8. XÂY DỰNG “DẤU VÂN TAY HÓA HỌC” VÀ “DẤU VÂN TAY SINH HỌC” CỦA BÀI THUỐC BT3
8.2. Xây dựng “dấu vân tay sinh học”
Để xây dựng “dấu vân tay sinh học”, chúng tôi dựa trên kết quả microarray và chọn ra một số gene có biểu hiện tăng/giảm ổn định ở cả 2 lô thử nghiệm (tế bào xử lý thuốc 24 giờ và 36 giờ). Các gene đó bao gồm CD24, CRYAB, NUPR1, CYP4F11, BAX, BCL-2, FAM129A, SERPINE2, GDF15, DDIT3, STC2, TRIB3.
Dựa vào tính ổn định của các kết quả real-time RT-PCR ban đầu trên các gene nêu trên, chúng tôi đã chọn 6 gene gồm FAM129A, SERPINE2, GDF15, DDIT3, STC2, TRIB3 để dùng làm “dấu vân tay sinh học” cho bài thuốc BT3.
Trên các gene đã chọn, chúng tôi xây dựng phương pháp real-time RT-PCR để định lượng tương đối (bán định lượng) biểu hiện của chúng, cụ thể là đo hàm lượng
79
mRNA của mỗi gene trong tế bào ở các thời điểm nghiên cứu đồng thời với hàm lượng của chứng nội.
Gene GADPH mã hóa cho Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenease, thuộc nhóm gene “giữ nhà” (housekeeping gene) nghĩa là có biểu hiện ổn định ở mọi điều kiện được sử dụng làm chứng nội. Trong mỗi phản ứng định lượng, hàm lượng mRNA của gene khảo sát được đo đồng thời với hàm lượng của chứng nội. Biểu hiện của chứng nội ở đây được xem như biểu hiện “nền” cho từng phản ứng và sự tăng giảm biểu hiện của gene nghiên cứu được nhận biết bằng cách so sánh với biểu hiện
“nền” này. Vì biểu hiện “nền” không thay đổi theo điều kiện thực nghiệm, nên sự tăng/giảm của gene nghiên cứu ở từng điều kiện thực nghiệm sẽ thể hiện rõ, và sự tăng/giảm này không phụ thuộc lượng RNA ban đầu được đưa vào phản ứng.
Chúng tôi xây dựng quy trình real time RT-PCR cho 6 gene “dấu vân tay sinh học”, bao gồm : (1) các mồi sử dụng, (2) chương trình PCR.
Kết quả bộ mồi tự thiết kế và mồi trích từ các công bố trước đây được trình bày trong bảng 37.
Bảng 37 - Các mồi sử dụng trong phản ứng real-time RT-PCR với các gene nghiên cứu
Ký hiệu mồi Trình tự Nguồn
pf GADPH* GAAGGTGAAGGTCGGAGTC Masahide Ikeguchi và cs, 2002.
pr GADPH* GAAGATGGTGATGGGATTTC
pf FAM129A GAGAAGGGTCACTATGGTTCC Realtime RT-PCR tool @ http://www.idtdna.com/
pr FAM129A CCACGTCCTCTTTCTGTCATTC
pf GDF15* CGAAGACTCCAGATTCCGAGAG de Wit NJ và cộng sự.
British journal of cancer.
2005 Jun;92(12):2249-61.
pr GDF15* CCAGCCGCACTTCTGGC
pr TRIB3* TGCCCTACAGGCACTGAGTA British Journal of Cancer (2009) 101(10), 1664 – 1670
pr TRIB3* GTCCGAGTGAAAAAGGCGTA
pf DDIT3* AAGTGGCTACTGACTACCCTCTCACT Akatsu Y. Cancer science.
2007 May; 98(5):707-15.
pr DDIT3* AAGCCTTCCCCCTGCGTAT
pf STC2 CCGGGTGATAGTGGAGATG Realtime RT-PCR tool @ http://www.idtdna.com/
pr STC2 TTCTGCTCACACTGAACCTG
pf SERPINE2* CACATCAGCACCAAGACCATAGAC Ifon ET và cộng sự. Cancer cell international. 2005 Jun;5:19.
pr SERPINE2* TGCCAAGAACTTTCAGCGG Ghi chú: *Mồi trích từ các công bố trước đây Chương trình PCR được thiết lập như sau :
Bước 1: 95oC, 5 phút
Bước 2 - 44 chu kỳ nhiệt: 95oC, 30 giây - 60oC, 30 giây - 72oC, 30 giây
80 Bước 3: 72oC, 6 phút
Bước 4: Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy
Kết quả phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy thể hiện tính đặc hiệu của phản ứng PCR được trình bày trong bảng 38.
Bảng 38 - Kết quả nhiệt độ nóng chảy sản phẩm PCR của các gene Gene Tm (oC) Mũi nhiệt độ nóng chảy
GADPH 83,0oC ± 0,0
DDIT3 80,5oC ± 0,0
FAM129A 82,5oC ± 0,5
STC2 85,5oC ± 0,5
GDF15 87,75 ± 0,75
81 SERPINE2 83,5oC ± 0,5
TRIB3 89,5oC ± 0.0
Kết quả trên cho thấy đối với từng phản ứng PCR chỉ có một “mũi nóng chảy”
tương ứng với một nhiệt độ xác định, nghĩa là chỉ có một sản phẩm PCR cho mỗi gene. Điều này cho thấy tính đặc hiệu cao của các phản ứng PCR. Các kết quả thu nhận được là từ các lần sắc thuốc khác nhau.
Các sản phẩm nhân bản được giải trình tự và so sánh với dữ liệu trong ngân hàng dữ liệu gene. Kết quả so sánh cho thấy chúng chính là sản phẩm nhân bản từ các gene mong đợi (phụ lục 7.6)
Kết quả real time RT-PCR của 3 lần lặp lại với ba lần sắc thuốc khác nhau được thể hiện qua giá trị Ct (Cycle Threshold – Chu kỳ ngưỡng) của 6 gene khảo sát (bảng 39).
Kết quả cho thấy giá trị Ct của gene chứng nội GADPH ít biến động (với giá trị Ct trung bình của lô chứng và lô thử nghiệm là 24,63 ± 0,7) giữa lô chứng và lô thử nghiệm. Như vậy GADPH là một chứng nội đáng tin cậy cho việc khảo sát sự tăng/giảm biểu hiện các gene.
Bảng 39 - Giá trị Ct và sự thay đổi biểu hiện ở mức mRNA của một số gene được phân tích bằng kỹ thuật realtime-PCR bán định lượng.
Gene
Ct Sự thay đổi
biểu hiện C24h BT24h
GADPH 24,31± 0,4 24,95 ± 0,8 1,00 ± 0,0 TRIB3 37,59 ± 1,3 35,62 ± 1,2 6,14 ± 0,6 DDIT3 24,25 ± 0,3 22,43 ± 1,2 8,99 ± 3,5 STC2 34,62 ± 1,3 31,56 ± 1,9 9,08 ± 0,7 SERPINE2 31,71 ± 0,6 28,72 ± 1,0 19,67 ± 6,6 FAM129A 33,72 ± 1,4 30,50 ± 1,3 14,93 ± 4,2 GDF15 32,48 ± 1,3 30,35 ± 1,2 5,16 ± 0,6
82
Ghi chú: C24h: lô chứng 24 giờ; BT24h: lô thực nghiệm sau 24 giờ xử lý với thuốc Nhìn chung, xếp theo thứ tự mức độ tăng biểu hiện giảm dần, chúng ta có kết quả : SERPINE2 > FAM129A > STC2 > DDIT3 > TRIB3 > GDF15 19,67 ± 6,6 14,93 ± 4,2 9,08 ± 0,7 8,99 ± 3,5 6,14 ± 0,6 5,16 ± 0,6
Độ ổn định của các phản ứng real time RT-PCR khá cao đối với các gene STC2, TRIB3 và GDF15. Ba gene còn lại có tính biến động cao hơn.
Như vậy, bộ mồi và chương trình PCR đã thiết lập cho 6 gene khảo sát có thể sử dụng để xây dựng “dấu vân tay sinh học” cho bài thuốc BT3.
Tóm lại, “dấu vân tay hóa học” của bài thuốc BT3 được xác định dựa trên hàm lượng Baicalin có trong nước sắc thuốc bằng kỹ thuật HPLC còn “dấu vân tay sinh học” thì dựa trên kết quả real time RT-PCR định lượng tương đối hàm lượng của 6 gene FAM129A, SERPINE2, GDF15, DDIT3, STC2, và TRIB3. Các “dấu vân tay”
này có thể được sử dụng để đánh gái độ ổn định của những lần sắc thuốc sau này đối với bài thuốc BT3.
83
KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
Chúng tôi đã thực hiện và thu nhận được những kết quả sau:
(1) Tuyển chọn được 05 bài thuốc cổ truyển/dân gian dựa vào kinh nghiệm hỗ trợ điều trị bệnh (từ khoa Y học cổ truyền – ĐH Y dược TpHCM và Lương y Nguyễn An Định) và những thông tin khoa học nhóm thu thập được từ những nghiên cứu trong nước và nhiều nước trên thế giới, là các bài: Song sâm địa thược thang, Nhị trần thang gia vị, Hoàng liên giải độc thang, Tiêu tích nhuyễn kiên phương và Nam địa long.
(2) Sử dụng quy trình nấu (tham khảo từ Đông y) và thu nhận dịch chiết nước 05 bài thuốc trên.
(3) Xác định hoạt tính gây độc tế bào (giá trị IC50 %v/v) của 05 bài thuốc bằng phương pháp SRB trên 03 dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi NCI-H460.
Chọn bài thuốc Hoàng Liên giải độc thang (BT3) có giá trị độc tính tế bào cao nhất trên 03 dòng, đồng thời chọn 01 dòng tế bào HeLa tương đối ổn định để tiếp tục các thử nghiệm về sau.
(4) Kết quả đánh giá khả năng gây apoptosis của BT3 1,47% lên tế bào HeLa, gồm:
- Bằng phương pháp Flow cytometry, chúng tôi đã đánh giá được BT3 ở nồng độ pha loãng 1,47% khi được cảm ứng trên dòng tế bào HeLa ở các thời điểm 12, 24, 36, 48 và 72 giờ không có tác động làm dừng chu trình tế bào tại bất kỳ pha nào của chu trình tế bào; tuy nhiên, tại thời điểm 72 giờ, 8,23±1,48% quần thể tế bào HeLa được cảm ứng với BT3 1,47% có hiện tượng DNA nội bào bị phân cắt, được cho là những tế bào apoptosis.
- Bằng thử nghiệm caspase-3 cho thấy BT3 1,47% không hoạt hóa caspase-3 ở tế bào HeLa cảm ứng.
- Quan sát sự biến đổi hình thái tế bào HeLa bằng kỹ thuật nhuộm AO/EB huỳnh quang cho thấy quần thể tế bào HeLa được cảm ứng 15, 24, 40 và 48
84
giờ với BT3 1,47% cho các hình thái DNA cô đặc, màng có hiện tượng
“blebbing” đặc trưng cho tế bào trải qua apoptosis.
- Bằng kỹ thuật DNA phân mảnh, chúng tôi ghi nhận có apoptosis ở quần thể tế bào HeLa được cảm ứng BT3 1,47% sau 72giờ thông qua hiện tượng
“thang” DNA.
(5) Kết quả nghiên cứu các vị trong BT3
- Chúng tôi xác định được giá trị gây độc tế bào của 05 vị trong BT3 lên dòng tế bào HeLa và có thể sắp xếp theo thứ tự giảm dần độc tính của các vị như sau: Hoàng Liên>Hoàng cầm>Bạch thược>Hoàng bá>Chi tử.
- Với thử nghiệm hoạt tính caspase-3, chúng tôi chỉ ghi nhận được tác dụng tăng hoạt tính caspase-3 lên 5,56 ± 0,01 lần của Hoàng liên 1,47% lên tế bào HeLa sau 36 giờ cảm ứng so với tế bào HeLa không cảm ứng. Còn các vị còn lại không có sự thay đổi hoạt tính caspase-3 nào.
- Chúng tôi thu được hiện tượng DNA phân mảnh của quần thể tế bào HeLa sau khi cảm ứng với Hoàng Liên 1,47% 40 giờ cho thấy quần thể tế bào HeLa bị apoptosis. Còn hoàng cầm, sự phân mảnh DNA không quan sát được rõ rang nên chưa thể đưa ra kết luận gì về khả năng gây apoptosis củ vị này.
- Quần thể tế bào HeLa sau 15, 24 giờ cảm ứng với Hoàng Liên cho thấy sự thay đổi hình thái của những tế bào trải qua apoptosis; còn đối với Hoàng cầm hình thái tế bào có sự thay đổi lạ không giống những tế bào apoptosis nên không thể kết luận đối với vị này.
(6) Sử dụng kỹ thuật microarray, chúng tôi phân tích và so sánh các gene tăng và giảm biểu hiện ở tế bào HeLa sau 24 và 36 giờ cảm ứng với BT3 1,47%; đã ghi nhận được sự thay đổi biểu hiện tương đối ổn định tại 2 mốc thời gian khảo sát trong tổng số 33.297 gene phân tích có:
11 gene tăng biểu hiện (≥2), gồm: 7896129 (gene không xác định), STC2, FAM129A, DDIT3, 7894580, GDF15, 7894570, 7894996, SERPINE2, 7895852, TRIB3,CYP4F11.
85
16 gene giảm biểu hiện (≤ 2): ID3, FOS, 8180366, 8180367, SLC12A3, FAM105A, A2M, METTL7A, FBN1, HIST1H2BM, CD24, KLHL4, CRYAB, OLFML1, 7895700, RP11-259P20.2
Chúng tôi ghi nhận được 06 gene đang chú ý và có liên quan đến 1 con đường cảm ứng apoptosis cho tế bào, gồm: DDIT3, TRIB3, GDF15, FAM129A, STC2 và SERPINE2.
(7) Chúng tôi kiểm tra đơn giản kết quả microarray bằng kỹ thuật realtime RT-PCR để định lượng tương đối lại mức độ biểu hiện của 06 gene trên và đồng thời xác định được 06 quy trình realtime PCR tin cậy cho việc xác định “dấu ấn sinh học”
đánh giá tác động sinh học ổn định của BT3 lên dòng tế bào HeLa với những giá trị ΔCt ổn định của 06 gene trên.
Quy trình 01 Trình tự cặp mồi:
pf GADPH GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
pr GADPH GAAGATGGTGATGGGATTTC
pf FAM129A GAGAAGGGTCACTATGGTTCC
pr FAM129A CCACGTCCTCTTTCTGTCATTC
Chương trình PCR:
Bước 1: 95oC, 5 phút
Bước 2 - 44 chu kỳ nhiệt: 95oC, 30 giây - 60oC, 30 giây - 72oC, 30 giây Bước 3: 72oC, 6 phút
Bước 4: Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy
Giá trị ΔCt và Tom của sản phẩm PCR:
Gene
Ct Sự thay đổi
biểu hiện C24h BT24h
GADPH 24,31± 0,4 24,95 ± 0,8 1,00 ± 0,0 FAM129A 33,72 ± 1,4 30,50 ± 1,3 14,93 ± 4,2
Tom (GADPH) = 83,0oC ± 0,0 Tom (FAM129A) = 82,5oC ± 0,5
86 Quy trình 02
Trình tự cặp mồi:
Ký hiệu mồi Trình tự
pf GADPH* GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
pr GADPH* GAAGATGGTGATGGGATTTC
pf SERPINE2* CACATCAGCACCAAGACCATAGAC pr SERPINE2* TGCCAAGAACTTTCAGCGG
Chương trình PCR:
Bước 1: 95oC, 5 phút
Bước 2 - 44 chu kỳ nhiệt: 95oC, 30 giây - 60oC, 30 giây - 72oC, 30 giây Bước 3: 72oC, 6 phút
Bước 4: Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy
Giá trị ΔCt và Tom của sản phẩm PCR:
Gene
Ct Sự thay đổi
biểu hiện C24h BT24h
GADPH 24,31± 0,4 24,95 ± 0,8 1,00 ± 0,0 SERPINE2 31,71 ± 0,6 28,72 ± 1,0 19,67 ± 6,6
Tom (GADPH) = 83,0oC ± 0,0 Tom (SERPINE2) = 83,5oC ± 0,5
Quy trình 03 Trình tự cặp mồi:
Ký hiệu mồi Trình tự
pf GADPH* GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
pr GADPH* GAAGATGGTGATGGGATTTC
pf STC2 CCGGGTGATAGTGGAGATG
pr STC2 TTCTGCTCACACTGAACCTG
Chương trình PCR:
Bước 1: 95oC, 5 phút
Bước 2 - 44 chu kỳ nhiệt: 95oC, 30 giây - 60oC, 30 giây - 72oC, 30 giây Bước 3: 72oC, 6 phút
87
Bước 4: Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy
Giá trị ΔCt và Tom của sản phẩm PCR:
Gene
Ct Sự thay đổi
biểu hiện C24h BT24h
GADPH 24,31± 0,4 24,95 ± 0,8 1,00 ± 0,0 STC2 34,62 ± 1,3 31,56 ± 1,9 9,08 ± 0,7
Tom (GADPH) = 83,0oC ± 0,0 Tom (STC2) = 85,5oC ± 0,5
Quy trình 04 Trình tự cặp mồi:
Ký hiệu mồi Trình tự
pf GADPH* GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
pr GADPH* GAAGATGGTGATGGGATTTC
pf DDIT3* AAGTGGCTACTGACTACCCTCTCACT
pr DDIT3* AAGCCTTCCCCCTGCGTAT
Chương trình PCR:
Bước 1: 95oC, 5 phút
Bước 2 - 44 chu kỳ nhiệt: 95oC, 30 giây - 60oC, 30 giây - 72oC, 30 giây Bước 3: 72oC, 6 phút
Bước 4: Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy
Giá trị ΔCt và Tom của sản phẩm PCR:
Gene
Ct Sự thay đổi
biểu hiện C24h BT24h
GADPH 24,31± 0,4 24,95 ± 0,8 1,00 ± 0,0 DDIT3 24,25 ± 0,3 22,43 ± 1,2 8,99 ± 3,5
Tom (GADPH) = 83,0oC ± 0,0 Tom (DDIT3) = 80,5oC ± 0,0
Quy trình 05
88 Trình tự cặp mồi:
Ký hiệu mồi Trình tự
pf GADPH* GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
pr GADPH* GAAGATGGTGATGGGATTTC
pr TRIB3* TGCCCTACAGGCACTGAGTA
pr TRIB3* GTCCGAGTGAAAAAGGCGTA
Chương trình PCR:
Bước 1: 95oC, 5 phút
Bước 2 - 44 chu kỳ nhiệt: 95oC, 30 giây - 60oC, 30 giây - 72oC, 30 giây Bước 3: 72oC, 6 phút
Bước 4: Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy
Giá trị ΔCt và Tom của sản phẩm PCR:
Gene
Ct Sự thay đổi
biểu hiện C24h BT24h
GADPH 24,31± 0,4 24,95 ± 0,8 1,00 ± 0,0 TRIB3 37,59 ± 1,3 35,62 ± 1,2 6,14 ± 0,6
Tom (GADPH) = 83,0oC ± 0,0 Tom (TRIB3) = 89,5oC ± 0.0
Quy trình 06 Trình tự cặp mồi:
Ký hiệu mồi Trình tự
pf GADPH* GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
pr GADPH* GAAGATGGTGATGGGATTTC
pf GDF15* CGAAGACTCCAGATTCCGAGAG
pr GDF15* CCAGCCGCACTTCTGGC
Chương trình PCR:
Bước 1: 95oC, 5 phút
Bước 2 - 44 chu kỳ nhiệt: 95oC, 30 giây - 60oC, 30 giây - 72oC, 30 giây Bước 3: 72oC, 6 phút
Bước 4: Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy
89 Giá trị ΔCt và Tom của sản phẩm PCR:
Gene
Ct Sự thay đổi
biểu hiện C24h BT24h
GADPH 24,31± 0,4 24,95 ± 0,8 1,00 ± 0,0 GDF15 32,48 ± 1,3 30,35 ± 1,2 5,16 ± 0,6
Tom (GADPH) = 83,0oC ± 0,0 Tom (GDF15) =87,75 ± 0,75
(8) Đề xuất bảng tiêu chuẩn cơ sở cho BT3 và các vị theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam
TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM HOÀNG BÁ
STT Các chỉ tiêu Mức chất lượng Phương
pháp thử 1 Soi bột Bột dược liệu có màu vàng tươi, các
mảnh sợi có màng dày. Tinh thể Calci oxalat dạng hình lăng trụ.
Mảnh mô mềm có các tế bào màng mỏng, dạng gần tròn. Mảnh bần với các tế bào màng uốn lượn
DĐVN III
2 Độ ẩm Không quá 13% DĐVN III
3 Độ tro toàn phần Không quá 10% DĐVN III 4 Độ tro không tan trong
acid HCl
Không quá 0,5% DĐVN III
5 Định tính:
Phản ứng hóa học
Sắc ký lớp mỏng
Dược liệu phải cho phản ứng của hợp chất alkaloid và của berberin
Dược liệu phải cho sắc ký đồ có các vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với các vết thu được của
TCCS
90
dược liệu đối chiếu (Hoàng bá).
Phát hiện :
- Quan sát dưới ánh sáng thường
- Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm - Phun thuốc thử dragendroff 6 Định lượng Hàm lượng Berberin trong dược
liệu không dưới 1,26 %
TCCS
TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM HOÀNG LIÊN
Stt Các tiêu chí Mức chất lượng Phương pháp
thử 1 Soi bột Bột dược liệu màu vàng nâu. Mảnh
mô mềm hình lục giác, màng mỏng.
Tinh bột tập trung thành từng đám khó nhận diện rõ ràng. Mảnh mô cứng với các tế bào hình chữ nhật, màng dày. Rải rác có các tế bào đá hình chữ nhật. Mảnh bần với các tế bào hình chữ nhật. Sợi tập trung thành từng bó to nhỏ khác nhau.
Mảnh mạch nhỏ có cấu trúc đặc biệt
DĐVN III
2 Độ ẩm Không được quá 13% DĐVN III
3 Định tính:
Phản ứng hóa học
Sắc ký lớp mỏng
Dược liệu phải cho phản ứng của hợp chất alkaloid và của berberin
Dược liệu phải cho sắc ký đồ có các vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với giá trị Rf và
TCCS
91
màu sắc của berberin chuẩn Phát hiện :
- Quan sát dưới ánh sáng thường.
- Đèn UV bước sóng 254nm.
- Đèn UV ở bước sóng 366nm - Có màu cam khi phun thuốc
thử Dragendroff
4 Định lượng Hàm lượng berberin trong dược liệu không dưới 2,25 %
TCCS
TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM HOÀNG CẦM
Stt Các tiêu chí Mức chất lượng Phương
pháp thử 1 Soi bột Bột dược liệu có màu nâu đỏ. Sợi
libe tập trung thành từng bó nằm rải rác. Tế bào đá (thạch bào) dạng hình chữ nhật, thành dày, khoang tế bào hẹp. Mạch nhiều. Nhiều hạt tinh bột.
DĐVN III
2 Độ ẩm Không được quá 15 % DĐVN III
3 Độ tro toàn phần Không được quá 7,0 % DĐVN III 4 Độ tro không tan trong
acid HCl
Không được quá 0,5 % DĐVN III
5 Định tính:
Phản ứng hóa học Dược liệu cho các phản ứng dương tính của hợp chất flavonoid
TCCS
Sắc ký lớp mỏng Dược liệu phải cho sắc ký đồ có các vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với giá trị Rf và
TCCS
92
màu sắc của các vết thu được từ sắc ký đồ của dược liệu đối chiếu (Hoàng cầm).
Phát hiện :
- Quan sát dưới ánh sáng thường.
- Đèn UV bước sóng 254nm.
- Đèn UV ở bước sóng 366nm - Phun thuốc thử FeCl3 5% trong
cồn
6 Định lượng Hàm lượng Baicalin trong dược liệu khoảng 7,7 %
TCCS
TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM BẠCH THƯỢC
STT Các chỉ tiêu Mức chất lượng Phương
pháp thử
1 Soi bột Các mảnh mô mềm, màng
mỏng. Các hạt tinh bột hình tròn, nằm rải rác hay còn tụ lại trong các mảnh mô mềm. Tinh thể calci oxalat tập trung thành từng bó, nối nhau thành dạng chuỗi hay ít nhất cũng thành từng đôi. Mảnh mạch vạch.
DĐVN III
2 Độ ẩm Không quá 12% DĐVN III
3 Độ tro toàn phần Không quá 6,0 % DĐVN III 4 Độ tro không tan trong
acid HCl
Không quá 0,5 % DĐVN III
5 Định tính:
Phản ứng hóa học Dược liệu phải cho phản ứng TCCS
93
dương tính của hợp chất flavonoid
Sắc ký lớp mỏng Dược liệu phải cho sắc ký đồ có các vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với giá trị Rf và màu sắc của các vết thu được từ sắc ký đồ của dược liệu đối chiếu (Bạch thược).
Phát hiện :
- Đèn UV bước sóng 254nm.
- Đèn UV ở bước sóng 366nm
- Phun thuốc thử FeCl3 5%
trong cồn
TCCS
6 Định lượng Hàm lượng flavonoid toàn phần không được dưới 1,28%
TCCS
TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CHI TỬ
Stt Các tiêu chí Mức chất lượng Phương
pháp thử 1 Soi bột Bột dược liệu màu nâu đỏ. Mảnh
mô cứng với các tế bào hình lục giác. Mảnh nội nhũ với các tế bào hình chữ nhật
- DĐVN III
2 Độ ẩm Không được quá 13 % - DĐVN III
3 Độ tro toàn phần Không được quá 6 % - DĐVN III 4 Độ tro không tan trong
acid HCl
Không được quá 0,5 % - DĐVN III
5 Định tính:
94 Phản ứng hóa học
Sắc ký lớp mỏng
Nhỏ 1 giọt acid sulfuric lên cắn dịch chiết nước dược liệu, sẽ xuất hiện màu lục xanh lơ, nhanh chóng chuyển sang màu nâu rồi nâu tía.
Dược liệu phải cho sắc ký đồ có các vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với giá trị Rf và màu sắc của các vết thu được từ sắc ký đồ của dược liệu đối chiếu (Chi tử).
Phát hiện :
- Quan sát dưới ánh sáng thường.
- Đèn UV bước sóng 254nm.
- Phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn 960
- DĐVN III
6 Định lượng Hàm lượng cắn MeOH trong nguyên liệu không được dưới 21,8 %
- TCCS
TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO HOÀNG LIÊN GIẢI ĐỘC THANG
Stt Các tiêu chí Mức chất lượng Phương pháp
thử 1 Cảm quan Sản phẩm có thể chất dạng cao
lỏng, màu nâu, mùi thơm dược liệu.
Cảm quan
2 Độ ẩm ≥ 20% DĐVN III
3 Độ tro toàn phần Không quá 13 % DĐVN III