1.3. Các nghiên cứu và ứng dụng của kháng sinh Doxorubicin trên toàn thế giới
1.3.1. Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên
1.3.1.1 Đặc điểm về xạ khuẩn.
Xạ khuẩn thuộc nhóm Procaryotes, có cấu tạo nhân đơn giản giống như vi khuẩn [4]. Tuy vậy, đa số tế bào xạ khuẩn lại có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh phức tạp và có nhiều màu sắc giống như nấm mốc. Các sợi kết với nhau tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, v.v.... Màu sắc của xạ khuẩn là một đặc điểm phân loại quan trọng. Đường kớnh sợi của xạ khuẩn khoảng từ 0,1 - 0,5 àm. Cú thể phõn biệt được hai loại sợi khác nhau.Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử. Sợi cơ chất là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh. Đây cũng là một đặc điểm phân loại quan trọng [5].
Một số xạ khuẩn không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, loại sợi này làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền. Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường.
Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước bào tử. Trường hợp không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo. Kích thước khuẩn lạc thay đổi tuỳ loài xạ khuẩn và tuỳ điều kiện nuôi cấy. Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ
Formatted: Heading 2 Formatted: Font: 13 pt, Italic Formatted: Heading 2, Left Formatted: Expanded by 0.2 pt
Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0", Line spacing: single, Pattern: Clear
Formatted: Font: 13 pt
(vì thế mà gọi là xạ khuẩn), một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định. Nguyên nhân của hiện tượng vòng tròn đồng tâm là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trưởng, khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng có chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng sát với nó khiến khuẩn ty lại phát triển yếu đi. Cứ thế tạo thành khuẩn lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm [6].
Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử. Bào tử được hình thành trên các nhánh phân hoá từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thước và hình dạng khác nhau. Có loài dài tới 100 - 200 nm, có loài chỉ khoảng 20 - 30 nm. Có loài cấu trúc theo hình lượn sóng, có loài lò xo hay xoắn ốc. Sắp xếp của các cuống sinh bào tử cũng khác nhau. Chúng có thể sắp xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đôi, mọc vòng hoặc từng chùm. Đặc điểm hình dạng của cuống sinh bào tử là một tiêu chuẩn phân loại xạ khuẩn [4].
- Kiểu kết đoạn:
Hạt cromatin trong cuống sinh bào tử được phân chia thành nhiều hạt phân bố đồng đều dọc theo sợi cuống sinh bào tử. Sau đó tế bào chất tập trung bao bọc quang mỗi hạt cromatin gọi là tiền bào tử. Tiền bào tử hình thành màng tạo thành bào tử nằm trng cuống sinh bào tử. Bào tử thường có hình cầu hoặc ôvan, được giải phóng khi màng cuống sinh bào tử bị phân giải hoặc bị tách ra - Kiểu cắt khúc:
Hạt cromatin phân chia phân bố đồng đều dọc theo cuống sinh bào tử. Sau đó giữa các hạt hình thành vách ngăn ngang, mỗi phần đều có tế bào chất. Bào tử hình thành theo kiểu này thường có hình viên trụ hoặc hình que.
Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có thể sinh sản bằng khuẩn ty. Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty.
Thuộc nhóm Procaryotes ngoài xạ khuẩn và vi khuẩn còn có niêm vi khuẩn, xoắn thể, ricketsia và Mycoplasma. Các nhóm này đều có cấu tạo nhân đơn giản. Cấu tạo tế bào và hoạt tính sinh lý có nhiều sai khác. Ví dụ như
Mycoplasma có kích thước rất nhỏ bé so với vi khuẩn, không có màng tế bào, vì thế hình dạng luôn biến đổi. Ricketsia cũng có kích thước nhỏ bé, sống ký sinh bắt buộc v.v... [4].
1.3.1.2 Xạ khuẩn Streptomyces.
Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi thuộc nhánh streptomycetaceae. Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã được mô tả. Giống như hầu hết các Actinobacteria khác, Streptomyces là vi khuẩn Gram dương, có bộ gen với tỉ lệ G,C có phần trăm cao [7]. Vi khuẩn này được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát. Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình chuyển hóa các chất. Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces). Streptomyces thường sống ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng. Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế [4].
Streptomyces và họ hàng của nó đã trở nên phổ biến nhờ vào khả năng sản xuất ra các chế phẩm như:
• Thuốc kháng sinh (antibacterials): streptomycin, erythromycin, tetracyclin, neomycin, chloramphenicol, vancomycin, gentamicin.
• Thuốc kháng nấm: nystatin, amphotericin.
• Thuốc chống ung thư: doxorubicin, bleomycin, mitomycin.
• Ức chế miễn dịch: rapamycin.
• Thuốc diệt cỏ: bialaphos.
Quá trình sinh tổng hợp của các hợp chất này khá khó khăn. Quy định một cách cẩn thận với các quá trình của sự phân lập tế bào, bắt đầu trong việc chuyển đổi sang sợi nấm trên môi trường thạch hoặc trong giai đoạn cuối theo cấp số nhân (trong các môi trường nuôi cấy lỏng).
Formatted: Font: 13 pt, English (United States)
Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Italic Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Italic Formatted: Font: 13 pt
Field Code Changed Formatted: Font: 13 pt
Field Code Changed
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 30oC, pH tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh).
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và động vật nguyên sinh.
1.3.1.3.Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn.
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh.Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn.Một trong những tính chất của các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi chất kháng sinh chỉ có tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định. Hầu hết chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng.Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh, nhưng có hai giả thuyết được ủng hộ hơn cả là [8]:
• Việc tổng hợp chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó.
• Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao của chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là các loài có bào tử. Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định.
Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như Chloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleoside.Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau như
Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0"
Formatted: Heading 2, Left, No bullets or numbering
Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0"
lincomycin, novobiocin. Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất trao đổi bậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor.
1.3.2. Xạ khuẩn Streptomyces peucetius.
Chủng xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500 loài, có tỷ lệ G, C cao (69 ÷ 73%) trong ADN. Một phần rất lớn các chất kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài thuộc chi Streptomyces trong đó được biết đến nhiều nhất là streptomycin, erythromycin và tetracyclin [9].
Streptomyces là chi xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên năm 1943. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh.
Streptomyces peucetius ATCC27952 thuộc chi Streptomyces, là chủng sinh kháng sinh doxorubicin. Khi sinh trưởng trên môi trường NDYE ở nhiệt độ 280C sau 4-5 ngày bắt đầu xuất hiện khuẩn lạc.
Về hình thái xạ khuẩn Streptomyces peucetiusATCC27952 tồn tại ở dạng khuẩn ty. Khi nuôi trên môi trường đĩa thạch hoặc dịch lỏng thì dịch nuôi có nâu đỏ, các tế bào tồn tại dưới dạng sợi mảnh, nhỏ nhưng liên kết với nhau thành từng búi sợi. Mỗi sợi khuẩn ty bao gồm nhiều đốt nhỏ và mỗi đốt nhỏ là một tế bào xạ khuẩn [9].
Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 có khả năng hấp thụ các nguồn cacbohydrat khác nhau. Chúng có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có
Formatted: Font: 13 pt, Bold, Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Heading 2, Left Formatted: Font: 13 pt, Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Heading 2
Formatted: Font: 13 pt, Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Italic Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Italic
Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Heading 2, Left, Indent: First line:
0"
Formatted: Font: 13 pt, Condensed by 0.3 pt
glucose, sacharose và maltose. Tuy nhiên, chủng xạ khuẩn này sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh mạnh nhất là trong môi trường có maltose.
1.3.4. Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24.
Streptomyces lividans TK24 là một loại vi khuẩn đất gram dương, cấu trúc dạng sợi. Với hàm lượng G-C cao nên bộ gen của chúng rất bền.
Streptomyces lividans TK24 có tác dụng phân giải các hợp chất hữu cơ có trong đất. Do môi trường sống tự nhiên của chúng và chúng không gây bệnh nên chúng được sử dụng như máy chủ để trổng hợp và tiết ra protein tương đồng và dị hợp. Các tế bào streptomysces lividans TK24 đã được nghiên cứu để sử dụng trong việc điều khiển hệ gene và điều hòa tăng hiệu xuất sinh tổng hợp kháng sinh, một số chất là tác nhân chống ung thư [10]
Streptomyces lividans TK24 có cấu trúc tuyến tính, và so với streptomyces coelicolor, chúng có cấu trúc chung tương đồng giống hệt nhau ở chuỗi
Cosmid. Các khu vực lõi trung tâm chứa các gen cần thiết, trong khi bên ngoài lõi mang gen có điều kiện thích nghi với DNA của loài ta chuyển gen vào.
Không giống như hầu hết các loài Eubacteria, loài streptomyces thường chứa nhiễm sắc thể tuyến tính và plasmid. Các plasmid tuyến tính là dài 12-1700 kb.
Với các trình tự lặp lại đảo ngược trong các telomere của họ, việc nhân rộng plasmid tuyến tính của strptomyces bắt đầu ở locus nằm ở trung tâm và tiếp tục hai chiều đối với các telomere. Điều này để lại một dải đơn dài khoảng 280 nucleotide. Tuy nhiên, khi các telomere bị xóa, các locus nằm ở trung tâm plasmid tuyến tính của strepmyces lividans TK24 cũng có thể duy trì chế độ khép kín. Do đó các chế độ sao chép và chức năng của streptomyces lividans TK24 khác nhau đã được bảo tồn cao [10].