4. NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM NGỪNG CHU TRÌNH TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG
4.2. Khả năng cảm ứng apoptosis của bài BT3 trên dòng tế bào HeLa
Tác động cảm ứng apoptosis của bài thuốc BT3 trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa được xác định dựa vào:
- Phát hiện sự hoạt hóa caspase-3 là enzyme phân cắt nhiều cơ chất quan trọng, tạo nên kiểu hình đặc trưng của quá trình apoptosis bằng thử nghiệm caspase.
- Nhận diện sự thay đổi hình thái đặc trưng của tế bào apoptosis qua quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang sử dụng thuốc nhuộm kép AO/EB.
36
- Phát hiện sự phân cắt DNA bộ gene bằng phương pháp “thang DNA”
4.2.1. Kết quả thử nghiệm caspase
Trong thử nghiệm caspase, chúng tôi sử dụng Camptothecin làm chứng dương để kiểm sóat tính ổn định của quy trình. Camptothecin có tác dụng ức chế topoisomerase I, từ đó ức chế quá trình sao chép DNA và cảm ứng tế bào đi vào quá trình apoptosis thông qua con đường hoạt hóa caspase. Thử nghiệm caspase-3 được sử dụng để đánh giá khả năng hoạt hóa caspase-3 của bài thuốc trên dòng tế bào HeLa.
Bảng 7 - Kết quả thử nghiệm caspase trên tế bào HeLa được cảm ứng với bài thuốc BT3 với các thời gian cảm ứng khác nhau.
Thời gian cảm ứng (giờ)
Tỉ lệ hoạt tính caspase của mẫu cảm ứng/ mẫu chứng tương ứng
lần 1 lần 2 lần 3 Trung bình
12 0,91 1,03 1,06 0,97 ± 0,09
24 1,01 1,01 0,83 0,95 ± 0,10
36 1,10 1,01 0,86 0,99 ± 0,12
48 0,79 0,87 1,10 0,92 ± 0,16
60 0,97 0,92 1,13 1,01 ± 0,11
72 0,54 0,92 1,10 0,85 ± 0,29
Camptothecin 36 3,19 3,03 2,75 2,99* ± 0,22
(*) thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê
Kết quả (bảng 7) cho thấy hoạt tính caspase-3 ở tế bào xử lý với bài thuốc qua các thời gian cảm ứng khác nhau không khác biệt so với mẫu tế bào không xử lý.
Trong khi đó, mẫu được cảm ứng với Camptothecin sau 36 giờ có hoạt tính caspase-3 cao gấp 3 lần mẫu tế bào không xử lý. Như vậy, bài thuốc BT3 không cảm ứng caspase-3 trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela với các thời gian cảm ứng từ 12 giờ đến 72 giờ.
Nhóm nghiên cứu Ma và cộng sự (2005) công bố khả năng cảm ứng apoptosis qua con đường caspase của bài thuốc Hoàng liên giải độc thang biến thể Trung Quốc.
Theo đó, Hoàng liên giải độc thang hoạt hóa caspase-3 và caspase-9 ở dòng tế bào U266 ở nồng độ IC50 = 50 ng/ml sau 12 giờ cảm ứng. Trong bài thuốc này không có Bạch thược. Như vậy, có hai khả năng để giải thích kết quả nhận được: (1) Bài BT3
37
có chứa thêm vị (Bạch thược) có tác động kìm hãm sự hoạt hóa caspase-3, (2) Nồng độ thuốc sử dụng và các dòng tế bào thử nghiệm không giống nhau ở 2 công trình.
Việc tìm hiểu tác động của từng vị ở phần tiếp theo có thể cho phép làm rõ hơn vấn đề này.
4.2.2. Quan sát sự biến đổi hình thái tế bào apoptosis
Sự hấp thu khác biệt các thuốc nhuộm AO, EB và sự biên đổi hình thái ở tế bào apoptosis được phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang. Phương pháp này cho phép phân biệt tế bào sống, chết do apoptosis và chết do hoại tử. Tế bào sống có màng nguyên vẹn sẽ có nhân phát huỳnh quang xanh đều do chỉ hấp thu AO. Tế bào apoptosis sớm có màng tế bào vẫn còn nguyên vẹn nhưng nhiễm sắc chất đã cô đặc sẽ phát màu xanh rất sáng ở vùng nhân. Tế bào apoptosis ở giai đoạn muộn và hoại tử có màng tế bào bị vỡ, tiếp nhận cả AO và EB, nên nhân tế bào sẽ phát màu đỏ cam là tín hiệu kết hợp của AO và EB [7]. Ngoài ra phương pháp còn cho phép phát hiện các thể apoptotic do sự phân mảnh tế bào.
B
D
C A
E
Hình 11 - Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (400 X) tế bào HeLa có và không có xử lý thuốc.
38
A, tế bào HeLa đối chứng, không xử lý; B, C, D, và E, tế bào HeLa được xử lý với dịch chiết BT3 ở nồng độ IC50, 1,47% (v/v) trong 15, 24, 40 và 48 giờ. Mũi tên nét liền: nhiễm sắc chất cô đặc; mũi tên nét đứt: nhân phân mảnh, nảy chồi trên màng sinh chất, hình thành các thể apoptotic.
Các tế bào HeLa đối chứng và tế bào xử lý với cao chiết nước BT3 ở nồng độ IC50, 1,47% (v/v), trong 15 và 48 giờ, được nhuộm với dung dịch nhuộm AO:EB. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (hình 11) cho thấy sự thay đổi hình thái của tế bào xử lý thuốc so với tế bào đối chứng. Sự cô đặc nhiễm sắc chất trong nhân tế bào, nảy chồi trên màng sinh chất (blebbing) và sự phân mảnh nhân, hình thành các thể apoptotic được ghi nhận sau 19 và 48 giờ ủ với dịch chiết (hình 11 B, C, D, E).
Ngoài ra, trong quần thể tế bào HeLa được xử lý với bài thuốc trong 40 giờ còn xuất hiện một số tế bào nhuộm màu đỏ cam; chứng tỏ quần thể này bắt đầu bước vào giai đoạn apoptosis muộn.
4.2.3. Phân tích sự phân mảnh của DNA bộ gene
Khi bước vào giai đoạn apoptosis muộn, một số endonuclease chuyên biệt trong tế bào sẽ được hoạt hóa và phân cắt DNA bộ gene tại những đoạn nối các nucleosome tạo thành những phân mảnh có kích thước là bội số của 180 bp, hình thành một thang DNA đặc trưng khi điện di trên gel agarose. Hiện tượng phân mảnh DNA được xem là một chỉ thị dễ nhận biết của quá trình apoptosis.
Sự phân mảnh DNA của các tế bào HeLa được xử lý với cao chiết nước BT3 ở nồng độ IC50, 1,47% (v/v), trong 24, 48 và 72 giờ được phát hiện bằng cách tách chiết DNA phân tử lượng nhỏ trong tế bào và phân tích bằng điện di trên gel agarose 2%.
1 2 3 4 5 6
1. Thang DNA 100bp; 2. Tế bào HeLa được cảm ứng với Camptothecin trong 36 giờ ở nồng độ 0,01 àg/ml. 5. Tế bào HeLa khụng xử lớ; 3, 4, 6.
Tế bào HeLa được xử lí với bài thuốc BT3 ở nồng độ 1,47% (v/v) trong 24, 48 và 72 giờ .
Hình 12 - Kết quả điện di trên gel agarose của DNA bộ gene
39
Kết quả (hình 12) cho thấy cho đến 48 giờ xử lý (giếng 4), sự phân mảnh DNA chỉ mới bắt đầu với biểu hiện là dạng smear nhẹ. Điều này phù hợp với kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cho thấy quần thể tế bào HeLa bắt đầu bước vào giai đoạn muộn của quá trình apoptosis sau 40 giờ xử lý. Ở thời điểm này, sự phân cắt DNA đã bắt đầu nhưng chưa đủ để thể hiện trên điện di. Sau 72 giờ xử lý (giếng 6), hiện tượng DNA phân mảnh biểu hiện rất rõ chứng tỏ bài thuốc BT3 đã cảm ứng quá trình apoptosis trên dòng tế bào HeLa ở nồng độ khảo sát.
Theo công bố của Ya-Ling Hsu và cộng sự (2008) khi nghiên cứu một biến thể của bài Hoàng liên giải độc thang cho thấy bài thuốc này cảm ứng apoptosis theo con đường ti thể ở 2 dòng tế bào ung thư gan HepG2 và PLC/PRF/5: hoạt hóa caspase-9 và tạo thang DNA trên gel điện di sau 48 giờ cảm ứng. Kết quả chúng tôi nhận được cho thấy hiện tượng phân mảnh DNA như công bố trên nhưng lại không thấy xuất hiện hoạt tính caspase ở tế bào xử lý cho đến 72 giờ.
Theo công trình của Lee & cs (2006), chất Evodiamine chiết từ quả Evodiae fructus có khả năng kháng ung thư bằng hai cơ chế gây apoptosis, phụ thuộc và không phụ thuộc caspase. Trong cơ chế không phụ thuộc caspase, Evodiamine kích thích sự vận chuyển AIF (Apoptosis-Inducing Factor – nhân tố cảm ứng apoptosis) và endonuclease G vào nhân; đến lượt chúng, các protein này sẽ phân cắt DNA giống như CAD, một nhân tố được hoạt hóa bởi caspase.
Chúng tôi tiến hành các thực nghiệm tiếp theo để tìm hiểu tác động của từng vị trong bài BT3.