PHẦN II:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất, môi trường và thiết bị
Chủng vi sinh vật
E. coli JM109 (Promega, USA.); Streptomyces lividans (Promega); Streptomyces peuceutius ATCC27952 từ phòng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại Học SunMoon Hàn Quốc.
- Thiết kế mồi
Trình tự mồi
Đoạn gen drr C có kích thước là 2301bp. Trên cơ sở trình tự đoạn gen drrC đã được xác định từ ngân hàng gen, tiến hành thiết kế hai cặp mồi đặc hiệu cho gen drrC. Mồi xuôi là drrC1 và mồi ngược là drrC2. Mồi drrC mang trình tự nhận biết của enzyme giới hạn là EcoRI và HindIII.
-Mồi cho tách dòng và biểu hiện drrC.
Primer drrC1: 5’-CGGAATTCTCTTCCGTCAATGTGAGGATGCT-3’
EcoRI
Primer drrC2: 5’-CCCAAGCTTTCAGCGCCGGGCCCGGTGGT-3’
HindIII
Formatted: Font: 13 pt, (none) Formatted: Heading 2, Left Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic
Formatted: English (United States) Formatted: English (United States) Formatted: Indent: Left: 0.64", No bullets or numbering
- Chủng xạ khuẩn streptomyces peucetius tự nhiên được lấy từ phòng sinh học phân tử Trường đại học sebun-Hàn Quốc .
-Chủng vi khuẩn E.coli JM109 là vi khuẩn gram âm ,kị khí tùy tiện và không sinh bào tử.Tế bào E.coli có khả năng sinh sản với tốc độ nhanh trên môi trường nuôi cấy tối thiểu.Trung bình khoảng 20 phút lại phân chia một lần.Chủng vi khuẩn E.coli dễ dàng tiếp nhận và nhaanh lên một cách nhanh chóng về số lượng các plasmid tái tôt hợp chứa gen ngoại lai.
Chủng này sống trong LB và được sử dụng làm vật chủ trong tách dòng gen.
- Xạ khuẩn Streptomyces lividans có từ môi trường tự nhiên trong đất và chúng không gây bệnh nên được sử dụng như vật chủ biểu hiện gen DrrC.Khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh do có chưa promoter biểu hiện mạnh.
Vector và plasmid sử dụng trong đề tài.
Vector là một hay nhiều đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép gắn các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản, không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và không gây biến đổi bộ gen của tế bào chủ.
- Vector pGEM-T
Vector pGEM-T Easy (3015bp) là vectơ tách dòng được thiết kế với nhiều đặc điểm của một vectơ đa chức năng, có khả năng ứng dụng cao trong lĩnh vực công nghệ gen. Đây là vector đã được mở vòng, tại mỗi đầu mút của vòng mở có một base Timin (ddT) tự do. Sản phẩm PCR cuối cùng được tạo thành luôn có gắn với base Adenin (A) nên vector này có khả năng gắn trực tiếp vào với sản phẩm PCR mà không cần có xúc tác của enzyme nối. pGEM-T Easy có chứa sẵn các gene: lacZ, ori, f1- origin, AmpR. Trong đó ori là những gen có chức năng tái bản trong tế bào vi khuẩn, lacZ dùng để nhận biết tế bào đã được chuyển gen hay gọi
Formatted: Heading 3, Left Formatted: Font color: Auto, (none)
Formatted: (none) Formatted: (none)
Formatted: Font: Not Italic, (none) Formatted: (none)
Formatted: Font: Not Italic, (none) Formatted: Font: Not Italic
Formatted: (none)
Formatted: Font: Not Italic, (none) Formatted: Font: Not Italic
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, Font color:
Auto
Formatted: Font color: Auto
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, Font color:
Auto
Formatted: Font: Not Italic Formatted: Font: Not Italic
Formatted: Heading 3, Left, No bullets or numbering
Formatted: Heading 3, Left
Formatted: Heading 3, Left, No bullets or numbering
Formatted: Heading 3, Left
Formatted: Not Superscript/ Subscript
là gen chỉ thị, AmpR có vai trò là gen kháng kháng sinh có tác dụng lựa chọn các tế bào vi sinh vật có mang vector [2].
Hình 1.3: Cấu trúc pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen - Vector biểu hiện pIBR25
Biểu hiện gen của các chủng vi sinh vật thuộc nhóm xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật gram dương vô cùng phức tạp và khó khăn bởi cấu trúc genome của xạ khuẩn có tỷ lệ GC khoảng 70% trở lên [3]. Việc tạo ra một loại vector đặc biệt để chuyển vào tế bào xạ khuẩn đã và đang nghiên cứu bởi rất nhiều nhóm nghiên cứu về xạ khuẩn.
Tuy nhiên cho tới nay chưa có bất kỳ một loại vector biểu hiện đặc biệt nào dùng cho tế bào xạ khuẩn được thương mại hóa. Vì vậy các nhóm khi thực hiên các nghiên cứu về biểu hiện gen của xạ khuẩn thường phải tự thiết kế vector phù hợp để sử dụng cho nghiên cứu của mình.
Nhóm nghiên cứu của Sohng và cộng sự đã sử dụng vector pGEM 7+
và pGEM 3+ làm gốc đồng thời sử dụng trình tự ermE* là một promotor mạnh để thiết kế vector trong các nghiên cứu về genome của các chủng
Formatted: Check spelling and grammar
Formatted: Font: Not Italic
Formatted: Heading 3, Left, No bullets or numbering
Formatted: Heading 3, Left Formatted: (none)
Formatted: (none)
Streptomyces với hy vọng vector này có thể biểu hiện các gen mong muốn ở mức độ cao.
Hình 1.4 Cấu trúc vetcor biểu hiện pIBR25
Về cấu tạo vector pIBR25 có độ dài khoảng 7.5 kb, vector này được thiết kế có chứa gen kháng Ampiclin, vùngpromotor emrE* là một vùng khởi động mạnh nằm phía trước vùng gắn của các enzyme giới hạn (MCSs) hay vùng gắn các gen cần nghiên cứu. Đặc biệt vector này có thể dùng như vector tiếp hợp bởi có vùng SCP2 (conjugation vector). Vùng này có trình tự nhận biết của enzyme Transposase, enzyme này nhận biết trình tự trên genome và có thể chuyển cả vector tiếp hợp gắn vào genome của vi khuẩn [9]. Với thiết kế đặc biệt như vây vector pIBR25 (được cung cấp từ nhóm Sohng và cộng sự) có thể sử dụng vô cùng tiện lợi trong các nghiên cứu chuyển gen bằng tế bào trần hoặc bằng phương pháp tiếp hợp giữa các tế bào vi khuẩn.
2.1.2 Môi trường nuôi cấy Môi trường LB lỏng
Trypton 10g
Formatted: Check spelling and grammar Formatted: Heading 3, Left, Indent: First line:
0", Tab stops: Not at 0.59"
Formatted: Font: Not Italic Formatted: Heading 3
Formatted: Font: Not Italic, (none) Formatted: Font: Bold, Not Italic
Formatted: Heading 3, Left Formatted: (none)
Formatted: Font: Not Italic Formatted: (none)
Cao nấm men 5g
NaCl 10g
Nước cất Vừa đủ 1000ml
Môi trường LB thạch
Trypton 10g
Cao nấm men 5g
NaCl 10g
Agar 20g
Nước cất Vừa đủ 1000ml
Môi trường LB - Kháng sinh
Thành phần tương tự như môi trường LB lỏng, đĩa thạch.
Bổ sung kháng sinh thích hợp theo tỉ lệ như sau:
Mụi trường: Khỏng sinh = 100ml: 100àl Môi trường NDYE
Phần 1 Cao nấm men 5,05g
Glucose 22,5g
Hepes 4,76g
NaNO3 4,28g
MgSO4 0,12g
K2HPO4 0,23g
Phần 2 Trace 2ml
NaOH 10ml
Hấp thanh trùng phần 1 và phần 2 riêng biệt sau đó mới bổ sung phần 2 vào phần 1 theo đúng tỷ lệ đã xác định.
Môi trường NDYE thạch có thành phần tương tự như môi trường NDYE lỏng nhưng bổ sung 2% Agar.
Cách pha dung dịch Trace (Trace element solution):
Thành phần 100ml
Formatted: No bullets or numbering
Formatted: Line spacing: Multiple 1.47 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.47 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.47 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.47 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.47 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.47 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.47 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.47 li
ZnCl2
FeCl2.6H2O CuCl2.2H2O Na2B4O7.10H2O (NH4)6MO7O24.4H2O
0,04g 0,02g 0,01g 0,01g 0,01g
2.1.3 Hóa chất
Bảng 1.1 Hóa chất sử dụng
Các loại đường Saccharose, glucose Việt Nam
Các loại muối NaCl, K2SO4, KH2PO4,
CaCl2.6H2O, MgCl2.6H2O, ZnCl2,FeCl2.6H2O,CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O…..
Hãng MERCK
(Đức).
Các loại cao Cao nấm men, cao malt Hãng HIMEDIA
(Ấn Độ), MERCK (Đức).
Các loại dung môi Methanol, Chloroform, Isopropanol, Ethanol, Ethyl acetate, Acetone
Hãng MERCK ( Đức )
Các loại hóa chất khác Agarose,L-proline, Difco casaminoacid, Glycerol, Tryptone, EDTA, TES, Tris, Guanidine thiocycerol, CH3COOK, Resin, Agar ….