Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5 Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của rệp sáp mềm nâu Thu thập các pha phát dục của rệp sáp mềm nâu đem về phòng thí nghiệm quan sát dưới kính kính lúp soi nổi. Ghi chép, mô tả các đặc điểm hình thái, màu sắc của các pha phát dục. Đo kích thước cơ thể của các pha phát dục bằng hệ thống kính lúp soi nổi kết nối máy tính, số lượng mẫu đo n = 30.
Giám định loài rệp sáp mềm nâu: GS.TS Phạm Văn Lầm, bằng các tài liệu của Oleg Nicetic, Phạm Văn Lầm và cs. (2008), Williams et al. (1990), Zimmerman (1948) [24], [102], [105].
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp……….. 36
2.5.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của rệp sáp mềm nâu 2.5.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của rệp sáp mềm nâu trong điều kiện
phòng thí nghiệm
Nghiên cứu thời gian phát dục các pha, thời gian vòng đời, thời gian sống của trưởng thành, tỷ lệ gia tăng tự nhiên (r), hệ số nhân của một thế hệ (R0), thời gian của một thế hệ (T, Tc), thời gian tăng đôi số lượng trong quần thể (DT), giới hạn gia tăng tự nhiên (λ) của rệp sáp mềm nâu hại cà phê chè được tiến hành ở điều kiện phòng thí nghiệm theo phương pháp chung trong nghiên cứu đặc điểm sinh vật học côn trùng.
- Chuẩn bị nguồn rệp sáp mềm nâu để nuôi sinh học: thu thập nguồn rệp ngoài đồng ruộng bằng cách cắt cành bánh tẻ dài 20 cm chứa rệp sáp mềm nâu trưởng thành, loại hết các pha ấu trùng và một số cá thể trưởng thành, chỉ để lại mỗi đoạn cành 5 cá thể rệp sáp mềm nâu trưởng thành. Giâm cành chứa rệp sáp mềm nâu trưởng thành trong lớp cát ẩm dày từ 5 đến 7 cm ở khay nhựa. Theo dõi hàng ngày để lấy trứng rệp sáp mềm nâu mới được đẻ làm thí nghiệm.
- Chuẩn bị cây cà phê để nuôi sinh học rệp sáp mềm nâu: thức ăn nuôi sinh học rệp sáp mềm nâu là cây cà phê nhỏ 12 tháng tuổi. Chọn cây cà phê khoẻ đã ươm trong túi polyetylen, rửa phần thân lá bằng nước sạch sau đó rửa lại bằng nước cất. Cho bầu cây vào trong khay nhựa đem cách ly.
- Phương pháp nuôi: Chọn những trứng được đẻ trong 2 giờ của cùng một ngày làm nguồn vật liệu để nuôi nghiên cứu vòng đời và các chỉ tiêu sinh học khác của rệp sáp mềm nâu. Nuôi 2 đợt, đợt 1 năm 2009 ở điều kiện nhiệt độ 300C, ẩm độ 85%, số lượng cá thể nuôi n = 32; đợt 2 năm 2010 ở điều kiện nhiệt độ 250C, ẩm độ 85%, số lượng cá thể nuôi n = 27.
Khi trứng rệp sáp mềm nâu ở thí nghiệm nở, dùng bút lông tách riêng từng ấu trùng để nuôi cá thể. Thức ăn là cây cà phê chè nhỏ sạch được trồng cách ly trong khay nhựa. Quan sát xác lột của ấu trùng để phát hiện thời điểm
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp……….. 37
chuyển tuổi ấu trùng (để xác định số tuổi của chúng) hoặc chuyển pha phát dục từ ấu trùng sang trưởng thành. Quan sát thời điểm trưởng thành đẻ trứng, thời điểm trưởng thành chết để xác định vòng đời và thời gian sống của trưởng thành, tổng tích ôn hữu hiệu (K), nhiệt độ khởi điểm phát dục (t0).
Sau khi trưởng thành rệp sáp mềm nâu đẻ, tách các ấu trùng được đẻ trong cùng một ngày của mỗi cá thể mẹ nuôi riêng cho đến khi thế hệ con hoá trưởng thành để theo dõi các chỉ tiêu sinh học cơ bản như: tỷ lệ tăng tự nhiên (r), thời gian một thế hệ tính theo mẹ (Tc), thời gian một thế hệ tính theo đời con (T), thời gian tăng đôi số lượng trong quần thể (DT), hệ số nhân của một thế hệ (R0), giới hạn tăng tự nhiên (λ).
- Các chỉ tiêu sinh học của rệp sáp mềm nâu và phương pháp xác định + Thời gian phát dục của pha trứng tính từ khi trứng được đẻ ra đến khi trứng nở. Thời gian phát dục của các tuổi ấu trùng (tuổi 1, tuổi 2, tuổi 3) được tính bằng thời gian giữa 2 lần lột xác chuyển tuổi hoặc chuyển pha. Thời gian của vòng đời là khoảng thời gian tính từ khi trứng được đẻ ra đến khi trưởng thành đẻ quả trứng đầu tiên. Thời gian của 1 đời là khoảng thời gian tính từ khi trứng được đẻ ra đến khi trưởng thành chết sinh lý. Thời gian trưởng thành trước đẻ là khoảng thời gian tính từ thời điểm ấu trùng tuổi 3 lột xác hoá trưởng thành đến khi trưởng thành bắt đầu đẻ. Thời gian sống của trưởng thành là khoảng thời gian được tính từ thời điểm ấu trùng tuổi 3 lột xác hoá trưởng thành đến khi trưởng thành chết sinh lý.
+ Tỷ lệ gia tăng tự nhiên r (the instrinsic of natural increase) của rệp sáp mềm nâu là tiềm năng sinh học của chúng. Chỉ tiêu này phụ thuộc tốc độ sinh sản, tốc độ phát triển, tỷ lệ giới tính, tỷ lệ sống tự nhiên. Tỷ lệ gia tăng tự nhiên (r) tính theo (Birch, 1948) [48] trong phương trình sau:
dN
dt = r.N (1)
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp……….. 38
Trong đó: dN là số lượng của quần thể gia tăng trong thời gian dt; N là số lượng của quần thể ban đầu, N = b – d (b: tỷ lệ sinh, d: tỷ lệ chết)
Từ phương trình vi phân (1) có thể viết dưới dạng tích phân:
Nt = N0.e-rt (2)
Trong đó: Nt là số lượng của quần thể ở thời điểm t; N0 là số lượng của quần thể ở thời điểm ban đầu; e là cơ số logarith tự nhiên.
Hay Σ lx.mx.e-rx = 1 (3)
Trong đó: lx là tỷ lệ sống qua các tuổi x, hay lx là xác suất sống sót của các cá thể cái ở tuổi x (tỷ lệ sống thời điểm ban đầu lx0 =100% = 1); mx là sức sinh sản, mx được tính bằng số con cái sống sót trung bình được một cá thể mẹ ở tuối x đẻ ra trong một đơn vị thời gian (tính bằng ngày đối với rệp sáp mềm nâu)
Để dễ tính tỷ lệ gia tăng tự nhiên (r), từ phương trình (3) nhân 2 vế với một trị số không đổi ek, thông thường lấy k từ 5 - 7, trường hợp nuôi rệp sáp mềm nâu lấy k = 7, từ (3) ta có:
Σ lx.mx.e7-rx = e7 = 1096,63 (4)
Xác định giá trị r đúng bằng phương pháp đồ thị thông qua 2 giá trị cận trên và cận dưới của r.
+ Hệ số nhân của một thế hệ R0 (net reproductive rate) là tổng số con cái sinh ra sống sót trong một thế hệ do một mẹ đẻ ra
R0 = Σ lx.mx (5)
+ Thời gian của một thế hệ (generation time) là tuổi trung bình của tất cả các cá thể mẹ khi đẻ ra con cái. Chỉ số này tính bằng các giá trị T và Tc. T tính theo cơ sở của mẹ, Tc tính theo cơ sở con mới sinh (Pielow, 1977;
Nguyễn Văn Đĩnh, 1994) [91], [9].
Σ lx.mx Tc =
R0 (6)
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp……….. 39
T = Σ x.lx.mx.e7-rx (7)
+ Chỉ số giới hạn gia tăng tự nhiên λ (finite rate of natural increase) cho biết số lần quần thể gia tăng về số lượng trong một đơn vị thời gian, tính bằng logarith nghịch cơ số e của r (Laing, 1969) [81]
λ = antiloger (8)
+ Thời gian tăng đôi số lượng trong quần thể DT (doubling time) DT = [ln(2)]: r (9)
+ Nhiệt độ khởi điểm phát dục (t0). Để tìm t0 cần phải nuôi côn trùng ở 2 ngưỡng nhiệt độ khác nhau t1, t2. Kết quả sẽ xác định được thời gian côn trùng hoàn thành được một vòng đời n1, n2. Khi đó nhiệt độ khởi điểm phát dục được tính theo công thức:
n2.t2 – n1.t1 t0 =
n2 – n1 (10)
+ Tổng tích ôn hữu hiệu (K) là lượng nhiệt côn trùng tích luỹ để hoàn thành một vòng đời, K là hằng số (Phạm Bình Quyền) [25].
K = n1(t1 – t0) hoặc K = n2(t2 – t0) (11)
+ Số lứa lý thuyết trong một năm (Y) được tính theo công thức:
Q Y =
K (12)
Q là tổng tích ôn cả năm cho loài rệp sáp mềm nâu Coccus hesperidum L.
Q = 31( tn1 – t0) + 28(tn2 – t0) + … 31(tn12 – t0) (13) Số ngoài ngoặc đơn là số ngày của các tháng 1, 2, …12; tn1, tn2, ….tn3 là nhiệt độ trung bình của các tháng trong năm.
- Phương pháp xác định khả năng đẻ trứng của rệp sáp mềm nâu: thu thập 20 đoạn cành cà phê bánh tẻ dài 20 cm chứa rệp sáp mềm nâu, mỗi đoạn chỉ để lại 1 cá thể trưởng thành. Để dễ quan sát ấu trùng mới đẻ, phía trên và phía dưới của cành cách nơi rệp sáp mềm nâu định vị khoảng 1 cm dán 1 lớp băng
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp……….. 40
dính 2 mặt quanh cành, không để cho ấu trùng mới nở bò khỏi khu vực giới hạn bởi băng dính. Sau đó giâm cành vào cát ẩm trong khay cách ly. Mỗi tháng theo dõi một đợt, số cá thể theo dõi mỗi đợt n = 20. Đếm số ấu trùng mới nở phân tán khỏi cơ thể rệp mẹ và số trứng ung sau khi rệp chết để tính số trứng do rệp sáp mềm nâu mẹ đẻ ra. Theo dõi định kỳ ngày 2 lần vào 7 giờ và 13 giờ.
- Phương pháp xác định tỷ lệ nở của trứng rệp sáp mềm nâu: thu thập trứng rệp sáp mềm nâu vừa mới được đẻ ra (trong khoảng 2 giờ) cho vào 10 đĩa petri có lót giấy thấm, mỗi đĩa thả 20 quả. Nuôi trong tủ định ôn ở điều kiện nhiệt độ 250C, ẩm độ 85%. Theo dõi từ tháng 3/2009 đến tháng 11/2009, mỗi tháng 1 đợt. Theo dõi số lượng trứng nở mỗi ngày. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ trứng nở (%) ở các đợt theo dõi và tỷ lệ trứng nở (%) ở các ngày sau khi trứng được đẻ ra.
2.5.2.2 Điều tra ký chủ của rệp sáp mềm nâu
Tiến hành điều tra phát hiện rệp sáp mềm nâu trên các cây trồng khác như cây ăn quả có múi, xoài, mơ, mận, nhãn, cây cảnh, cây hoa, cây dại, vv…
Số điểm điều tra là 100, mỗi điểm điều tra 1 cây, quan sát kỹ sự có mặt của RSMN trên các bộ phận của cây ăn quả như: chồi, lá, thân, cành, quả vv...
Việc điều tra được tiến hành định kỳ 15 ngày 1 lần, thu thập rệp sáp trên các cây được điều tra về phân loại để xác định có hay không rệp sáp mềm nâu.
Tiến hành lây nhiễm rệp sáp mềm nâu trên các cây để xác định ký chủ.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ % số điểm bắt gặp RSMN trên mỗi loại cây trồng để xác định mức độ phổ biến theo các mức: ít xuất hiện (nhỏ hơn hặc bằng 5%
số điểm bắt gặp), xuất hiện trung bình (lớn hơn 5% đến 25 % số điểm bắt gặp), xuất hiện nhiều (lớn hơn 25% số điểm bắt gặp).
2.5.2.3 Nghiên cứu về phân bố gây hại của rệp sáp mềm nâu trên cà phê chè - Quan sát sự hiện diện của rệp sáp mềm nâu gây hại trên các bộ phận + Trong 3 vườn cà phê chè 3 năm tuổi, cây ở giai đoạn kinh doanh, chọn những cây cà phê bị nhiễm rệp sáp mềm nâu. Quan sát kỹ, đếm các bộ phận của
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp……….. 41
cây cà phê chè (lá, quả, cành, chồi vượt, thân) bị nhiễm rệp sáp mềm nâu.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ các bộ phận trên cây cà phê chè nhiễm RSMN (%).
+ Đếm số lượng rệp sáp mềm nâu các pha phát triển có mặt trên các bộ phận của cây cà phê như: lá, quả, 10 cm đoạn cành bánh tẻ, 10 cm chồi vượt, 10 cm đoạn thân chính, với số mẫu n = 30. Từ đó xác định mật độ rệp sáp mềm nâu cư trú trên các bộ phận của cây.
+ Xác định phân bố của RSMN trên các tầng tán cây
Phân chia tán cây cà phê theo chiều dọc thân chính thành 3 tầng: tầng gốc gồm những cành cà phê mọc trong khoảng 1/3 thân chính tính từ gốc lên;
tầng giữa gồm những cành mọc từ vị trí từ 1/3 đến 2/3 của thân chính tính từ gốc lên; tầng ngọn gồm những cành mọc từ 2/3 thân chính trở lên đến ngọn.
Quan sát sự có mặt của rệp sáp mềm nâu trên cành ở mỗi tầng tán (số cành quan sát mỗi tầng n = 180). Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ cành nhiễm RSMN (%) và chỉ số nhiễm RSMN (%) ở mỗi tầng tán.
+ Xác định phân bố của RSMN trên các vị trí của 1 cành
Đếm số lượng RSMN của 10 cm đoạn cành cà phê bánh tẻ và 10 cm đoạn cành cà phê già (đoạn cành già tính từ vị trí vỏ cành đã hoá bần trở xuống gốc cành, đoạn cành bánh tẻ tính từ vị trí vỏ cành đã hoá bần trở lên phía ngọn cành), số lượng mẫu n = 15. Chỉ tiêu theo dõi: mật độ RSMN trên 10 cm đoạn cành bánh tẻ và đoạn cành già.
Đếm số lượng RSMN cư trú ở mặt trên và mặt dưới của 10 cm đoạn cành, số mẫu theo dõi n =15. Chỉ tiêu theo dõi: mật độ RSMN ở mặt trên và mặt dưới của cành cà phê.
+ Xác định nơi cư trú của RSMN trên cây cà phê trong mùa đông
Quan sát các bộ phận cành, chồi vượt và đếm số lượng RSMN cư trú trên cành và chồi vượt ở các tháng mùa đông. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ cành và chồi vượt nhiễm RSMN (%) và mật độ RSMN cư trú trên 10 cm cành bánh tẻ, chồi vượt.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp……….. 42
2.5.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh thái học của rệp sáp mềm nâu Điều tra biến động số lượng RSMN và các yếu tố sinh thái ảnh hưởng đến biến động số lượng RSMN được tiến hành theo phương pháp của Viện Bảo vệ thực vật (1997) [40] có điều chỉnh cho phù hợp với thực tế.
2.5.3.1 Phương pháp điều tra biến động số lượng rệp sáp mềm nâu trên cà phê chè
- Chọn cố định 7 vườn cà phê đại diện cho vùng nghiên cứu tại xã Hua La, thành phố Sơn La, diện tích mỗi vườn 1 ha; cứ 5 hàng điều tra 1 hàng, 5 cây điều tra 1 cây; quan sát kỹ sự có mặt của rệp sáp mềm nâu trên cây cà phê để xác định tỷ lệ cây cà phê nhiễm RSMN (%).
- Chọn cố định 30 cây cà phê chè 3 năm tuổi nhiễm RSMN. Trên mỗi cây chọn ngẫu nhiên 8 cành phân bố đều ở các hướng, các tầng tán cây; quan sát kỹ các cành cà phê bị nhiễm RSMN, định kỳ 10 ngày điều tra 1 lần. Theo dõi tỷ lệ cành nhiễm RSMN (% ) và chỉ số nhiễm RSMN (%)
Phân cấp cành nhiễm RSMN để tính chỉ số nhiễm theo thang dưới đây:
+ Cấp 0 (không nhiễm): trên cành điều tra không nhiễm rệp sáp mềm nâu.
+ Cấp 1 (nhiễm nhẹ): < 25% diện tích của 10 cm đoạn cành bánh tẻ nhiễm RSMN, chúng phân bố rải rác trên cành.
+ Cấp 2 (nhiễm trung bình): từ 25% - 50% diện tích 10 cm đoạn cành bánh tẻ nhiễm RSMN, các cá thể RSMN phân bố chưa dày đặc trên cành.
+ Cấp 3 (nhiễm nặng): > 50% - 75% diện tích 10 cm đoạn cành bánh tẻ nhiễm RSMN; số lượng RSMN nhiều, phân bố hầu hết trên bề mặt cành.
+ Cấp 4 (nhiễm rất nặng): >75% diện tích của 10 cm đoạn cành bánh tẻ nhiễm RSMN; số lượng rệp RSMN rất cao, phân bố dày đặc trên bề mặt cành.
Chỉ số nhiễm % = [∑ nivi: (N x V)] x 100 (với ni là số cành nhiễm RSMN ở cấp nhiễm thứ i; vi là cấp nhiễm thứ I; N là tổng số cây điều tra; V là cấp nhiễm RSMN cao nhất, V = 4).
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp……….. 43
2.5.3.2 Phương pháp điều tra ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển số lượng quần thể của rệp sáp mềm nâu
- Ảnh hưởng của tuổi cây cà phê đến mức độ nhiễm RSMN: mỗi loại tuổi cây (cây năm thứ 1, năm thứ 2, năm thứ 3, năm thứ 4) chọn 3 vườn cà phê đại diện cho vùng nghiên cứu. Cách tiến hành điều tra xác định tỷ lệ cây nhiễm, tỷ lệ cành nhiễm và chỉ số nhiễm RSMN ở các loại tuổi cây tương tự như điều tra biến động số lượng RSMN ở mục 2.5.3.1. Theo dõi vào các thời điểm tháng 5, tháng 7 và tháng 9 năm 2008.
- Ảnh hưởng của vị trí vườn cà phê so với khu dân cư đến mức độ nhiễm RSMN: mỗi loại vườn cà phê (vườn trồng xung quanh nhà ở và vườn trồng cách biệt hẳn với nhà ở) chọn 3 vườn đại diện. Phương pháp điều tra xác định tỷ lệ cây nhiễm, tỷ lệ cành nhiễm và chỉ số nhiễm RSMN ở các vị trí vườn tương tự như điều tra biến động số lượng RSMN ở mục 2.5.3.1. Theo dõi vào các thời điểm tháng 5, tháng 7 và tháng 9 năm 2008.
- Ảnh hưởng của địa hình trồng cà phê đến mức độ nhiễm RSMN: mỗi loại vườn cà phê trồng trên các địa hình khác nhau (đất bằng, đất dốc, thung lũng) chọn 3 vườn đại diện. Phương pháp điều tra xác định tỷ lệ cây nhiễm, tỷ lệ cành nhiễm và chỉ số nhiễm RSMN của các vườn cà phê trồng trên các địa hình khác nhau tương tự như điều tra biến động số lượng RSMN ở mục 2.5.3.1. Theo dõi vào các thời điểm tháng 5, tháng 7 và tháng 9 năm 2008.
- Ảnh hưởng của hướng phơi vườn cà phê đến mức độ nhiễm RSMN: mỗi loại vườn cà phê trồng ở các hướng phơi khác nhau (sườn Đông, sườn Tây, sườn Nam, sườn Bắc) chọn 3 vườn đại diện. Phương pháp điều tra xác định tỷ lệ cây nhiễm, tỷ lệ cành nhiễm và chỉ số nhiễm RSMN của các vườn cà phê trồng ở các hướng phơi tương tự như điều tra biến động số lượng RSMN ở mục 2.5.3.1.
Theo dõi vào các thời điểm tháng 5, tháng 7 và tháng 9 năm 2008.
- Ảnh hưởng của vị trí trồng cà phê trên đất dốc đến mức độ nhiễm RSMN: mỗi loại vườn cà phê trồng ở vị trí khác nhau trên đất dốc (đỉnh đồi,