3.21. Tách dòng gen drrC
3.21.2. Nhân gen drrC bằng phản ứng PCRTách dòng gene drrC bằng vector
Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Centered
Formatted: Font: Not Bold Formatted: Heading 1, Centered Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold Formatted: Heading 3, Left Formatted
Formatted: Normal, Centered Formatted: Font: Not Italic, (none) Formatted: Heading 3, Left Formatted: (none)
Formatted: Font: Not Italic, (none) Formatted: (none)
Formatted: Font: Italic, (none) Formatted: (none)
Formatted: Font: Not Italic Formatted: Font: Not Italic Formatted: (none)
Formatted: Font: 14 pt, Not Italic Formatted: Centered, Indent: First line: 0.5"
Hình 2.3 2 Qui trình tạo vector pGEM-T-drrC
DNA tổng số của xạ khuẩn sau khi tách chiết được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen drrC với cặp mồi đặc hiệu là drrC1 và drrC2. Sau khi đã tách DNA tổng số thành công tiến hành phản ứng PCR để thu nhận đoạn gen drrC.Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi drrC1 và drrC2 và DNA tổng số đã tách được dùng làm khuân mẫu để khuyếch đại gen drrC. Điều kiện để chạy PCR là giai đoạn biến tính ở 940C, giai đoạn gắn mồi ở 600C và giai đoạn kéo dài ở nhiệt độ 720C, chạy PCR 25 chu kỳ, rồi để 4o C.
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện như hình 3.2.
Kết quả điện di thu được 1 băng vạch tương ứng nằm giữa 2 vạch 2,0 kb và 2,5 kb của ADN marker đúng với kích thước gen drrC là 2,3 kb. Vậy ta kết luận việc PCR gen drrC đã thành công.
Và sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện như hình 2.4.3.
Hình 2.3.4 32 Điện di chạy PCR gen drrC
M: 1 kb DNA Ladder; 1,2: Mẫu sản phẩm PCR
Formatted: Font: Not Bold, English (United States)
Formatted: English (United States)
Formatted: Indent: First line: 0.5"
Formatted ... [11]
Formatted ... [12]
Formatted ... [13]
Formatted: Indent: First line: 0"
Formatted ... [14]
Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Space Before: 6 pt Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Centered
Formatted: Font: Not Bold Formatted: Heading 1, Centered
Formatted ... [15]
Formatted: Font: Not Bold, Not Italic Formatted: Font: 7 pt
Formatted: Centered, Space Before: 6 pt Formatted: Font: Italic
Kết quả điện di thu được 1 băng vạch duy nhất tương ứng phía trên vạch 2 kb của DNA marker 1kb ladder đúng với kích thước gen drrC là 2,3 kb. Điều này cho thấy việc PCR gen drrC đã thành công.
3.1.3. Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T-drrC
Hình 3.3 Qui trình tạo vector pGEM-T-drrC
Vector pGEM–T Easy được chọn làm vector tách dòng gen.drrC,đây là một vector đa chức năng có khả năng tái bản rất nhanh..Hơn nữa tại đầu mút vòng mở của vector này có một base Timin(T) tự do mà sản phẩm PCR gen drrC cuối cùng được tạo thành luôn có gắn với base Adenin(A) nên sản phẩm PCR gen drrC có khả năng gắn trực tiếp vào với vector này.Quy trình tạo vector tái tổ hợp mang gen drrC trong vector pGEM T Easy như sau:
Formatted: Font: Italic, Vietnamese (Vietnam) Formatted: Check spelling and grammar Formatted: Heading 3, Left
Formatted: (none), Check spelling and grammar
Formatted: Check spelling and grammar
Formatted: Font: 13 pt, Check spelling and grammar
Formatted: Font: 13 pt, (none), Check spelling and grammar
Formatted: Font: 13 pt, Check spelling and grammar
Formatted: Font: 13 pt, (none), Check spelling and grammar
Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, (none) Formatted: Font: 13 pt, Not Italic, (none) Formatted: (none)
Formatted: Font: Not Italic Formatted: French (France)
Formatted: Font: Italic, French (France) Formatted: French (France)
Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: Font: Not Italic Formatted: French (France) Formatted: Font: Not Italic Formatted: French (France) Formatted: French (France)
Thực hiện phản ứng nối gen drrC vào vector pGEM–T Easy bằng T4 DNA Ligase ủ qua đêm ở 160C. Sau đó tiến hành biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.
coli JM109 bằng phương pháp sốc nhiệt. Sản phẩm được cấy trang trên môi trường LB đĩa thạch có bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 100mg/ml, chất cảm ứng IPTG và chất chỉ thị màu X-Gal rồi đem nuôi ở nhiệt độ 370C trong thời gian 14-16 giờ.
Sau khi nuôi thì sẽ thấy xuất hiện cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Nhặt ngẫu nhiên 2 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh tiến hành Sau khi thực hiện phản ứng PCR sản phẩm được tinh sạch thu đoạn gen drrC, thực hiện phản ứng ligase đoạn gen drrC vào vector pGEM-T Easy. Sản phẩm ligase được chuyển gen vào E.coli JM109. Sau đó nuôi cấy trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh amp(100mg/ml), X-gal và IPTG theo tỉ lệ thích hợp. Nuôi cấy qua đêm từ 16h-20h rồi tiến hành nhặt 2 khuẩn lạc trắng, 1 khuẩn lạc xanh nuôi cấy và tiến hành tách plasmid từ vi khuẩn theo mục 2.2.6. Plamid thu được sẽ được tiến hành chạy điện di kiểm tra trên gel agarose 1% kết quả được thể hiện như hình qui trình tách plasmid và chạy điện di kiểm tra việc chuyển gen vào plasmid pGEM-T .Kết quả như hình32.54. Kết quả cho thấy ở 2 khuẩn lạc trắng xuất hiện 3 băng vạch trong đó băng vạch thứ 2 tương ứng với vạch 5,3 kb của DNA marker là plasmid pGEM-T- drrC bao gồm vector pGEM-T (3 kb) và gen drrC (2,3 kb). Như vậy vậy có thể thể tạm thời kết luận là chuyển gen drrC vào vector biểu hiện pGEM-T thành công.
Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: Font: Not Italic Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: French (France)
Formatted: Indent: First line: 0.39", Space Before: 6 pt
Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: Font: Italic Formatted: Font: Italic
Formatted: Font: 13 pt, Vietnamese Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: French (France) Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: French (France) Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Font: Italic Formatted: Font: Italic Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Font: Italic
M:1 kb DNA Ladder; Mẫu1, 1, 22: Khuẩn lạc trắng; Mẫu 33: Khuẩn lạc xanh.
Hình 23..5 4 Điện di kiểm tra plasmid từ khuẩn lạc
Tiếp theo để kiểm tra độ chính xác của việc tách dòng gen drrC bằng pGEM-T ta tiến hành điện di plasmid pGEM-T-drrC được cắt với 2 enzyme giới hạn là EcoRI và HindIII, ủ ở 37 oC khoảng 3-5 giờ .Chạy điện di kiểm tra trên gel agaroge 1%.Kết quả thu được ở Nhóm nghiên cứu tiến hành cắt kiểm tra plasmid pGEM-T- drrC được cắt với 2 enzyme giới hạn là EcoRI và HindIII, kết quả được chạy điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện ở hình 23.65.
Formatted: Centered
Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold
Formatted: Font: 1 pt, Not Italic, Check spelling and grammar
Formatted: Left, Space Before: 6 pt Formatted: Font: 13 pt
Formatted: Font: 13 pt, Not Italic Formatted: Font: 13 pt
M:1 kb DNA Ladder; Mẫu 1, 2: plasmid pGEM-T-drrC đã cắt.
Hình 23.6 5 Điện di plasmid pGEMm-T-drrC được cắt bằng 2 enzyme EcoRI và HindIII
Từ Kết kết quả điện di thu đượcta thấy 2 băng vạch, băng vạch đầu tương ứng với vạch 3kb của DNA marker đúng với kích thước plasmid pGEM-T (3kb) là 3015bp và vạch sáng thứ 2 tương ứng nằm giữa trên vạch 2kb và 2.5kb của DNA marker đúng với kích thước đoạn gen drrC là 2301bp. Như Do vậy ta có thể kết luận là chuyển gen drrC vào vector pGEM-T thành công.
3.32. .Thiết kế vector biểu hiện pIBR25-drrC trên vi khuẩn E.coli JM 109 Ta sử dụng vector pIBR25 làm vector biểu hiện gen drrC.Tiến hành cắt vector pIBR25 và plasmid pGEM-T-drrC bằng hai enzyme EcoRI và HindIII ở 37oC khoảng 3-5 giờ để tạo ra hai đầu dính tương ứng với gen. Tiến hành cắt lấy băng vạch có gen drrC và băng vạch của vector pIBR25 đem đi tinh sạch thu sản phẩm.
Nhóm nghiên cứu tiến hành cắt plasmid pGEM-T-drrC, vector biểu hiện pIBR25 bằng 2 enzyme giới hạn là EcoRI và HindIII. Tiến hành tinh sạch sản phẩm
Formatted: Centered
Formatted: Centered, No widow/orphan control
Formatted: Font: Not Bold
Formatted: Heading 1, Left, No widow/orphan control
Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold
Formatted: Font: Not Italic, Check spelling and grammar
Formatted: Heading 1, Left, No widow/orphan control
Formatted: No widow/orphan control Formatted
Formatted: Normal, No widow/orphan control Formatted: Font: 13 pt, (none)
Formatted: Heading 2, Left Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, (none) Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, (none) Formatted: Font: 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Not Italic Formatted: Font: 13 pt, Not Italic, (none) Formatted: Font: 13 pt, (none) Formatted: Font: 13 pt, Italic, (none) Formatted: Font: 13 pt, (none) Formatted: List Paragraph Formatted: Font: Not Italic Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Font: Italic, Vietnamese (Vietnam) Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Font: Not Italic, Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Indent: First line: 0.25", Space
cắt từ gel agarose. Sau khi tinh sạch ta thu được sản phẩm là gen drrC và pIBR25 đã cắt . Tiếp theo nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện phản ứng ligase pIBR25 với gen drrC đã được cắt ở trên bằng enzyme T4 DNA ligase để qua đêm (14-16h) ở 16oC với vector biểu hiện pIBR25 để tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC. Biến nạp pIBR25-drrC vào vi khuẩn E. coli JM109, nuôi cấy trên môi trường thạch LB- Amp(100mg/ml), ,có bổ sung hàm lượng IPTG+Xgal thíc hợp thời gian từ 16h- 20h ở 370C ta thu được đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc..
Sau đó nhặt 4 2 khuẩn lạc khuẩn lạc ngẫu nhiên nuôi lỏng qua đêm để tách DNA plasmid. Tiến hành chạy điện di kiểm tra với 1 mẫu plasmid pIBR25 trên gel agaroge 1% kết quả được thể hiện như hình 23.116. Qua hình ảnh điện di (hình 23.76) quan sát thấy các vạch sáng của các plasmid được tách chiết có kích thước khoảng 9,5kb lớn hơn kích thước của pIBR25. Như vậy ta có thể tạm thời kết luận là tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC thành công.
Hình 23.7 6 Chạy điện di vector tái tổ hợp pIBR25-drrC
M:1 kb DNA Ladder ,Mẫu 1,2,3,5: Vector tái tổ hợp pIBR25-drrC , mẫu 43:
pIBR25
Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Font color: Red, Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Vietnamese (Vietnam) Formatted: Vietnamese (Vietnam)
Formatted: Centered
Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold
Formatted: Left
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi drrC1 và drrC2 để kiểm tra plasmid pIBR25-drrC. Sản phẩm được chạy điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện như hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR pIBR25-drrC M:1 kb DNA Ladder, Mẫu 1, 2: Sản phẩm PCR pIBR25-drrC
Kết quả điện di thu được một băng vạch duy nhất tương ứng nằm trên vạch 2kb của DNA marker đúng với kích thước đoạn gen drrC là 2301bp . Vậy ta kết luận là tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC thành công.
Formatted: Left, Indent: First line: 0.5"
Formatted: Font: Italic Formatted: Font: Italic Formatted: Font: Not Italic Formatted: Centered
Formatted: Font: Not Italic
Formatted: Font: Not Italic
Formatted: Normal
Formatted: Font: Italic, Do not check spelling or grammar
Thực hiện phản ứng PCR để kiểm tra plasmid pIBR25-drrC. Sản phẩm được chạy điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện như hình 2.78.
Hình 2.8 7 Kết quả điện di sản phẩm PCR pIBR25-drrC
M:1 kb DNA Ladder, Mẫu 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR pIBR25-drrC
Kết quả điện di thu được một băng vạch duy nhất tương ứng nằm giữa vạch 2kb và 2.5kb của DNA marker đúng với kích thước đoạn gen drrC. Như vậy có thể kết luận là tạo vector tái tổ hợp pIBR25-drrC thành công.