5. NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA TỪNG VỊ TRONG SỐ 5 VỊ CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA
5.1. Kết quả sàng lọc độc tính tế bào của 5 vị trong bài thuốc BT3
Chúng tôi xác định độc tính tế bào của 5 vị thuốc bao gồm : Hoàng liên (Coptis sinensis Franch), Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis Georg), Hoàng bá (Phellodendron amurense Rurp), Bạch thược (Paeonia lactiflora Pall) và Chi tử (Gardenia fzorida L) bằng phương pháp SRB (Sulforhodamine B).
Nước sắc thuốc từng vị được pha loãng 10 lần trong môi trường nuôi cấy tế bào E’MEM 10% FBS (nồng độ 10 %) và được dùng để xử lí tế bào HeLa trong 48 giờ.
40
Chứng dương là tế bào nuôi cấy trong môi trường có bổ sung Camptothecin (Cpt) ở nồng độ 0.01àg/ml. Chứng dung mụi là tế bào nuụi cấy trong mụi trường cú bổ sung 0.25% DMSO vì DMSO là dung môi hòa tan Cpt. Chứng âm là tế bào nuôi cấy trong môi trường có bổ sung nước cất 2 lần vô trùng.
Từ các giá trị OD492-620 đo được trên các dòng tế bào thử nghiệm, chúng tôi tính tỉ lệ % ức chế tăng trưởng của tế bào (I %) theo công thức sau :
I (%) = 100 x (1- OD (492-620)TN / OD(492-620)C)
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả được thể hiện trong bảng 8.
Bảng 8- Tỉ lệ % ức chế tăng trưởng (I %) của 5 vị bài thuốc ở nồng độ 10% trên dòng tế bào HeLa
Tên vị Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (I %)
Hoàng liên 78,0 73,5 74,7 75,4 ± 2,3
Hoàng cầm 76,1 76,7 74,5 75,7 ± 1,1
Hoàng bá 85,9 88,0 82,9 85,6 ± 2,6
Bạch thược 80,9 83,5 86,2 83,4 ± 2,7
Chi tử 78,0 79,8 79,3 78,7 ± 0,9
Camptothecin 49,1 46,1 58,0 51,1 ± 6,2
Kết quả (bảng 8) cho thấy, ở nồng độ 10%, sắc nước của tất cả các vị trong bài thuốc BT3 đều có giá trị ức chế tăng trưởng tế bào trên 70%.
Kết quả này phù hợp với nhiều công trình nghiên cứu về Hoàng liên, Hoàng cầm, Hoàng bá, Bạch thược và Chi tử đã công bố. Baicalein, baicalin, wogonin có trong Hoàng cầm cũng như Berberine và Coptisine, thành phần chính của cả Hoàng liên và Hoàng bá đều có tác dụng ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư máu và gan. Crocetin có trong Chi tử có nhiều tác dụng: ức chế khối u, kháng oxy hóa, kháng viêm, chống tăng sinh mạch máu mới. Bạch thược, với thành phần hóa học đa dạng, cũng có nhiều tác dụng như ức chế sự phát triển khối u, chống tăng sinh mạch mới, chống oxy hóa.
Song song với thí nghiệm trên, chúng tôi ghi nhận sự thay đổi hình thái tế bào trong quá trình xử lí với từng vị. Các lô chứng được thiết kế nhằm kiểm tra tác động của những nhân tố không phải là thuốc trong quá trình thực nghiệm
Kết quả từ các lô chứng được trình bày trong hình 13.
- Lô chứng (13A): Tế bào HeLa nuôi trong môi trường (E’MEM 10% FBS), có hình dạng bình thường của tế bào biểu mô, tăng trưởng bình thường, ít tế bào nổi.
41
- Lô chứng dung môi (13B): Tế bào HeLa nuôi trong môi trường bổ sung 0.25% DMSO có hình thái và sự tăng trưởng không khác với lô tế bào chứng. Điều đó cho thấy DMSO không ảnh hưởng đến hình thái cũng như sự tăng trưởng của tế bào.
- Lô chứng âm (13C): Tế bào HeLa nuôi trong môi trường bổ sung 10% nước cất, không khác biệt về hình dạng cũng như sự tăng trưởng so với khi nuôi trong môi trường bình thường. Như vậy nước cất (có trong nước sắc thuốc) không ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của tế bào.
- Lô chứng dương (13D): Tế bào HeLa nuôi trong môi trường bổ sung 0.01 àg/ml Cpt, mất tớnh bỏm vào bề mặt nuụi cấy, co trũn lại, nổi nhiều trong mụi trường;
mật độ tế bào giảm nhiều so với bình thường.
A. Tế bào HeLa nuôi trong môi trường (E’MEM 10% FBS) ; B. Tế bào HeLa nuôi trong môi trường bổ sung 0.25 % DMSO ; C. Tế bào HeLa nuôi trong môi trường bổ sung 10 % nước cất ; D. Chứng dương: tế bào HeLa nuụi trong mụi trường nuụi cấy bổ sung 0.01 àg/ml Cpt
A B
C D
Hình 13- Hình thái tế bào HeLa sau 48 giờ nuôi cấy ở các lô chứng (400X)
42
Kết quả ở các lô thực nghiệm có xử lý với thuốc được trình bày trong hình 14.
A. Tế bào HeLa xử lí với 10% nước sắc Hoàng liên ; B. Tế bào HeLa xử lí với 10% nước sắc Hoàng cầm ; C. Tế bào HeLa xử lí với 10% nước sắc Hoàng bá ; D. Tế bào HeLa xử lí với 10% nước sắc Bạch thược.
- Lô thử 1 (14A): Tế bào HeLa nuôi trong môi trường bổ sung 10% nước sắc Hoàng liên bị co lại, mất tính bám, nổi nhiều trong môi trường, mật độ tế bào giảm.
- Lô thử 2 (14B): Tế bào HeLa nuôi trong môi trường bổ sung 10% nước sắc Hoàng cầm vẫn giữ hình dạng ban đầu nhưng có kích thước nhỏ hơn, co lại nhưng vẫn bám vào bề mặt nuôi cấy và mật độ tế bào giảm so với đối chứng.
- Lô thử 3 (14C): Tế bào HeLa nuôi trong môi trường bổ sung 10% nước sắc Hoàng bá có dạng co tròn, mất tính bám, nổi trong môi trường, mật độ tế bào giảm so với đối chứng.
- Lô thử 4 (14D): Tế bào HeLa nuôi trong môi trường bổ sung 10% nước sắc Bạch thược có hình dạng tương tự như khi xử lí với Hoàng cầm : tế bào co lại, vẫn bám vào bề mặt nuôi cấy, có ít tế bào nổi, mật độ tế bào giảm nhiều.
Như vậy, tại nồng độ 10%, nước sắc của tất cả các vị của bài thuốc BT3 đều thể hiện khả năng ức chế sự tăng trưởng dòng tế bào HeLa.
A
C
B
D
Hình 14 - Hình thái tế bào HeLa sau 48 giờ nuôi cấy ở các lô thử nghiệm(400X)
43