5. NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA TỪNG VỊ TRONG SỐ 5 VỊ CỦA BÀI THUỐC BT3 TRÊN DÒNG TẾ BÀO HELA
5.3. Kết quả xác định khả năng cảm ứng apoptosis của các vị có độc tính tế bào cao
5.3.3. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang tế bào HeLa xử lí với nước sắc Hoàng liên và Hoàng cầm
Kết quả quan sát tế bào HeLa xử lý với nước sắc Hoàng liên và Hoàng cầm ở nồng độ 1,47% trong 15 và 24 giờ dưới kính hiển vi huỳnh quang với màu nhuộm AO:EB cho thấy (hình 17):
Lô cảm ứng với Hoàng cầm 15 giờ (hình 17C) có nhiều tế bào bắt màu đỏ của ethidium bromide; đây là những tế bào chết có màng sinh chất đã bị phá vỡ. Sau 24 giờ cảm ứng với Hoàng cầm (hình 17D), vẫn quan sát thấy một ít tế bào có màng sinh chất bị vỡ, nhiều tế bào bị ly giải.
Ở lô cảm ứng với Hoàng liên 15 giờ (hình 17E) xuất hiện một số tế bào có hình thái apoptosis (mũi tên đỏ): vùng nhân phát huỳnh quang rất sáng lệch về một phía của tế bào. Sau 24 giờ cảm ứng với Hoàng liên (hình 17F) có sự xuất hiện của các tế bào apoptosis (mũi tên đỏ) với vùng nhân sáng màu do nhiễm sắc chất cô đặc và thể hiện sự phân mảnh.
Như vậy, kết quả quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang với màu nhuộm AO:EB cho thấy Hoàng liên bắt đầu cảm ứng apoptosis trên tế bào Hela ở nồng độ IC50 của bài thuốc tổng sau 15 giờ cảm ứng. Trong khi đó, Hoàng cầm ở nồng độ IC50 của bài thuốc tổng lại có tác động gây chết tế bào nhanh, giống như kiểu hoại tử . Tác động này của Hoàng cầm rất giống tác động của bài thuốc BT3 tổng.
M HL HC H2O Cpt
M. Thang kích thước 100 bp; nước sắc HL: Hoàng liên HC: Hoàng cầm; Cpt: Camptothecin
Hình 16 - Kết quả thử nghiệm phân mảnh DNA trên tế bào HeLa sau 40 giờ cảm ứng với nước
sắc Hoàng liên và Hoàng cầm
48
A. Lô chứng 15 giờ, B. Lô chứng 24 giờ, C. Lô xử lý Hoàng cầm 15 giờ, D. Lô xử lý Hoàng cầm 24 giờ, E. Lô xử lý Hoàng liên 15 giờ, F. Lô xử lý Hoàng liên 24 giờ
Kết hợp các kết quả trên, chúng tôi thấy rằng:
- Hoàng liên cảm ứng hoạt tính caspase ở tế bào HeLa, dẫn đến sự phân mảnh DNA bộ gene và gây chết tế bào với kiểu hình apoptosis đặc trưng.
- Hoàng cầm không hoặc cảm ứng rất yếu hoạt tính caspase, không gây phân mảnh DNA ở 40 giờ xử lý thuốc và gây chết tế bào nhanh, với kiểu hình không đặc trưng, gần giống hoại tử.
A B
C D
F E
Hình 17 - Hình ảnh tế bào HeLa ở mẫu chứng (A, B) và khi xử lí với Hoàng cầm và Hoàng liên (C, D, E, F) sau 15 giờ và 24 giờ dưới KHV huỳnh quang(400X)
49
6. KHẢO SÁT BIỂU HIỆN TỔNG THỂ CỦA CÁC GENE Ở TẾ BÀO HELA XỬ LÝ VỚI BÀI THUỐC - XÁC ĐỊNH CÁC GENE ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC
Chúng tôi khảo sát biểu hiện của các gene trong toàn bộ bộ gene người, cụ thể là bộ gene ở tế bào HeLa, khi tế bào được xử lý với bài thuốc. Nội dung này được thực hiện bằng phương pháp microarray trên 2 lô tế bào thử nghiệm – xử lý thuốc 24 giờ và 36 giờ, có so với lô tế bào chứng không xử lý.
Những gene có mức độ tăng/giảm biểu hiện từ 2 lần trở lên (≥ 2) sẽ được ghi nhận. Mức độ ≥ 2 được chọn dựa trên một số công trình nghiên cứu trước đây (Beatrice E.Bachmeier & cs, 2008; Roy C.Y.Choi & cs, 2009; …).
Phân tích kết quả microarray thu được từ tế bào HeLa cảm ứng với bài thuốc BT3 trong 24 giờ và 36 giờ cho thấy trong tổng số 33.297 gene:
- Sau 24 giờ cảm ứng, có 58 gene tăng (≥ 2) và 97 gene giảm biểu hiện
- Sau 36 giờ có khoảng 255 gene tăng biểu hiện (≥ 2) và 153 gene giảm biểu hiện (≤ -2). Số còn lại là những gene không thay đổi biểu hiện hoặc có mức độ thay đổi <2 (phụ lục 7.5).
Khi so sánh các gene tăng biểu hiện ở 24 và 36 giờ thì có 11 gene là trùng nhau.
Số còn lại cho kết quả không phù hợp – có gene tăng biểu hiện ở 24 giờ nhưng hoàn toàn không tăng hoặc giảm biểu hiện ở 36 giờ và ngược lại. Các kết quả này được xem là không đáng tin cậy và được loại ra khỏi bảng phân tích. Kết quả tương tự cũng được thu nhận từ nhóm gene giảm biểu hiện với số gene là 16.
Như vậy, số lượng gene tăng biểu hiện ổn định là 11 (~ 0,03%); và số gene giảm biểu hiện là 16 (~ 0,05 %).
Kết quả của chúng tôi cho thấy trong số các gene giảm biểu hiện ở thời điểm 36 giờ có gene CASP9, đặc trưng cho con đường apoptosis qua ty thể. Mặt khác, trong số các gene tăng biểu hiện, không có gene CASP nào được ghi nhận. Điều này phù hợp với kết quả khảo sát hoạt tính caspase của bài thuốc BT3 tổng và các vị, trong đó bài thuốc tổng và ba trong số bốn vị chính không cảm ứng hoạt tính caspase ở tế bào HeLa xử lý. Mặt khác, Baicalin, thành phần hóa học chính của 3 vị trong bài thuốc BT3, có khả năng cảm ứng hiện tượng apoptosis vừa phụ thuộc, vừa không phụ thuộc caspase (Ueda & cs, 2001).
50
Một số gene khác giảm biểu hiện và có chức năng đã biết được ghi nhận là: (1) gene HIST1H2B, là gene mã hóa cho một protein histone, (2) gene CD24 được xem như một phân tử chỉ thị sớm cho các dạng ung thư tế bào gan…
Trong số các gene tăng biểu hiện, có một số kết quả lặp lại ở cả 24 giờ và 36 giờ thử thuốc liên quan đến một số gene đáng chú ý sau đây (bảng 11):
W Gene DDIT3: mã hóa cho protein CHOP/gadd153, là một nhân tố phiên mã được cảm ứng bởi nhiều tác nhân gây “stress” trên tế bào như tia UV, tác nhân gây độc tế bào, hay tình trạng thiếu oxy dẫn đến sự gấp cuộn sai của các protein trong mạng lưới nội chất. Protein CHOP là một nhân tố khởi đầu quá trình apoptosis và là nhân tố trung gian chủ chốt trong quá trình chết của tế bào do stress ở mạng lưới nội chất nhám (ER stress-induced cell death) (Maytin & cs, 2001).
W Gene TRIB3: cũng là một gene được cảm ứng do stress ở mạng lưới nội chất nhám, và là nhân tố truyền tín hiệu trung gian thứ hai trong con đường apoptosis do CHOP.
Cả DDIT3 và TRIB3 đều là những trình tự mục tiêu của ATF4 vốn là một nhân tố phiên mã thuộc con đường ISR (Integrated Stress Response). ISR là một hệ thống đáp ứng được khởi động khi tế bào chịu tác động của stress. Dưới tác động của stress, một số nhân tố phiên mã đặc hiệu trong đó có ATF4 sẽ tăng biểu hiện dẫn đến sự tăng biểu hiện các gene mục tiêu của nó như DDIT3 và TRIB3. Một công trình nghiên cứu (Calligaris & cs, 2009) cho thấy sự tăng không đáng kể của ATF4 lại đi kèm với mức tăng biểu hiện rất cao của những gene mục tiêu của nó là DDIT3, ATF3, CEBPB, CREB3L2, TRIB3 khi tế bào chịu tác động của stress.
Kết quả chúng tôi nhận được không ghi nhận sự tăng của ATF4 nhưng lại thấy sự tăng cao biểu hiện các gene DDIT3 và TRIB3.
W Gene GDF15: là một gene thụôc nhóm gene liên quan đến quá trình apoptosis khởi động bởi con đường ISR giống như DDIT3. Một công trình nghiên cứu (Einbond & cs, 2007) cho thấy sự tăng biểu hiện của GDF15 ở tế bào ung thư vú người MDA-MB-453 được xử lý với chất chiết từ Actaea racemasa.
Kết quả của chúng tôi cho thấy sự tăng dần biểu hiện rõ rệt của GDF15 từ 24 giờ đến 36 giờ cảm ứng, từ 2,5 lên 3,5 lần, giống công bố đã nêu (Einbond & cs, 2007). Điều này cho thấy tế bào xử lý đang dần tiến sâu vào quá trình apoptosis.
51
W Gene FAM129A: mã hóa cho protein Niban, được tìm thấy biểu hiện cao ở nhiều dạng ung thư trên động vật thực nghiệm và người. Protein Niban làm tăng cường sự sinh tổng hợp nhiều protein như EIF2A, EIF4EBP1, RPS6KB. Đây là những protein của quá trình dịch mã đặc trưng cho con đường chết tế bào do stress ở mạng lưới nội chất nhám. Chính vì vậy, FAM129A là một thành viên quan trọng của quá trình chết tế bào do stress ở mạng lưới nội chất nhám (ER stress-induced cell death) giống như CHOP.
Kết quả của chúng tôi cho thấy sự tăng đáng kể biểu hiện của gene FAM129A, từ 2,9 lần ở 24 giờ xử lý thuốc lên 4 lần ở 36 giờ xử lý thuốc, mức tăng cao nhất trong số các gene có đáp ứng.
W Gene STC2: mã hóa cho Stanniocalcin 2, một hormone điều hòa calcium và phosphate ở động vật có vú. Protein này tăng cường biểu hiện khi tế bào chịu tác động một số stress như xử lý hóa chất, đặc biệt là trong tình trạng thiếu oxy dẫn đến sự gấp cuộn sai các protein trong mạng lưới nội chất nhám. Sự tăng vượt mức gene này ở tế bào HeLa và dòng tế bào ung thư thần kinh N2a giúp tế bào chống chọi tốt hơn với việc xử lý hóa chất gây độc tế bào (Ito & cs, 2008).
Kết quả của chúng tôi cho thấy gene này tăng biểu hiện ở tế bào xử lý thuốc 24 giờ với mức tăng là 3,4 lần. Nhưng đến 36 giờ xử lý thuốc, mức tăng biểu hiện của gene chỉ còn 2,4. Như vậy, sự tăng biểu hiện STC2 ở thời điểm sớm cho thấy tế bào hình thành cơ chế tự bảo vệ, nhưng cơ chế này giảm dần hoạt động khi thời gian xử lý thuốc tăng lên.
W Gene SERPINE 2: mã hóa cho một nhân tố ức chế nhiều serine proteinase tế bào như Trypsin, Thrombin, … Gene này được xem như một ứng viên sáng giá trong bệnh COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease – Bệnh tắt nghẽn phổi mãn tính). Một công trình nghiên cứu (Buchholz & cs, 2003) cho thấy sự biểu hiện vượt mức của gene này ở khối u tụy làm tăng khả năng xâm lấn và di căn của tế bào ung thư. Tuy nhiên trên các tế bào ung thư nuôi cấy in vitro, các tác giả không nhận thấy ảnh hưởng nào của SERPINE 2.
Kết quả của chúng tôi cho thấy một sự tăng đáng kể của SERRPINE 2 từ 2,1 lần ở 24 giờ xử lý thuốc lên 3,7 lần ở 36 giờ xử lý thuốc.
52
Nhìn chung, những kết quả vừa nêu cho thấy tác động của bài thuốc BT3 trên dòng tế bào HeLa thể hiện thông qua việc cảm ứng các con đường apoptosis do stress ở mạng lưới nội chất nhám, và không phụ thuộc caspase.
Bảng 11- Kết quả phân tích microarray một số gene tăng biểu hiện ở tế bào HeLa xử lý với bài thuốc BT3
Ký hiệu gene
mRNA
Accession Tên gene
Sự tăng biểu hiện gene (số lần)
24 giờ 36 giờ FAM129A NM_052966 Family with sequence similarity
129, member A 2,9 ± 0,36 4,1 ± 0,97
SERPINE2 NM_006216 Serpine peptidase inhibitor,
member 2 2,1 ± 0,10 3,7 ± 0,53
GDF15 NM_004864 Growth differentiation factor 15 2,5 ± 0,35 3,7 ± 1,39 DDIT3 NM_004083 DNA damage-inducible transcript 3 2,7 ± 0,26 2,9 ± 0,90 STC2 NM_003714 Stanniocalcin 2 3,5 ± 0,89 2,5 ± 0,66 TRIB3 NM_021158 Tribbles homolog 3 2,0 ± 0,37 2,1 ± 0,74
Chúng tôi kiểm tra kết quả microarray bằng kỹ thuật real-time RT-PCR. Kỹ thuật real-time RT-PCR còn cho phép định lượng tương đối mức độ biểu hiện các gene nghiên cứu
Kết quả định lượng tương đối mRNA của 6 gene nghiên cứu (hình 18) cho thấy gene SERPINE2 trong tế bào HeLa cảm ứng với bài thuốc BT3 sau 24 giờ cho mức
Hình 18 - Mức độ biểu hiện một số gene xác định bằng kỹ thuật real-time RT-PCR
53
độ biểu hiện cao nhất, cao hơn 19,67 ± 6,63 lần so với lô chứng. Các gene có mức độ tăng biểu hiện giảm dần theo thứ tự là FAM129A – 14,93 ± 4,19, STC2 – 9,08 ± 0,67, DDIT3 – 8,99 ± 3,52, TRIB3 – 6,14 ± 0,63 và GDF15 – 5,16 ± 0,59. Gene “giữ nhà”
(house-keeping gene) GADPH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenease) được sử dụng làm chứng nội trong định lượng tương đối mRNA của các gene nghiên cứu.
Có sự không thống nhất trong kết quả microarray và real-time RT-PCR mà chúng tôi nhận được. Kết quả này không bất hợp lý vì một phương pháp thì dựa trên phản ứng lai phân tử trong khi phương pháp kia dựa trên phản ứng nhân bản trình tự mục tiêu với các động học phản ứng rất khác biệt. Điều này đã được ghi nhận trong các công trình nghiên cứu tương tự trước đây (Linda Saxe Einbond & cs, 2007). Kết quả RT real-time -PCR cho giá trị định lượng chính xác hơn, và sẽ được dùng là “dấu ấn sinh học” cho bài thuốc BT3 ở nội dung sau.