1.3. Các nghiên cứu và ứng dụng của kháng sinh Doxorubicin trên toàn thế giới
1.3.3. Thành tựu nghiên cứu
Hiện nay với nền khoa học hiện đại nghiên cứu tạo ra thuốc chống ung thư đã áp dụng các phương pháp sinh tổng hợp, hóa tổng hợp hoặc kết hợp bán tổng hợp tạo ra thư viện dự trữ, tổ hợp lại các hợp chất có hoạt tính chống ung thư. Kết hợp với việc áp dụng công nghệ enzyme, kết hợp các enzyme để sinh tổng hợp kháng sinh tạo ra nhiều dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao hơn, tạo ra thế hệ kháng sinh lai , kháng sinh thế hệ mới bằng phương pháp in vitro và in vivo. Áp dụng các công cụ và các phương pháp nghiên cứu hiện đại như sinh học phân tử, nghiên cứu cấu trúc gene, nghiên cứu tối ưu hóa trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh trên quy mô công nghiệp...
Nghiên cứu nhằm nâng cao năng xuất tổng hợp Doxorubicin bằng các phương pháp hiện đại
Theo nghiên cứu của Sailesh Malla và các cộng sự năm 2010, DXR là nhóm kháng sinh rất độc nên số lượng sinh ra trong tế bào rất ít nếu được tổng hợp theo con đường tự nhiên. Vì vậy quá trình tổng hợp DXR được điều hòa rất nghiêm ngặt bởi cơ chế điều hòa của nhóm gen dnrV, dnrI, afsR và metK1-sp từ Streptomyces peucetius ATCC27952. Với nghiên cứu này nhóm gen điều hòa được chuyển vào vector có chứa promotor mạnh (ermE*) , sau đó chuyển vào tế bào vật chủ để tạo ra chủng tái tổ hợp đã tăng khả năng sinh tổng hợp Doxorubicin cao hơn gấp 3-4,3 lần so với tế bào ban đầu.
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Left
Formatted: Font: 13 pt, (none) Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, (none)
Formatted: Font: 13 pt Formatted: Space Before: 0 pt
Formatted: Indent: Left: 0", Tab stops:
0.39", Left
Trong nhóm gen sinh tổng hợp kháng sinh DXR có chứa gen vận chuyển (glycosyltranferase - dnrS/dnrQ) gắn nhóm đường vào gốc rhonohodine D. Khi hai gen này được chuyển vào vector có chứa promoter mạnh (ermE*) đồng thời chuyển nhóm gen sinh tổng hợp đường khử trong vector này. Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp này hay chủng tái tổ hợp đã có khả năng tăng tổng hợp mạnh DXR hơn. Theo số liệu đã được công bố và phân tích thì lượng DXR được tạo ra cao gấp 5,6 lần so với lượng kháng sinh được tạo ra từ chủng tự nhiên.
Nghiên cứu tạo thế hệ kháng sinh mới từ DXR
Nhóm Miyamoto Y (Nhật Bản năm 2000) đã tạo ra kháng sinh lai thế hệ mới thuộc nhóm anthracyline bằng phương pháp tạo chủng Streptomyces Violaceus tái tổ hợp. Gene dnrK mã hóa cho carminomycin 4-O- metyltransferase. Chủng thuộc nhóm gen sinh tổng hợp DXR được chuyển vào chủng xạ khuẩn Streptomyces Violaceus. Chủng này đã tạo ra kháng sinh anthracyline mới là dẫn xuất của DNR và DXR (4-O-methylepelmycin D).
Cho tới năm 1991 đã có tới 553 dẫn xuất đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng tại NCI [27]. Theo thống kê của Viện Nghiên Cứu Ung Thư của Mỹ (National Cancer Institute - NCI), đã có hơn 2000 dẫn xuất,các hợp chất sinh học thuộc nhóm anthracyline có cấu trúc đồng dạng với kháng sinh trên được tạo ra.
Các nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện trong lên men sinh tổng hợp DXR.
Các nghiên cứu của Hutchinson và cộng sự đã chỉ ra rằng Streptomyces peucetius tổng hợp và tiết DXR ngoại bào ra môi trường nuôi cấy bằng phương pháp lên men chìm đạt hiệu quả cao khi sử dụng nguồn dinh dưỡng với tỷ lệ thích hợp. Tỷ lệ này đã được tối ưu hóa với (gram/lit) nguồn Cacbon là Glucose (60), Sacarose (1000), bột malt (20), nguồn Nito với Cao nấm men (8), nguồn khoáng: NaCl (2), MOPS (15), MgSO4 (0,1), FeSO4.7H2O (0,01), ZnSO4.7H2O (0,01). Với nhiệt độ thích hợp là 28-30oC và thời gian lên men là 4-5 ngày. Với điều kiện trên hiệu xuất thu được là 1,5 miligram/lit dịch lên men thực hiện với chủng tự nhiên.
Formatted: Indent: Left: 0.3", First line:
0.19"
Formatted: Space After: 0 pt
Formatted: Indent: Left: 0.3", First line:
0.19", Space Before: 0 pt, Tab stops: 0.39", Left
Formatted: Indent: Left: 0.3", First line:
0.09"
Theo nghiên cứu của nhóm Sohng (2009), áp dụng phương pháp tái tổ hợp về di truyền, công nghệ chuyển gene và nghiên cứu vai trò của các gene có khả năng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh để tạo ra chủng tái tổ hợp và kết hợp với các điều kiện lên men tối ưu đã được công bố bởi nhóm Hutchinson như nguồn Cacbon, nguồn khoáng, nguồn Nito, chế độ lên men như PH, tấc dộ lắc, thời gian nuôi cấy đã giúp tăng hiệu xuất tổng hợp kháng sinh lên tới 11,5mg/lít.
1.2.5. Ứng dụng cuả Doxorubicin
Kháng sinh DXR và những chế phẩm của nó đã được áp dụng thử nghiệm lâm sàng vào những năm của thập niên 1960. Qua các nghiên cứu thực tiễn đã chỉ ra rằng kháng sinh này có khả năng ức chế sự hoạt động của tế bào. Hiện nay DXR đã được nhiều công ty dược lớn trên thế giới nghiên cứu sản xuất và bào chế thành nhiều dạng thuốc lưu hành trên thị trường với một số tên gọi khác như Adriamycin CS, Adrim, Doxorubicin hidrocloride....
DXR được dùng để điều trị về các bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, và khối u hệ lympho gồm các bệnh như :
• Điều trị ung thư vú, u xương ác tính (sarcom xương) và u xương Ewing, u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả 2 dạng: Hodgin và không Hodgin, ung thư biểu mô tuyến giáp (carcinom tuyến giáp).
• Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn. Khối u đặc biệt của trẻ em như: Sarcom cơ vân (Rhabdomyosarcom), u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp, ung thư cổ tử cung, ung thư âm đạo, ung thư đầu cổ, ung thư dạ dày.
• Thuốc có tác dụng tốt trên một số ung thư hiếm gặp như: đau tủy xương, u màng hoạt dịch, u quái và u nguyên bào võng mạc.
1.2.6. Những nghiên cứu trên thế giới và trong nước về Doxorubicin Trong những năm 1960, một công ty nghiên cứu ở Italia - Farmitalia Research Laboratories, tổ chức này đã thực hiện tìm kiếm các hợp chất chống ung thư từ vi khuẩn đất trên quy mô phòng thí nghiệm. Họ đã tiến hành phân lập từ các mẫu đất xung quanh lâu đài Castel Del Monte bằng sự lỗ lực cố gắng họ đã phát hiện ra một chủng xạ khuẩn. Chủng xạ khuẩn này
Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.3", Tab stops: 0.69", Left
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Heading 2 Formatted: Font: 13 pt, Italic Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Italic
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0"
Formatted: Heading 2, Left, No bullets or numbering
Formatted: Heading 2 Formatted: Font: 13 pt, Italic Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Italic
Formatted: Font: 13 pt, Expanded by 0.2 pt Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0"
đã tạo ra một hợp chất có sắc tố đỏ và có hoạt tính chống lại các khối u ở chuột rất tốt. Chủng xạ khuẩn này chính là Streptomyces peucetius.
Cùng thời gian đó, một nhóm nghiên cứu ở Pháp đã phát hiện ra một hợp chất tương tự cũng có màu sắc đỏ và sau này khi kháng sinh được tách chiết thì đặt tên cho chất màu đỏ này là Daunorubicin. " Daunorubicin " là tên hợp nhất của hai từ Dauni và Rubis (Rubi), Dauni là tên của bộ lạc trước thời kỳ La Mã sinh sống và chiếm đóng vùng đất đã phân lập được chủng xạ khuẩn sản xuất được chất kháng sinh này, còn Rubis là tiếng Pháp mô tả màu sắc.
Năm 1969, Arcamone F cùng với các cộng sự đã tiến hành biến đổi một chủng xạ khuẩn có nguồn gốc từ chủng Streptomyces peucetius bằng cách sử dụng N - nitroso - N- methyl urethane, kết quả là tạo ra một chủng đột biến mới và đặt tên là Streptomyces peucetius phân loài Casius ATCC27952 có khả năng sản xuất ra một kháng sinh cũng có màu đỏ như DNR và họ đặt tên chất này là Adrimycin , sau đó được thay đổi tên thành Doxorubicin (DXR) để phù hợp với quy ước đặt tên của quốc tế.
Trong bài báo cáo khoa học lần thứ 53 của Di Manrco A, Gactani M, Scarpinato B năm 1969 đã chỉ ra rằng DXR có tác dụng chống lại các khối u chuột đặc biệt là u cứng tốt hơn hẳn so với DNR và có chỉ số điều trị cao hơn nhưng tác động phụ tới tim vẫn còn tồn tại.
Nghiên cứu nhằm nâng cao năng xuất tổng hợp Doxorubicin bằng các phương pháp hiện đại
Theo nghiên cứu của Sailesh Malla và các cộng sự năm 2010, DXR là nhóm kháng sinh rất độc nên số lượng sinh ra trong tế bào rất ít nếu được tổng hợp theo con đường tự nhiên. Vì vậy quá trình tổng hợp DXR được điều hòa rất nghiêm ngặt bởi cơ chế điều hòa của nhóm gen dnrV, dnrI, afsR và metK1-sp từ Streptomyces peucetius ATCC27952. Với nghiên cứu này nhóm gen điều hòa được chuyển vào vector có chứa promotor mạnh ( ermE*), sau đó chuyển vào tế bào vật chủ để tạo ra chủng tái tổ hợp đã tăng khả năng sinh tổng hợp Doxorubicin cao hơn gấp 3-4,3 lần so với tế bào ban đầu.
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Heading 2, Left
Formatted: Heading 2, Left, No bullets or numbering, Tab stops: Not at 0.59"
Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0"
Trong nhóm gen sinh tổng hợp kháng sinh DXR có chứa gen vận chuyển (glycosyltranferase - dnrS/dnrQ) gắn nhóm đường vào gốc rhonohodine D. Khi hai gen này được chuyển vào vector có chứa promoter mạnh (ermE*) đồng thời chuyển nhóm gen sinh tổng hợp đường khử trong vector này. Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp này hay chủng tái tổ hợp đã có khả năng tăng tổng hợp mạnh DXR hơn. Theo số liệu đã được công bố và phân tích thì lượng DXR được tạo ra cao gấp 5,6 lần so với lượng kháng sinh được tạo ra từ chủng tự nhiên.
Nghiên cứu tạo thế hệ kháng sinh mới từ DXR
Nhóm Miyamoto Y (Nhật Bản năm 2000) đã tạo ra kháng sinh lai thế hệ mới thuộc nhóm anthracyline bằng phương pháp tạo chủng Streptomyces Violaceus tái tổ hợp. Gene dnrK mã hóa cho carminomycin 4-O-metyltransferase. Chủng thuộc nhóm gen sinh tổng hợp DXR được chuyển vào chủng xạ khuẩn
Streptomyces Violaceus. Chủng này đã tạo ra kháng sinh Anthracyline mới là dẫn xuất của DNR và DXR (4-O-methylepelmycin D).
Cho tới năm 1991 đã có tới 553 dẫn xuất đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng tại NCI [27]. Theo thống kê của Viện Nghiên Cứu Ung Thư của Mỹ (National Cancer Institute - NCI), đã có hơn 2000 dẫn xuất, các hợp chất sinh học thuộc nhóm anthracyline có cấu trúc đồng dạng với kháng sinh trên được tạo ra.
Các nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện trong lên men sinh tổng hợp DXR
Các nghiên cứu của Hutchinson và cộng sự đã chỉ ra rằng Streptomyces Peucetius tổng hợp và tiết DXR ngoại bào ra môi trường nuôi cấy bằng phương pháp lên men chìm đạt hiệu quả cao khi sử dụng nguồn dinh dưỡng với tỷ lệ thích hợp. Tỷ lệ này đã được tối ưu hóa với (gram/lit) nguồn Cacbon là Glucose (60), Sacarose (1000), bột malt (20), nguồn Nito với Cao nấm men (8), nguồn khoáng: NaCl (2), MOPS (15), MgSO4 (0,1), FeSO4.7H2O (0,01), ZnSO4.7H2O (0,01). Với nhiệt độ thích hợp là 28-30oC và thời gian lên men là
Formatted: Heading 2, Left, No bullets or numbering, Tab stops: Not at 0.59"
Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0"
4-5 ngày. Với điều kiện trên hiệu xuất thu được là 1,5 miligram/lit dịch lên men thực hiện với chủng tự nhiên.
Theo nghiên cứu của nhóm Sohng (2009), áp dụng phương pháp tái tổ hợp về di truyền, công nghệ chuyển gene và nghiên cứu vai trò của các gene có khả năng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh để tạo ra chủng tái tổ hợp và kết hợp với các điều kiện lên men tối ưu đã được công bố bởi nhóm Hutchinson như nguồn Cacbon, nguồn khoáng, nguồn Nito, chế độ lên men như pH, tốc dộ lắc, thời gian nuôi cấy đã giúp tăng hiệu xuất tổng hợp kháng sinh lên tới 11,5mg/lít.
1.3.Xạ khuẩn.