PHẦN III.NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. P HƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. Phương pháp phân tích các thành phần hóa học
3.3.2.4. Phương pháp phân tích hàm lượng đường khử
* Nguyên lý: Đường trực tiếp khử oxi của hydroxit đồng ở môi trường kiềm mạnh làm nó bị kết tủa dưới dạng Cu2O có màu đỏ gạch. Lượng Cu2O tương ứng với số lượng đường khử oxi.
* Hóa chất, dụng cụ:
- Hóa chất:
+ Pheling 1 (dung ịch CuSO4) + Pheling 2 (Kalinatritatrat, NaOH) + Dung dịch Fe2(SO4)3, + KMnO4 0,1; 0,01N
X (%) A×M×1,6×100 m×10-9
=
Tăng Thị Phụng CHTP 07-09 54 + Phenolphtalein 1% trong cồn 900 + Pb(CH3COO)2 30%
+ Giấy lọc + Sợi Amiang
+ CuSO4.5H2O 4%
- Dụng cụ:
+ Máy hút chân không + Phễu lọc thủy tinh
+ Bình tam giác 100, 250ml + Ống đong hình trụ 250ml + Nhiệt kế 1000C + Bếp đun cách thủy, bếp điện + Lưới Amiăng + Bình lọc hút chân không + Pipet 5ml, 10ml + Buret 10ml
* Tiến hành:
- Xử lý mẫu: cân 1gam mẫu chè khô đã nghiền nhỏ vào bình định mức dung tích 100ml. Bổ sung 80ml nước sôi trong 1giờ. Lấy ra để nguội bổ sung nước cất đến vạch. Tiến hành lọc, cho dịch chè qua phễu lọc hút chân không. Dung dịch được rót vào ống đong hình trụ, thêm từng giọt Pb(CH3COO)2 (4-5ml).
Để loại bỏ Pb(CH3COO)2 còn dư ta thêm từng giọt Na2SO4 bão hòa. Lọc qua giấy lọc dung dịch vào bình định mức 100ml, bổ sung nước cất đến vạch.
- Để xác định đường khử ta lấy 10ml dung dịch lọc của chè đã được xử lý sang bình tam giác 100ml. Bổ sung 10ml dung dịch pheling 1, 10ml dung dịch pheling 2 đạt trên bếp điện có lớp tấm amiăng đun sôi 3 phút (từ khi bắt đầu sôi). Cho dịch lọc qua phễu lọc, Cu2O nằm lại trong phễu. Rửa kết tủa 1- 2lần bằng nước sôi. Hòa tan kết tủa bằng 5ml Fe2(SO4)3, tráng rửa phễu bằng nước nóng. Đun dung dịch trong bình tam giác đến 70-800C. Chuẩn độ bằng KMnO40,01N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt không bền trong 30giây. Cứ 1ml KMnO4 0,01N tương ứng 0,636mg Cu+ và 0,1mg đường glucose tương ứng 0,205mg Cu+ do đó 0,1mg dung dịch KMnO4 0,01N tương ứng với:
Tăng Thị Phụng CHTP 07-09 55 Kết quả tính theo công thức sau:
Trong đó:
- X: Hàm lượng đường khử tính theo % chất khô - v: Số ml dung dịch đem phân tích
- V: Số ml dung dịch chè đã pha
- C: Khối lượng đường tra bảng theo số ml dung dịch KMnO4 0,01N 3.3.2.5. Phương pháp phân tích hoạt tính của enzyme
(Theo phương pháp U.V.Margia 1964) [15]
* Nguyên lý:
Khi tác dụng một lượng axit ascorbic với pirocatechin dưới sự có mặt của men PPO thì phản ứng sẽ xảy ra trước hết tạo thành octoquinon. Sau đó octoquinon là chất oxi hóa mạnh tác dụng với axit ascorbic. Căn cứ vào lượng axit ascorbic tiêu tốn để tham gia phản ứng sẽ tính được họat tính của men theo phản ứng sau:
* Dụng cụ, hóa chất:
- Hóa chất:
+ Nhôm oxit (Al2O3) + Axeton khan + Axit ascorbic 0,2% + Pyrocatechin 0,5%
+ Axit sunfuric 10% + KIO3 0,01N
+ Dung dịch đệm photphat pH=7 + Axit xitric (C6H8O7) 0,1M + Na2HPO4 0,2M + Hồ tinh bột 1%
1
2,05 × 0,636 = 0,31mg đường
X C×V×100 v×G×1000
=
Pyrocatechin Octoquinon + nước Men PPO
Octoquinon + axit ascorbic Pyrocatechin + dehydro của axit ascorbic
Tăng Thị Phụng CHTP 07-09 56 - Dụng cụ:
+ Cối chày sứ + Phễu thủy tinh xốp số 2
+ Máy hút chân không + Buret 10ml
+ Pipet 1ml, 2ml + Bình tam giác 100ml + Tủ lạnh bảo quản men
* Phương pháp tiến hành:
Cân 2gam mẫu chè tươi cắt thành từng mảnh nhỏ bỏ vào cối sứ nhanh chóng nghiền với axeton khan và 0,5 gam nhôm oxit. Nghiền xong lắng, gạn, lọc dung dịch qua phễu thủy tinh xốp số 2 còn cặn tiếp tục nghiền. Lọc 5-6 lần cho đến khi chất chlorofin hoàn toàn được tách hết ta thu được bột vàng nhạt trên phễu gọi là hỗn hợp axeton dùng để phân tích.
Cân 50mg bột hỗn hợp men axeton đổ vào cốc thủy tinh hoặc bình tam giác dung tích 100ml. Bổ sung 10ml dung dịch đệm phosphat pH 6,5-7,5, thêm 2ml dung dịch axit ascorbic 0,2% vừa pha và 1ml pyrocatechin 0,5% lắc mạnh trong 2 phút ở nhiệt độ 18-200C. Sau đó khử hoạt tính men bằng cách cho thêm 2ml axit sulfuriqui 10%. Tiếp tục thêm vào phản ứng một vài tinh thể ioduakali và 5 giọt hồ tinh bột 1%. Số lượng axit ascorbic còn lại không bị oxi hóa ta chuẩn độ bằng dung dịch ioduakali (KIO3) 0,01N đến khi xuất hiện màu xanh không đổi.
Hoạt tính của men PPO được thể hiện bằng hiệu số giữa số ml KIO3
mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm trong một gam hỗn hợp axeton.