PHẦN II:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4. Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE
2.2 Các phương pháp nghiên cứu
2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi
Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc. Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, không quá 50 (thường 18-25) nucleotide, bắt cặp bổ sung với đầu 5’ hay đầu 3’ của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi ở bên trái tác động trên sợi DNA theo chiều 3’ – 5’ được gọi là mồi xuôi ( forward primer, kí hiệu là F).Mồi ở bên phải tác động trên sợi DNA theo chiều 5’ – 3’ được gọi là mồi ngược (reverse primer, kí hiệu là R).
Việc chọn lựa một mồi có ý nghĩa quan trọng trong khi muốn ứng dụng PCR có hiệu quả và độ chính xác cao. Vì thế, chúng ta phải có một thiết kế chính xác về mồi oligonucleotide. Trình tự mồi được chọn xác định kích thước và vị trí của sản phẩm PCR, cũng như nhiệt độ nóng chảy của vùng được khuếch đại. Mồi được thiết kế đúng có thể giúp chúngtránh tạo ra những sản phẩm PCR không đặc hiệu.
Formatted: Expanded by 0.2 pt
Formatted: Normal, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"
Formatted: Font: Not Italic
Formatted: Heading 3, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"
Nguyên tắc thiết kế mồi:
- Sự hiện diện của G hoặc C trong 5 base cuối ở đầu 3’ giúp tăng khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi.
- Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp nhau, thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 40 ÷ 70 %, trung bình khoảng từ 50 ÷ 60% sẽ cho ta nhiệt độ lai thích hợp.
- Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA.
- Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn.
-
2.2.3 2 Phương pháp PCR Thành phần phản ứng gồm:
DNA khuụn : 0.5 àl Mồi xuụi (10 àM) : 1 àl Mồi ngược (10 àM) : 1 àl DMSO : 0.5àl 2X Master mix (PROMEGA) : 10àl H2O : 7 àl Tổng phản ứng : 20 àl
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR - 950C 940C – 5 phút - 950C 940C – 30 giây
- 640C 600C – 30 giây 25 chu kỳ - 740C 720C – 1,5 phút
- 740C 720C – 10 phút
2.2.4 3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Cách tiến hành:
Formatted: No bullets or numbering
Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Heading 3, Left
Formatted: Font: Not Italic, Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Normal, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.25" + Indent at: 0.5"
Formatted: Font: 14 pt, (none) Formatted: Heading 3, Left
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none)
Formatted: Heading 3, Left Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none)
• Cân 0,3g agarose cho vào 30ml TAE 1X ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và cho vào lò vi sóng 3 phút để làm nóng chảy gel.
• Làm nguội gel xuống 50 – 550C, thờm 2àl ethidium bromide, lắc đều rồi đổ vào khuôn gel đã lắp lược, để thạch dày khoảng 0,75 – 1 cm.
• Khi gel nguội, tháo lược, đặt khuôn gel vào bể điện di và đổ đệm TAE 1X vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5mm.
• Lấy 2àl dung dịch nạp mẫu (loading buffer) cho mỗi mẫu cần điện di, lấy mẫu cần điện di (thể tích tùy thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, lấy toàn bộ dung dịch vừa trộn nạp vào giếng.
• Đậy nắp bể điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 85 – 100V, thời gian 30 phút.
• Sau khi điện di xong, soi gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả 2.2.5 4 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose
Sản phẩm sau khi PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên bản gel agarose 1%. Kết thúc điện di, soi bản gel dưới đèn chiếu tia UV sẽthấy xuất hiện những băng vạch DNA có kích thước khác nhau trên. Dựa vào kích thước của DNA chuẩn có thể chọn được băng DNA đích mong muốn. Vì vậy tiến hành tinh sạch DNA từ bản gel agarose để thu được sản phẩm DNA đích bằng bộ Kit hoặc sử dụng dung dịch Resin và máy hút chân không.
Nguyên tắcCách tiến hành.
•
•
•• Mẫu gel agarose có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào ống Eppendorf 2ml đáy vuông sạch.
•
•
•• Bổ sung 600àl Guanidine thiocynate 6M, lắc đều, làm núng ở 600C để hũa tan hoàn toàn.
••
•• Tiếp đú thờm 600àl dung dịch resin, lắc đều và đưa vào chạy cột binding column với máy hút chân không.
••
•• Cột được rửa hai lần, mỗi lần sử dụng 1 ml cồn lạnh 700, sau đó đem cột ly tâm 10.000 rpm, ở 40C trong 10 phút.
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none)
Formatted: Heading 3, Left Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic
Formatted: (none)
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic
Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold
•
•
•• Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 20àl TE buffer, để 1-2 phỳt rồi đem ly tâm 10.000 rpm trong 10 phút ở 40C, thu dung dịch chứa DNA đã tinh sạch.
2.2.6 5 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn Cách tiến hành
• Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli mang DNA plasmid cần tách chiết trong 3ml môi trường LB lỏng chứa trong ống falcon 15ml có bổ sung kháng sinh thích hợp. Nuôi ở tủ ấm 370C, lắc 200 rpm, thời gian từ 12-16 giờ đến khi OD600 đạt 1-2.
• Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 6000 rpm, 10 phút, 40C. Bỏ dịch nuôi.
• Cho 300àl Solution I, votex cho tế bào tan đều.
• Bổ sung 400àl Solution II, lắc nhẹ nhàng trộn đều dung dịch để thành tế bào tan hết, đến khi dung dịch có màu trong suốt.
• Bổ sung 300àl Solution III, lắc nhẹ nhàng tới khi xuất hiện kết tủa.
• Ly tâm ở 40C, 6000 rpm trong 10 phút. Dùng pipet hút dịch chuyển sang ống eppendorf 2ml đáy vuông sạch, bỏ phần kết tủa.
• Bổ sung 600àl resin, lắc đều.
• Chạy cột binding column, lắp vào máy hút chân không, rửa cột hai lần bằng nước cất đã thanh trùng, mỗi lần dùng 1ml.
• Chuyển dung dịch vào cột, đợi cho dịch chảy hết qua cột thì tiến hành rửa cột.
• Rửa cột hai lần bằng cồn 700 để lạnh. Mỗi lần dùng 1ml cồn.
• Đem cột ly tâm ở 40C, 10.000 rpm, trong 10 phút để loại cồn.
• Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 20àl dung dịch đệm TE, để 1 phỳt.
• Ly tâm 10.000 rpm, 10 phút ở 40C.
• Thu dịch chứa DNA, chạy điện di kiểm tra.
2.2.7 6 Phương pháp chuyển gen vào E. coli bằng sốc nhiệt Phương pháp tạo tế bào khả biến
Các bước chuẩn bị tế bào khả biến bằng phương pháp hóa học sử dụng CaCl2 được tiến hành như sau:
• Tăng sinh cấp một:
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none)
Formatted: Heading 3, Left Formatted: Font: 14 pt, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none)
Formatted: Condensed by 0.3 pt
Formatted: Condensed by 0.3 pt
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Heading 3, Left
Formatted: Font: 14 pt, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none)
-Chủng vi khuẩn được cấy ria trên môi trường LB đặc đã bổ sung kháng sinh phù hợp và nuôi qua đêm ở 370C.
-Lấy 1 khuẩn lạc E. coli vào 3ml môi trường LB lỏng được chứa trong ống falcon 15ml. Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 370C, lắc 200 rpm, thời gian 12-16 giờ.
• Tăng sinh cấp hai:
-Cấy chuyền 500àl dịch nuụi cấy trờn vào 50ml mụi trường LB lỏng trong bình tam giác 250ml đã bổ sung kháng sinh thích hợp.
-Nuôi cấy lắc 200 rpm, 370C cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0,6 – 0,8.
• Tạo tế bào khả biến:
-Chuyển dịch nuôi cấy vào falcon 50ml. Để trong nước đá 5-10 phút.
-Tất cả các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh.
-Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4000 rpm, 10 phút, 40C. Bỏ dịch.
-Hòa tan sinh khối tế bào trong 10-15ml nước cất khử trùng đã được để lạnh.
Ly tâm 4000 rpm, 10 phút, 40C. Loại bỏ dịch.
-Hòa tan sinh khối tế bào trong 10ml dung dịch CaCl2 0,1M 15% glycerol lạnh. Ngâm trong nước đá 5 phút và ly tâm 4000 rpm, 10 phút, 40C. Bỏ dịch.
Hòa tan sinh khối trong 1ml dung dịch CaCl2 0,1M 15% glycerol. Ngâm trong nước đá 30 phút.
-
Phương pháp biến nạp vào tế bào chủ bằng phương pháp sốc nhiệt
• Đặt ống eppendorf chứa tế bào khả biến vào nước đá ngay sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh.
• Bổ sung 2 - 5àl DNA plasmid vào, trộn đều. Giữ trong nước đỏ 30 phỳt.
• Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bể ổn nhiệt 420C trong 60 giây.
• Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào nước đá để 10 phút.
• Cho vào 500 àl mụi trường LB lỏng. Nuụi cấy lắc ở 370C, 200 rpm trong 1 giờ.
Formatted: No bullets or numbering
Formatted: Condensed by 0.3 pt
• Lấy dịch cấy trang trên môi trường LB chứa X-gal, IPTG và kháng sinh thích hợp.
• Nuôi qua đêm ở 370C.
2.2.8 7 Phương pháp nối DNA Quy trình tiến hành
Thành phần của một phản ứng nối DNA như sau:
Vector : 1 àl Insert DNA : 3 àl T4 DNA Ligase : 1 àl 2X Rapid Ligation Buffer : 5 àl Tổng phản ứng : : 10 àl
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều. Phản ứng được ủ qua đêm ở 160C. Tiến hành điện di kiểm tra.
2.2.9 8 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn là những enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả 2 sợi DNA bổ sung tại các vị trí đặc thù.
Thành phần của phản ứng cắt DNA plasmid sử dụng hai enzyme cắt là EcoRI, HindIII cho gen drrC.
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều. Thực hiện phản ứng ở 37oC trong 4giờ. Sản phẩm của phản ứng cắt được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1 %..
Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid sử dụng 2 enzyme EcoRI và HindIII với gen drrC:
Thành phần Lượng phản ứng
DNA plasmid 50 àl
Enzyme HindIII 3 àl
Enzyme EcoRI 3àl
Buffer M 10X 8,5 àl
Formatted: Expanded by 0.2 pt
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none)
Formatted: Heading 3, Left Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic
Formatted: Font: 14 pt, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Heading 3, Left
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, (none) Formatted: Font: 14 pt, Not Italic
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
2.2.109 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans bằng tế bào trần
Phương pháp thực hiện tế bào trần
1. Cho 25 ml môi trường YEME vào bình tam tam giác. Thêm 1 ml bào tử vào, nuôi ở 30°C trong 36 – 40 giờ.
2. Lấy 20 ml dịch nuôi cho vào ly tâm ở 4000 rpm trong 10 phút 3. Loại bỏ dịch nổi
4. Thêm 15 ml 10,3% sucrose, hòa tan tế bào rồi ly tâm ở 4000 rpm / 10 phút, loại dịch
5. Lặp lại bước 4
6. Hòa tan tế bào trong 4 ml lysozyme solution, ủ ở 30°C từ 15 – 60 phút 7. Đảo trộn bằng pipet 3 lần rồi tiếp tục ủ 15 phút
8. Tiếp tục thêm 5 ml P buffer, đảo trộn bằng pipet 3 lần rồi ủ 15 phút . Lặp lại bước 7
9. Lọc tế bào trần bằng vải bông và chuyển sang ống facol 15 10.Ly tâm ở 4000 rmp / 7 phút để lắng tế bào trần xuống 11.Loại bỏ dịch và hòa tan tế bào trần trong 1 ml P buffer
Phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần
1. Ly tâm mẫu tế bào trần bằng máy ly tâm ở 3000 rpm / 7 phút
2. Loại bỏ dịch sau đú lắc nhẹ ống facol để phần dịch xút lại (khoảng 50 àl) rơi xuống các tế bào trần lắng trên thành ống
3. Thờm ADN vào tới 20 àl TE buffer
4. Ngay lập tức thêm 0,5 ml T buffer hoặc 25% PEG (làm từ P buffer), đảo trộn 1 lần bằng pipet
5. Sau đó không quá 3 phút sau khi thêm PEG thì cho 5ml P buffer, ly tâm 6. Loại dịch và nú lắc nhẹ ống facol để phần dịch xút lại (khoảng 50 àl) rơi
xuống các tế bào trần và pha loãng bằng 1 ml P buffer 7. Lấy 0,1 ml dịch đem cấy trên đĩa thạch R2YE và ủ ở 30°C.
Phương pháp thực hiện tế bào trần.
- Cho 1ml dịch nuôi vào trong bình tam giác 250ml nuôi ở 37oC trong vòng từ 36 - 40h.
- Lấy 20ml dịch nuôi tế bào cho vào ly tâm ở 4000rpm/10 phút, loại dịch.
- Thêm 4ml lysozyme và ủ ở 37oC từ 15-60 phút.
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none)
Formatted: Heading 3, Left Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, Not Italic, (none)
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Font: 14 pt, (none), Not Expanded by / Condensed by Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Indent: Left: 0.13", Line spacing:
Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: French (France)
Formatted: French (France), Condensed by 0.3 pt
Formatted: French (France)
- Đảo trộn bằng pipettle 3 lần rồi tiếp tục ủ ở 15 phút.
- Thêm 5ml P buffer, đảo trộn bằng pipettle 3 lần rồi ủ 15 phút.
- Lọc tế bào trần bằng vải bông và chuyển sang ống falcon 15.
- Ly tâm 4000rpm/7 phút để lắng các tế bào xuống.
- Loại bỏ dịch và thu tế bào trần.
Phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần.
- Ly tâm mẫu tế bào trần bằng máy ly tâm ở 3000rpm/7 phút.
- Loại bỏ dịch sau đó lắc nhẹ ống falcon để phần dịch sót lại rơi xuống các tế bào trần lắng trên thành ống.
- Thờm DNA vào tới 20àl TE buffer.
- Ngay lập tức thêm 0,5 ml T buffer hoặc 25% PEG và đảo trộn bằng pipette.
- Đợi gần 3 phút thêm 5ml P buffer và ly tâm.
- Loại bỏ dịch và lắc nhẹ ống falcon để phần dịch sót lại rơi xuống các tế bào trần và pha loãng bằng 1ml P buffer.
- Lấy 0,1 ml dịch cấy trên đĩa thạch R2YE và ử ở 37oC.
Formatted: Heading 1, Left