuẩn (ng/àl) - M: Khối lượng phân tử của axit amin
- m: Khối lượng mẫu (g) - 1,6: Hệ số pha loãng